Name: ヒト腸オルガノイドにおける脂質液滴形成の特徴付けと定量化のための蛍光ベースアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学ぶヒト腸オルガノイドにおける脂質液滴形成の蛍光ベース定量化法。生検由来オルガノイドと脂質液滴特異的染色を用いたハイスループットスクリーニングプラットフォームにより、患者特異的薬剤候補の探索や脂質代謝研究に応用可能です。

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LD540を惜しまなく提供してくださったB.Speeに感謝します。この研究は、オランダ科学研究機構(NWO-ZonMW;VIDI 016.146.353) から S.M.

<ol><li>Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+triacylglycerol+synthesis+in+fat+absorption+and+systemic+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism.</a> Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).</li>
<li>Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+glycerolipids.+DGAT+enzymes+and+triacylglycerol+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis.</a> Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).</li>
<li>D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+discoveries+on+absorption+of+dietary+fat%3A+Presence%2C+synthesis%2C+and+metabolism+of+cytoplasmic+lipid+droplets+within+enterocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).</li>
<li>Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+fat+absorption+and+effect+of+sham+feeding+on+postprandial+lipema%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema.</a> Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).</li>
<li>Chitraju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triglyceride+Synthesis+by+DGAT1+Protects+Adipocytes+from+Lipid-Induced+ER+Stress+during+Lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis.</a> Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).</li>
<li>van Rijn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+failure+and+aberrant+lipid+metabolism+in+patients+with+DGAT1+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency.</a> Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).</li>
<li>Haas, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGAT1+mutation+is+linked+to+a+congenital+diarrheal+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).</li>
<li>Gluchowski, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+DGAT1+missense+mutation+associated+with+congenital+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea.</a> Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).</li>
<li>Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+Diarrhea+From+DGAT1+Mutation+Leading+to+Electrolyte+Derangements%2C+Protein-losing+Enteropathy%2C+and+Rickets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).</li>
<li>Stephen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+protein+losing+enteropathy%3A+an+inborn+error+of+lipid+metabolism+due+to+DGAT1+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations.</a> European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).</li>
<li>Schlegel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+deficits+in+apical+transporter+trafficking+associated+with+deficiency+in+diacylglycerol+acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic+%28Copenhagen%2C+Denmark%29%22%5BJournal%5D)">Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).</li>
<li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triacylglycerol+synthesis+enzymes+mediate+lipid+droplet+growth+by+relocalizing+from+the+ER+to+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets.</a> Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Middendorp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+stem+cells+in+the+small+intestine+are+intrinsically+programmed+with+their+location-specific+function%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function.</a> Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids%3A+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55159(2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+multicolor+imaging+of+lipid+droplets+with+a+new+dye%2C+LD540%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540.</a> Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).</li>
<li>Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dgat1+and+Dgat2+regulate+enterocyte+triacylglycerol+distribution+and+alter+proteins+associated+with+cytoplasmic+lipid+droplets+in+response+to+dietary+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

ここでは、オレイン酸をインキュベーションする際にヒト腸内オルガノイドにおけるLD形成を決定するプロトコルを提供する。この方法は、LD特異的蛍光色素LD54018に基づいており、オルガノイド培養内の脂質液滴の総体積の特徴付けおよび定量を可能にする。ヒト腸内臓器培養を確立し維持するための手順は13より前に公表されており、このプロトコルの視覚的ガイドも15まで利用可能である。
このプロトコルの重要なステップは、ヒト腸オルガノイドの培養、およびBSAへのOAの適切な結合である。オルガノイドの培養は、幹細胞集団の維持が機能的Wnt3A-CMに大きく依存するため、培養培地の正しい製剤を必要とする。Wnt3A-CMを自社製にする場合は、約2ヶ月の有効期限のため、高度に標準化されたワークフローと条件付き媒体の月次生産をお勧めします。さらに、連続するWnt3A-CMバッチの1:1混合は、わずかに最適でないバッチがオルガノイドの成長に大きな影響を与えないことを...

脂質は、人間の食事の重要なコンポーネントであり、全身エネルギー貯蔵と代謝に重要な役割を果たしています。摂取すると、食物脂質は膵リパシスによって遊離脂肪酸(FFA)およびモノグリセリド(MG)に分解される。これらの基質は腸上皮の腸細胞によって取り込まれ、そこで最初にモノグリセリドアシルトランスフェラーゼ(MGAT)酵素によってジグリセリド(DG)に再エステル化され、次にジアシルグリセロールによってトリグリセリド(TG)に再エステル化される。アシルトランスフェラーゼ 1 (DGAT1)1.最後に、これらのTGは、リンパ系へのエクスポート用のチロミクロンまたは細胞内貯蔵用の細胞系脂質液滴(LD)のいずれかに統合され、細胞内貯蔵2、3。他の臓器に食物脂質を分配するにはチロミクロンが必要ですが、LDs中の細胞内脂肪貯蔵の重要性は完全には明らかではありません。しかし、腸内で調節機能を果たすように、腸内で調節機能を果たさなければ、食事4の後に脂質をゆっくりと16時間まで循環させることが示されている。さらに、LDは、脂肪分解条件5の間にマウス脂肪細胞のような有毒な脂肪酸濃度から保護することが示されている。
DGAT1タンパク質は、小プスミック網膜(ER)膜上に位置し、腸上皮におけるLD形成において重要な役割を果たしている。DGAT1におけるホモ接合突然変異は、早期発症の重度の下痢および/または嘔吐、低アルブミン血症、および/または(致命的な)脂肪摂取時の腸障害を伴うタンパク質失態性腸障害を引き起こし、ヒトの脂質恒常性におけるDGAT1の重要性を示す。腸上皮6,7,8,9,10.ヒトにおけるDGAT1欠乏症の発生はまれであるため、一次患者由来細胞へのアクセスは乏しい。さらに、腸上皮細胞の長期培養は、通常の生理学を表す腫瘍由来細胞株に限られた延長に限定されてきた。従って、DGAT1媒介性LD形成は、主に線維芽細胞または動物由来細胞株7、10、11、12で研究されている。このように、最近では、DGAT1欠損症患者由来線維芽細胞は、オレイン酸(OA)8による刺激後の健康な対照細胞と比較して、より少ないLDsを蓄積することが示された。
以前は、任意の消化器官から上皮幹細胞を3次元(3D)オルガノイド13の形で培養するプロトコルが確立されていた。これらの腸内オルガノイドは、長期間培養中に保たれ、患者および腸の位置特異的上皮特性14の機能的研究を可能にする。それらは遺伝的およびフェノ典型的に安定しており、保存することができ、長期的な拡張およびバイオバンキング13を可能にする。
我々は最近、LD形成(LDF)アッセイ6においてヒト腸オルガノイドにおいてLD形成を容易に測定できることを実証した。16時間OAにさらされると、オルガノイドは脂質誘発毒性から細胞を保護するためにLDを生成する。OA濃度が高すぎると、カスパーゼ媒介性アポトーシス6によって細胞が死ぬ。LDFアッセイは、DGAT1変異型患者に由来するオルガノイドおよびDGAT1特異的阻害剤6の使用によって示されるDGAT1に大きく依存することが以前に示された。
ここで詳しく説明するLDFアッセイでは、3Dオルガノイドは腸生検から培養され、新しいオルガノイドを容易に形成する単一細胞に破壊によって毎週通過する。LDFアッセイを実行するために、約7,500個のオルガノイド由来単一細胞を24ウェルプレートの各ウェルにめっきされる。オルガノイドは、数日間にわたって形成され、1mM OAで一晩インキュベートし、LD540、イメージングを容易にする蛍光細胞透過性LD特異的色素で染色する。次いで、LD形成は、共焦点顕微鏡、蛍光板リーダー、またはフローサイトメトリーによって定量される。
このLD形成アッセイを96ウェル形式にスケーリングすることにより、このアッセイは、ヒト腸内オルガノイド培養におけるLD形成に影響を与える新規薬物のスクリーニング、または影響を及ぼす(ヒト遺伝的)障害の研究にLD形成のハイスループット分析にも使用できます。LD代謝。

<table><tbody><tr><td>アドバンスド DMEM/F12</td><td>ギブコ</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>B27 サプリメント&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>基底膜マトリックス (マトリゲル)</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td></td></tr><tr><td>DGAT1 阻害剤 (AZD 3988)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4837/10</td><td></td></tr><tr><td>脂肪酸フリー BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>Klinipath</td><td>4078-9001</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin (GlutaMAX, 100x)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>Leica</td><td>SP8X</td><td></td></tr><tr><td>LD540</td><td></td><td></td> 提供:<td>Dr. B. Spee, ユトレヒト大学</td></tr><tr><td>mEGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09_500ug</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-100G</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-500G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin 産生細胞 (HEK293-mNoggin-Fc cells)</td><td></td><td></td><td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td></tr><tr><td>オレイン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1008-5G</td><td></td></tr><tr><td>p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067-25MG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>PBS Ca2+/Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (5,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin 産生細胞 (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells)</td><td>R&D systems</td><td>3710-001-01</td><td></td></tr><tr><td>TC処理された24ウェルプレート</td><td>Greiner-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>TC処理された黒色透明底96ウェルプレート</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)&nbsp;</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (TrypLE Express)</td><td>Life Technologies</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>WNT-3A 産生細胞 (L-Wnt-3A cells)</td><td></td><td></td><td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor)</td><td>Abcam</td><td>ab120129-10</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト腸オルガノイドにおける脂質液滴形成の特徴付けと定量化のための蛍光ベースアッセイ

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

食物脂質は、腸上皮によって遊離脂肪酸(FA)として取り上げられる。これらのFは、リンパへの輸送のためにキロミクロンに、または細胞内貯蔵のための細胞内貯蔵のための細胞内脂質液滴(LD)にパッケージ化される前に、細胞内トリグリセリド(TG)分子に変換されます。LDの形成のための重要なステップは、TG合成の最終ステップにおけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT)の触媒活性である。LDは、有毒な脂質種をバッファーに入れ、異なる細胞タイプの細胞代謝を調節するために重要です。ヒト腸上皮は定期的に高濃度の脂質に直面しているので、LD形成は恒常性を調節することが非常に重要である。ここでは、ヒト腸内オルガノイドにおける最も一般的な不飽和脂肪酸、オレイン酸による刺激時のLD形成(LDF)の特徴付けと定量のための簡単なアッセイについて述べた。LDFアッセイはLD特異的蛍光色素LD540に基づいており、共焦点顕微鏡、蛍光板リーダー、またはフローサイトメトリーによるLDの定量を可能にします。LDFアッセイは、ヒト腸上皮細胞におけるLD形成を特徴付けたり、DGAT1欠乏症などのLD代謝に影響を与えるヒト(遺伝的)障害を研究するために使用することができる。さらに、このアッセイは、腸または他のタイプのオルガノイドにおけるLD形成の欠陥を復元する新規治療化合物を試験するためのハイスループットパイプラインで使用することもできる。

LD形成の適切な分析のために、オルガノイドは、OAおよびその後の染色による刺激の前にあまりにも密に播種されるべきではない。オーバーラップオルガノイドが蛍光を妨げる可能性があるため、これは共焦点およびプレートリーダー読み出しにとって特に重要である。適切なオルガノイド播種密度(図1A)の一例と、オーバーラップオルガノイドを有する培養物を示す(図1B)。OAによるサンプル刺激の変動を最小限に抑えるために、オルガノイドサイズとシード密度は、1回の実験内のサンプル間で同等である必要があります。これは、同じ数の単一のセルをシードアウトすることによって最適です。しかし、特定のオルガノイドラインが一貫して高い再構成効率を示し、したがって一貫して高いオルガノイド数を示す場合、いくつかの調整が必要になる場合があります。
<p class="jove_content" fo:keep-together...

このプロトコルは、脂肪酸による刺激時のヒト腸内オルガノイドにおける脂質液滴(LD)形成の特性評価に関するアッセイについて説明する。このアッセイがLD形成の定量にどのように使用され、LD形成に影響を与える薬剤の高スループットスクリーニングにどのように使用できるかについて議論する。

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

このプロトコルは、ヒト腸器官における脂質滴形成を定量化するいくつかの方法を説明する。これは、脂質滴形成を調節する薬物をテストするためのハイスループットスクリーニングプラットフォームとして使用することができます。我々が記述する方法は、脂質滴特異的な色素と生検由来の腸オルガノイドに基づいています。これにより、脂質液滴形成のための安定した、正確な、生理学的に関連するモデルを提供する。このプロトコルは、例えばDGAT1欠損患者において脂質滴形成を調節する患者特異的新規薬剤候補をスクリーニングするために使用することができる。この脂質滴形成アッセイは、他の細胞型における脂質代謝を研究するために他のタイプのオルガノイド培養物にも適用することができる。アッセイは、オルガノイド培養の密度に大きく依存する。サンプルと実験で一貫したオルガノイド密度を確保するようにしてください。このアッセイの視覚的なデモンストレーションは、オルガノイドがどのように培養されるべきか、そして脂質滴形成の適切な分析を確実にするためにどのように処理されるべきかを示することが重要であるため、非常に重要です。オルガノイドを調製した後、基体膜マトリックスの液滴を乱すことなく培養培地を慎重に吸引する。オルガノイドの最初の井戸に冷たい基底培地の500マイクロリットルを追加します。P1000ピペットを使用して、ピペットを上下に穏やかにして、オルガノイドを含む基質膜マトリックス液滴を破壊する。必要とされる次の同じ培地でこの手順を繰り返しますが、基礎培地の500マイクロリットルあたり2つ以上の井戸を収穫しないでください。低結合1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにオルガノイドを収集し、15〜20秒間ミニ卓上遠心分離機でそれらを回転させます。400マイクロリットルのトリプシンをスパンダウンオルガノイドに加えます。摂氏37度の水浴で5分間インキュベートします。次に、P200ピペットを使用して、細胞の残りの凝集体を破壊するために、懸濁液を上下に穏やかにピペットします。摂氏37度の水浴で5分間インキュベートします。単一の細胞だけが残っている場合は、基底培地の1ミリリットルを追加し、15〜20秒間ミニ卓上遠心分離機の細胞を回転させます。上清を完全に吸引する。P200ピペットを使用して、新鮮なhSI-EMの200マイクロリットルで単一の細胞を再中断し、さらに800マイクロリットルのhSI-EMを追加します。次に、懸濁液のセル数を数え、最終的な細胞密度に必要な細胞の量を計算します。適切な懸濁液の量を取り出し、1マイクロリットル当たり750セルに密度を調整します。2対1の比率で細胞懸濁液に基部膜マトリックスを追加します。気泡を作らないように注意して混ぜ合わせるようにサスペンションを軽くピペット。事前に温めた培養プレートで、プレートに96の井戸がある場合は、プレートに24の井戸または1ウェルあたり1つの5マイクロリットルの液滴がある場合は、ウェルあたり3つの10マイクロリットルの液滴をシードアウトします。プレートを摂氏37度のインキュベーターに入れ、5%の二酸化炭素を10~15分間置き、液滴を固めます。一方、摂氏37度の水浴で適切な量のhSI-EM+Yを事前に温めます。この後、慎重にプレートの各ウェルに事前に温めたhSI-EM + Yを追加します。5%の二酸化炭素で37°Cで細胞をインキュベートします。2~3日後、培地をhSI-EMに交換し、週に2~3回リフレッシュしてください。まず、室温で0.2グラムの液体オレイン酸を量る。培養グレードの無菌PBSを1.5ミリリットル加え、断続的に渦を出すことを確認するために1時間摂氏70度に混合物を加熱します。次に、5.89グラムの脂肪酸を含まないBSAを秤量し、33.9ミリリットルのPBSに溶解する。BSAが完全に溶解するまで摂氏37度で水浴で混合物を温めます。オレイン酸混合物を再び渦液にして、微細な液滴のエマルジョンを作成し、すぐにガラスピペットを使用してBSA溶液に添加する。透明な黄色がかった溶液が残るまで30分間、37°Cで混合物を保ちます。先に説明したようにオルガノイドを通過し、オルガノイド由来の単一細胞を黒いクリアボトム96ウェルプレートに播種する。hSI-EMで培養した6日目に、オレイン酸およびBSAコンジュゲートの1ミリモルを含むhSI-EMで培養培地を交換する。0.1マイクロモルDGAT1阻害剤の有無に37°Cで16〜17時間培養します。この後、基質膜マトリックス液滴を乱さずに培地を吸引する。オルガノイドを4%中性緩衝ホルムアルデヒドの100マイクロリットルを室温で30分間ウェルに加えて固定する。ホルムアルデヒドを優しく取り出し、150マイクロリットルのPBSで慎重に洗浄します。暗闇の中で室温で15分間PBSで025ミリグラム/ミリリットルLD540とDAPIで脂質滴の細胞を染色します。その後、PBSで井戸を慎重に洗います。オルガノイド全体の概要画像には、共焦点蛍光イメージングに適した40倍の主観を使用します。ここに示す励起および放出設定を使用して、DAPIおよびLD540色素の画像に顕微鏡を設定します。十分な Z 軸の解像度を確保するために、ピンホールのサイズを 1 つの風通しの良い単位に設定します。球状オルガノイドの半分を画像化するには、Zスタックを約85マイクロメートルに設定します。適切な画像処理システムを使用して、画像、スタック、Z プロジェクトをクリックして、各オルガノイドの Z スタックを最大投影に変換します。最大投影のしきい値を、BSA 車両制御サンプルに LD540 信号が表示されないレベルに設定するには、[画像]、[調整]、[しきい値] の順にクリックします。これらの設定を使用して、各イメージをしきい値にします。次に、解析、粒子分析関数を使用して、各最大投影の蛍光の総面積を測定します。脂質滴形成の適切な分析のために、オレイン酸とそれに続く染色で刺激する前に、オルガノイドをあまり緻密に播種してはならない。これは、重複するオルガノイドが蛍光を妨げる可能性があるため、共焦点およびプレートリーダーの読み出しにとって特に重要です。オレイン酸の1ミリモルで一晩刺激した後、脂質滴形成は、反転した明視野顕微鏡で可視化することができる。脂質滴の蓄積は透過光を散乱させ、したがってオルガノイドは暗く見えるのに対し、非刺激オルガノイドは半透明の外観を有する。オレイン酸刺激オルガノイドが固定され、染色されると、脂質滴形成は共焦点顕微鏡を用いて可視化することができる。オルガノイドは3D構造であるため、通常の蛍光顕微鏡は焦点外のバックグラウンド信号のために適さないため、共焦点zスタックを使用してオルガノイドのLDFを特徴付けます。共焦点顕微鏡サンプルの定量化は、蛍光性Hoechst信号に正規化された蛍光プレートリーダーを用いて行うこともできます。プレートリーダーアッセイは、未処理のオルガノイドと比較してDGAT1阻害剤で処理されたオルガノイド細胞におけるLD540シグナルの有意な減少を示す。個々の細胞におけるLD形成の定量は、フローサイトメーターを用いて達成することができる。ここに示す格言戦略は、解体ヒト腸オルガノイドの解体に対する戦略である。最終生細胞集団のSSC-AおよびLD540シグナルの代表ヒストグラムは、細胞内脂質滴の形成により脂質滴形成がSSC-Aの増加をもたらすことを示している。また、脂質液滴に保存されている脂質に対するLD540染色、脂質液滴形成の誘導によりシグナルも増加します。したがって、脂質滴形成は、SSC−AおよびLD540の平均蛍光強度のシフトとして測定される。このプロトコルの最も重要なステップは、ヒト腸器官の培養とBSAへのオレイン酸の適切な波形化である。より多くの条件に対応するために、このアッセイは蛍光プレートリーダーを用いて分析することができる。ウェル当たりのオルガノイド数を補正するために、LD540シグナルをDAPI信号に正規化した。この技術により、研究者はオルガノイド系における脂質滴形成を研究し、電子顕微鏡などの様々な分析技術を改善してその発見を検証することができます。

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Medicine

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ヒト腸オルガノイドにおける脂質液滴形成の特徴付けと定量化のための蛍光ベースアッセイ

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