Name: ヒト腸オルガノイドにおける脂質液滴形成の特徴付けと定量化のための蛍光ベースアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学ぶヒト腸オルガノイドにおける脂質液滴形成の蛍光ベース定量化法。生検由来オルガノイドと脂質液滴特異的染色を用いたハイスループットスクリーニングプラットフォームにより、患者特異的薬剤候補の探索や脂質代謝研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LD540を惜しまなく提供してくださったB.Speeに感謝します。この研究は、オランダ科学研究機構(NWO-ZonMW;VIDI 016.146.353) から S.M.

<ol><li>Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+triacylglycerol+synthesis+in+fat+absorption+and+systemic+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism.</a> Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).</li>
<li>Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+glycerolipids.+DGAT+enzymes+and+triacylglycerol+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis.</a> Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).</li>
<li>D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+discoveries+on+absorption+of+dietary+fat%3A+Presence%2C+synthesis%2C+and+metabolism+of+cytoplasmic+lipid+droplets+within+enterocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).</li>
<li>Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+fat+absorption+and+effect+of+sham+feeding+on+postprandial+lipema%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema.</a> Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).</li>
<li>Chitraju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triglyceride+Synthesis+by+DGAT1+Protects+Adipocytes+from+Lipid-Induced+ER+Stress+during+Lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis.</a> Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).</li>
<li>van Rijn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+failure+and+aberrant+lipid+metabolism+in+patients+with+DGAT1+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency.</a> Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).</li>
<li>Haas, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGAT1+mutation+is+linked+to+a+congenital+diarrheal+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).</li>
<li>Gluchowski, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+DGAT1+missense+mutation+associated+with+congenital+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea.</a> Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).</li>
<li>Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+Diarrhea+From+DGAT1+Mutation+Leading+to+Electrolyte+Derangements%2C+Protein-losing+Enteropathy%2C+and+Rickets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).</li>
<li>Stephen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+protein+losing+enteropathy%3A+an+inborn+error+of+lipid+metabolism+due+to+DGAT1+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations.</a> European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).</li>
<li>Schlegel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+deficits+in+apical+transporter+trafficking+associated+with+deficiency+in+diacylglycerol+acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic+%28Copenhagen%2C+Denmark%29%22%5BJournal%5D)">Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).</li>
<li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triacylglycerol+synthesis+enzymes+mediate+lipid+droplet+growth+by+relocalizing+from+the+ER+to+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets.</a> Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Middendorp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+stem+cells+in+the+small+intestine+are+intrinsically+programmed+with+their+location-specific+function%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function.</a> Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids%3A+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55159(2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+multicolor+imaging+of+lipid+droplets+with+a+new+dye%2C+LD540%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540.</a> Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).</li>
<li>Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dgat1+and+Dgat2+regulate+enterocyte+triacylglycerol+distribution+and+alter+proteins+associated+with+cytoplasmic+lipid+droplets+in+response+to+dietary+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

ここでは、オレイン酸をインキュベーションする際にヒト腸内オルガノイドにおけるLD形成を決定するプロトコルを提供する。この方法は、LD特異的蛍光色素LD54018に基づいており、オルガノイド培養内の脂質液滴の総体積の特徴付けおよび定量を可能にする。ヒト腸内臓器培養を確立し維持するための手順は13より前に公表されており、このプロトコルの視覚的ガイドも15まで利用可能である。
このプロトコルの重要なステップは、ヒト腸オルガノイドの培養、およびBSAへのOAの適切な結合である。オルガノイドの培養は、幹細胞集団の維持が機能的Wnt3A-CMに大きく依存するため、培養培地の正しい製剤を必要とする。Wnt3A-CMを自社製にする場合は、約2ヶ月の有効期限のため、高度に標準化されたワークフローと条件付き媒体の月次生産をお勧めします。さらに、連続するWnt3A-CMバッチの1:1混合は、わずかに最適でないバッチがオルガノイドの成長に大きな影響を与えないことを...

脂質は、人間の食事の重要なコンポーネントであり、全身エネルギー貯蔵と代謝に重要な役割を果たしています。摂取すると、食物脂質は膵リパシスによって遊離脂肪酸(FFA)およびモノグリセリド(MG)に分解される。これらの基質は腸上皮の腸細胞によって取り込まれ、そこで最初にモノグリセリドアシルトランスフェラーゼ(MGAT)酵素によってジグリセリド(DG)に再エステル化され、次にジアシルグリセロールによってトリグリセリド(TG)に再エステル化される。アシルトランスフェラーゼ 1 (DGAT1)1.最後に、これらのTGは、リンパ系へのエクスポート用のチロミクロンまたは細胞内貯蔵用の細胞系脂質液滴(LD)のいずれかに統合され、細胞内貯蔵2、3。他の臓器に食物脂質を分配するにはチロミクロンが必要ですが、LDs中の細胞内脂肪貯蔵の重要性は完全には明らかではありません。しかし、腸内で調節機能を果たすように、腸内で調節機能を果たさなければ、食事4の後に脂質をゆっくりと16時間まで循環させることが示されている。さらに、LDは、脂肪分解条件5の間にマウス脂肪細胞のような有毒な脂肪酸濃度から保護することが示されている。
DGAT1タンパク質は、小プスミック網膜(ER)膜上に位置し、腸上皮におけるLD形成において重要な役割を果たしている。DGAT1におけるホモ接合突然変異は、早期発症の重度の下痢および/または嘔吐、低アルブミン血症、および/または(致命的な)脂肪摂取時の腸障害を伴うタンパク質失態性腸障害を引き起こし、ヒトの脂質恒常性におけるDGAT1の重要性を示す。腸上皮6,7,8,9,10.ヒトにおけるDGAT1欠乏症の発生はまれであるため、一次患者由来細胞へのアクセスは乏しい。さらに、腸上皮細胞の長期培養は、通常の生理学を表す腫瘍由来細胞株に限られた延長に限定されてきた。従って、DGAT1媒介性LD形成は、主に線維芽細胞または動物由来細胞株7、10、11、12で研究されている。このように、最近では、DGAT1欠損症患者由来線維芽細胞は、オレイン酸(OA)8による刺激後の健康な対照細胞と比較して、より少ないLDsを蓄積することが示された。
以前は、任意の消化器官から上皮幹細胞を3次元(3D)オルガノイド13の形で培養するプロトコルが確立されていた。これらの腸内オルガノイドは、長期間培養中に保たれ、患者および腸の位置特異的上皮特性14の機能的研究を可能にする。それらは遺伝的およびフェノ典型的に安定しており、保存することができ、長期的な拡張およびバイオバンキング13を可能にする。
我々は最近、LD形成(LDF)アッセイ6においてヒト腸オルガノイドにおいてLD形成を容易に測定できることを実証した。16時間OAにさらされると、オルガノイドは脂質誘発毒性から細胞を保護するためにLDを生成する。OA濃度が高すぎると、カスパーゼ媒介性アポトーシス6によって細胞が死ぬ。LDFアッセイは、DGAT1変異型患者に由来するオルガノイドおよびDGAT1特異的阻害剤6の使用によって示されるDGAT1に大きく依存することが以前に示された。
ここで詳しく説明するLDFアッセイでは、3Dオルガノイドは腸生検から培養され、新しいオルガノイドを容易に形成する単一細胞に破壊によって毎週通過する。LDFアッセイを実行するために、約7,500個のオルガノイド由来単一細胞を24ウェルプレートの各ウェルにめっきされる。オルガノイドは、数日間にわたって形成され、1mM OAで一晩インキュベートし、LD540、イメージングを容易にする蛍光細胞透過性LD特異的色素で染色する。次いで、LD形成は、共焦点顕微鏡、蛍光板リーダー、またはフローサイトメトリーによって定量される。
このLD形成アッセイを96ウェル形式にスケーリングすることにより、このアッセイは、ヒト腸内オルガノイド培養におけるLD形成に影響を与える新規薬物のスクリーニング、または影響を及ぼす(ヒト遺伝的)障害の研究にLD形成のハイスループット分析にも使用できます。LD代謝。

<table><tbody><tr><td>アドバンスド DMEM/F12</td><td>ギブコ</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>B27 サプリメント&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>基底膜マトリックス (マトリゲル)</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td></td></tr><tr><td>DGAT1 阻害剤 (AZD 3988)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4837/10</td><td></td></tr><tr><td>脂肪酸フリー BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>Klinipath</td><td>4078-9001</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin (GlutaMAX, 100x)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>Leica</td><td>SP8X</td><td></td></tr><tr><td>LD540</td><td></td><td></td> 提供:<td>Dr. B. Spee, ユトレヒト大学</td></tr><tr><td>mEGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09_500ug</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-100G</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-500G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin 産生細胞 (HEK293-mNoggin-Fc cells)</td><td></td><td></td><td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td></tr><tr><td>オレイン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1008-5G</td><td></td></tr><tr><td>p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067-25MG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>PBS Ca2+/Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (5,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin 産生細胞 (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells)</td><td>R&D systems</td><td>3710-001-01</td><td></td></tr><tr><td>TC処理された24ウェルプレート</td><td>Greiner-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>TC処理された黒色透明底96ウェルプレート</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)&nbsp;</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (TrypLE Express)</td><td>Life Technologies</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>WNT-3A 産生細胞 (L-Wnt-3A cells)</td><td></td><td></td><td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor)</td><td>Abcam</td><td>ab120129-10</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト腸オルガノイドにおける脂質液滴形成の特徴付けと定量化のための蛍光ベースアッセイ

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

食物脂質は、腸上皮によって遊離脂肪酸(FA)として取り上げられる。これらのFは、リンパへの輸送のためにキロミクロンに、または細胞内貯蔵のための細胞内貯蔵のための細胞内脂質液滴(LD)にパッケージ化される前に、細胞内トリグリセリド(TG)分子に変換されます。LDの形成のための重要なステップは、TG合成の最終ステップにおけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT)の触媒活性である。LDは、有毒な脂質種をバッファーに入れ、異なる細胞タイプの細胞代謝を調節するために重要です。ヒト腸上皮は定期的に高濃度の脂質に直面しているので、LD形成は恒常性を調節することが非常に重要である。ここでは、ヒト腸内オルガノイドにおける最も一般的な不飽和脂肪酸、オレイン酸による刺激時のLD形成(LDF)の特徴付けと定量のための簡単なアッセイについて述べた。LDFアッセイはLD特異的蛍光色素LD540に基づいており、共焦点顕微鏡、蛍光板リーダー、またはフローサイトメトリーによるLDの定量を可能にします。LDFアッセイは、ヒト腸上皮細胞におけるLD形成を特徴付けたり、DGAT1欠乏症などのLD代謝に影響を与えるヒト(遺伝的)障害を研究するために使用することができる。さらに、このアッセイは、腸または他のタイプのオルガノイドにおけるLD形成の欠陥を復元する新規治療化合物を試験するためのハイスループットパイプラインで使用することもできる。

LD形成の適切な分析のために、オルガノイドは、OAおよびその後の染色による刺激の前にあまりにも密に播種されるべきではない。オーバーラップオルガノイドが蛍光を妨げる可能性があるため、これは共焦点およびプレートリーダー読み出しにとって特に重要である。適切なオルガノイド播種密度(図1A)の一例と、オーバーラップオルガノイドを有する培養物を示す(図1B)。OAによるサンプル刺激の変動を最小限に抑えるために、オルガノイドサイズとシード密度は、1回の実験内のサンプル間で同等である必要があります。これは、同じ数の単一のセルをシードアウトすることによって最適です。しかし、特定のオルガノイドラインが一貫して高い再構成効率を示し、したがって一貫して高いオルガノイド数を示す場合、いくつかの調整が必要になる場合があります。
<p class="jove_content" fo:keep-together...

このプロトコルは、脂肪酸による刺激時のヒト腸内オルガノイドにおける脂質液滴(LD)形成の特性評価に関するアッセイについて説明する。このアッセイがLD形成の定量にどのように使用され、LD形成に影響を与える薬剤の高スループットスクリーニングにどのように使用できるかについて議論する。

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

このプロトコルは、ヒト腸器官における脂質滴形成を定量化するいくつかの方法を説明する。これは、脂質滴形成を調節する薬物をテストするためのハイスループットスクリーニングプラットフォームとして使用することができます。我々が記述する方法は、脂質滴特異的な色素と生検由来の腸オルガノイドに基づいています。これにより、脂質液滴形成のための安定した、正確な、生理学的に関連するモデルを提供する。このプロトコルは、例えばDGAT1欠損患者において脂質滴形成を調節する患者特異的新規薬剤候補をスクリーニングするために使用することができる。この脂質滴形成アッセイは、他の細胞型における脂質代謝を研究するために他のタイプのオルガノイド培養物にも適用することができる。アッセイは、オルガノイド培養の密度に大きく依存する。サンプルと実験で一貫したオルガノイド密度を確保するようにしてください。このアッセイの視覚的なデモンストレーションは、オルガノイドがどのように培養されるべきか、そして脂質滴形成の適切な分析を確実にするためにどのように処理されるべきかを示することが重要であるため、非常に重要です。オルガノイドを調製した後、基体膜マトリックスの液滴を乱すことなく培養培地を慎重に吸引する。オルガノイドの最初の井戸に冷たい基底培地の500マイクロリットルを追加します。P1000ピペットを使用して、ピペットを上下に穏やかにして、オルガノイドを含む基質膜マトリックス液滴を破壊する。必要とされる次の同じ培地でこの手順を繰り返しますが、基礎培地の500マイクロリットルあたり2つ以上の井戸を収穫しないでください。低結合1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにオルガノイドを収集し、15〜20秒間ミニ卓上遠心分離機でそれらを回転させます。400マイクロリットルのトリプシンをスパンダウンオルガノイドに加えます。摂氏37度の水浴で5分間インキュベートします。次に、P200ピペットを使用して、細胞の残りの凝集体を破壊するために、懸濁液を上下に穏やかにピペットします。摂氏37度の水浴で5分間インキュベートします。単一の細胞だけが残っている場合は、基底培地の1ミリリットルを追加し、15〜20秒間ミニ卓上遠心分離機の細胞を回転させます。上清を完全に吸引する。P200ピペットを使用して、新鮮なhSI-EMの200マイクロリットルで単一の細胞を再中断し、さらに800マイクロリットルのhSI-EMを追加します。次に、懸濁液のセル数を数え、最終的な細胞密度に必要な細胞の量を計算します。適切な懸濁液の量を取り出し、1マイクロリットル当たり750セルに密度を調整します。2対1の比率で細胞懸濁液に基部膜マトリックスを追加します。気泡を作らないように注意して混ぜ合わせるようにサスペンションを軽くピペット。事前に温めた培養プレートで、プレートに9

a-fluorescence-based-assay-for-characterization-quantification-lipid

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

このビデオは、GFP発現トランスジェニックマウスから得られた3D腸オルガノイドのROSレベルを定量化するフローサイトメトリーアッセイを示しています。この方法は、ROS産生に対する試験化合物の有効性を調査するためのin...

酸化ストレスを定量化するためのフローサイトメトリーアッセイ:蛍光プローブを使用して腸管オルガノイドの活性酸素種を定量するアッセイ

このプロトコルは、蛍光顕微鏡を用いたヒトの腸オルガノイドのリアルタイム次の薬理学的治療における上皮バリア透過性の測定について説明し、細胞顕微鏡検査をライブします。...

人間の腸 Organoids 上皮関門の透過性のリアルタイム計測

このプロトコルは、リポソームの作製と、蛍光顕微鏡を用いて表面上に固定化し、個々に画像化する方法について説明します。これにより、集団の単一リポソーム間のサイズおよび組成不均一性の定量が可能になる。...

個々のリポソーム間の組成不均一性を検出するための定量的蛍光顕微鏡ベースの単一リポソームアッセイ

ここでは、小腸オルガノイドのバリア完全性を定量化する手法について説明する。この方法が生きているオルガノイドに基づいているという事実は、時間分解された方法で物質またはその組み合わせを調節する異なるバリア完全性の逐次的な調査を可能にする。...

生きているオルガノイドにおける腸のバリア破壊の調査

ここでは、肝臓組織における脂肪滴の特性評価に最適化されたBODIPY...

肝脂肪症評価のための3D再構成による蛍光染色された脂肪滴の分析

本研究では、無傷の筋肉体積による筋肉内脂肪組織(IMAT)沈着を視覚化および定量化するための脱細胞化ベースの方法論、およびIMATを構成する個々の脂肪細胞の指標を定量化する方法について説明します。...

脱細胞化による骨格筋脂肪浸潤の定量化

脂肪食は、脂肪滴の分解を伴うオートファジーの選択的な形態です。このプロセスの機能不全は、がんの発症に関連しています。しかし、その正確なメカニズムはまだ完全には解明されていません。このプロトコルでは、オートファジー、脂質代謝、およびがんの進行の相互作用をよりよく理解するための定量的イメージングアプローチについて説明します。...

脂肪食法による脂質飛沫異化作用の制御の探索

低コヒーレンスホロトモグラフィーを使用したオルガノイドの高解像度、ラベルフリー、3次元イメージングのための段階的なプロトコルを提示します。このプロトコルは、オルガノイド培養の調製、画像取得、および計算画像解析を詳細に説明し、生きたオルガノイドの構造ダイナミクスと薬物応答のリアルタイムの視覚化を可能にします。...

低コヒーレンスホロトモグラフィーによる腸管オルガノイドのラベルフリー、高解像度3Dイメージングおよび機械学習解析

このプロトコルにより、同期肝腫細胞を用いて有糸分裂中の脂質滴および細胞小器官の動態を再現可能にします。...

肝腫瘍細胞における有糸分裂中の脂質滴および細胞小器官の動態を視覚化する蛍光ベースの方法

私たちは、犬の後肢の筋肉の強さと繰り返しエキセントリック収縮に対する筋肉の反応を測定するために低侵襲かつ無痛の方法を説明します。...

ビボ犬筋肉の機能アッセイに

学ぶヒト腸オルガノイドにおける脂質液滴形成の蛍光ベース定量化法。生検由来オルガノイドと脂質液滴特異的染色を用いたハイスループットスクリーニングプラットフォームにより、患者特異的薬剤候補の探索や脂質代謝研究に応用可能です。

ヒト腸オルガノイドにおける脂質液滴形成の特徴付けと定量化のための蛍光ベースアッセイ

さらに動画を探す