Name: マウスアイへの生物学的製剤の送達のためのカプセル化された細胞技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 学ぶアルジン酸マイクロカプセルを用いた細胞封入技術により、マウス眼への生物学的製剤の長期的かつ標的送達を実現する方法。免疫反応を最小限に抑えながら治療効果を持続させ、眼疾患や心疾患などへの応用が期待されます。

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この研究は、国立衛生研究所(R01EY019320)、退役軍人省(RX000444およびBX003050)、サウスカロライナ州スマートステート基金によってB.R.に授与された助成金によって部分的に支持されました。

すべての実験は、眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVO声明に従って行われ、サウスカロライナ医科大学動物ケアおよび使用委員会によってプロトコルID00399の下で承認されました。
1. 細胞培養
<ol><li>ヒト網膜色素上皮細胞(ARPE-19)細胞株を生成し、公表されたプロトコル14,15,15に従って選択した遺伝子を安定的に発現させる。</li>
	<li>10%のウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベックコの修飾イーグル培地(DMEM)の細胞を維持する。</li>
	<li>細胞を37°Cおよび5%CO2でインキュ2ベートする。</li>
	<li>2~3日ごとに培地を交換してください。</li>
	<li>標準的な組織培養手順を使用して、70%〜80%の合流に達した後に細胞を通過させる。</li>
</ol>2. 細胞カプセル化
<ol><li>アルギン酸ナトリウムと脱イオン(DI)水を混合し、2%w/vの最終濃度を、0.2 μmの滅菌シリンジフィルターで濾過して精製します。</li>
	<li>トリプシン化、遠心分離、および10 mM HEPES緩衝生理的な生理液(pH=7.4)で洗浄することにより、アルギン酸溶液と混合する細胞を調製する。ヘモサイトメーターを使用して、細胞を数え、最終的な細胞濃度をアルギン酸溶液中の1 x106に調整する。 注:カプセル化プロセスは、殺菌されたフードの内部で実行する必要があります。</li>
	<li>3 mLシリンジにアルギン酸と細胞混合物の約300μLのアリコートをロードし、シリンジポンプに取り付けます。溶液は、30G鈍い先端針を通して、注射器先端の下の無菌50 mAkerビーカーに入れられた無菌ゲル化浴場に送り込み、針を浴び噴霧する距離にする。</li>
	<li>ゲル化浴には、100mMの塩化カルシウム(CaCl2)および0.5%w/vポリL-オルニチン(PLO)を含む10mM HEPES緩衝生理食塩水の40mLの体積が含まれています。PLOは、研究者のニーズに応じて省略または変更することができる二次ポリマーコーティングです。</li>
	<li>電圧と流量を調整し、60mm/hの流量でカプセル化プロセス中に一定に保ち、マイクロカプセルサイズを約150μmに保つため、6.0kV初期電圧を維持します。</li>
	<li>高電圧発生器針先端のアノードワイヤ(赤)のクリップを針に接続し、地面クリップ(黒)をゲル化槽に中途半端に沈んでいる銅線に接続します。アルギン酸+細胞混合物の1バッチ(1mL)は、カプセル化された細胞(約25,000マイクロカプセル)を調製するのに約30分かかります。</li>
	<li>細胞を含む形成されたマイクロカプセルを洗浄液(10 mM HEPES緩衝生理食物2、pH=7.4)で2回洗浄する。2洗濯にはPBSを使用しないでください。</li>
	<li>カプセル化した細胞を、37°Cおよび5%CO2で加湿インキュベーターに10%FBS補充DMEM培地でインキュベー2トする。 注:カプセル化プロセスの計測器を図 1に示します。</li>
</ol>カプセル化が細胞の生存率に影響を及ぼさないという確認
<ol><li>培地中に24時間カプセル化した細胞をインキュベートした後、500μL(〜30マイクロカプセル)の小さなサンプルを調製して染色します。</li>
	<li>洗浄液(1.5 mM CaCl2を含む10 mM HEPES緩衝生理食居)を使用してマイクロカプセル2xを洗浄し、生死性のアッセイキットを使用して生死生存可能に染色します。</li>
	<li>2 μMと4 μMの最終濃度で、カルセインAM(アセトキシメチル)とエチジウムホモジマー-1の染色混合物をそれぞれ調製します。</li>
	<li>カプセル化した細胞に染色混合物2 mLを加え、室温(RT)で暗闇の中で30〜45分間インキュベートします。</li>
	<li>慎重な吸引で、染色液を吸引し、マイクロカプセル2倍を洗浄液で洗浄する。蛍光顕微鏡システムを使用して、カプセル化された細胞を観察し、画像化します。 注:カプセル化のドキュメントを図 2に示します。</li>
</ol>4. カプセルが生物学的製剤の送達および送達に適したサイズであることを確認する
<ol><li>マウスアイのビトリアル内注射は、通常、2.5 μL ハミルトンシリンジに取り付けられた27G鈍チップ針(内径210 μm)で行われます。</li>
	<li>100~200μmのカプセルを生成し、無血清培地で希釈し、慎重にハミルトン注射器に引き上げます。PBSは、適当な車両ではないが、アルギン酸カプセルがPBSに溶解する。</li>
	<li>カプセルを含む1μLの滴を顕微鏡スライドにゆっくりと排出し、直立した明視野顕微鏡を使用してその完全性を決定します。</li>
	<li>電圧と流量を適宜調整して、カプセルサイズ(ステップ2.3を参照)を調整します。小さいマイクロカプセルは、電圧を増加させ、流量をわずかに減少させることによって非線形の方法で生成される8.私たちの手では、直径150μmのカプセルが最も適していることが判明しました。カプセルサイズの調整は、他のパラメータを変更しながらアルギン酸濃度を一定に保つことにも依存する。</li>
	<li>血清フリー培地中の適切なサイズのカプセル内の細胞の別々のセットを維持し、所望の生物学的製剤の分泌量を決定する。上清中の生物学的製剤の濃度を決定するために敏感なELISAまたはウェスタンブロッティングを使用してください。</li>
	<li>治療の既知のPK/PD(薬物動態/薬力学)に基づいて注入する必要があるカプセルの必要量を決定する。私たちの手の中で, 10 マウスの目あたりカプセルが最も効果的であることが判明しました。.</li>
</ol>5. マウスの炎へのカプセル配信
<ol><li>解剖顕微鏡を用いて、細胞内注射を行う。手順中に使用される外科用セットアップおよび材料については図 3を参照してください。リトラリトラ注射の詳細なプロトコルは、他の場所で見つけることができます 16.</li>
	<li>キシラジンおよびケタミン(20mg/kgおよび80mg/kg)または特定の施設の動物ケアおよび使用委員会によって承認された他の好ましい麻酔薬の腹腔内注射によってマウスを麻酔する。つま先ピンチ17を使用して麻酔の適切な深さを確認します。</li>
	<li>マウスの瞳孔をフェニレフリンHCL(2.5%)で拡張するとアトロピン硫酸 (1%)の膜室の良好な可視性を可能にし、手順の間に水分補給それらを保つために目に潤滑剤の目のゲルを適用する。</li>
	<li>ガイド穴として26G針を持つ手足の切り身を穿刺し、1)針が目とテーブルと45°の角度であることを確認し、2)ベベリング先端がレンズを穿刺しないように上向きに向けます。</li>
	<li>目視検査の下で45°の角度でハミルトン注射器に取り付けられた27G鈍チップ針を使用してカプセルを慎重に注入し、針でレンズに触れないようにしてください。レンズの損傷は白内障形成につながる。カプセルは、解剖顕微鏡を使用して、膜内で見える必要があります (図4A)。</li>
	<li>針の引き込み後、デキサメタゾンオフサルミック抗生物質軟膏に加えて、抗生物質軟膏ネオマイシンおよびポリマイシンB硫酸塩で注射部位を治療する。</li>
	<li>ギョニオテールヒプロメロース脱乳眼液を塗布(2.5%)両方の目に角膜が回復期間中に乾燥するのを防ぐために。</li>
	<li>37°Cの加熱パッドにマウスを置き、完全に目が覚まるまで監視します。</li>
	<li>カプセル化されたARPE-19細胞の注入に成功すれば、光コメレン断層撮影または他の方法で眼を撮像する際に、わずかな量の破片を有するマウスの膜子房内に無傷のカプセルが存在することを明らかにするべきである(図4B)。</li>
	<li>注射されたマウスの眼は、手術による数日間の回復の後、手元の実験的パラダイムの準備が整いました。 注:眼の中のカプセルの外科用セットアップおよびドキュメンテーションは、それぞれ図3および図4に示されている。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。

この細胞カプセル化技術は比較的迅速かつ容易に実行できます。ただし、特定のポイントは、正確な下流の結果を得るために心に留める必要があります。細胞は、カプセル化する前にペトリ皿の培養中に維持され、適切な合流で保持されるべきである。カプセル化は、可能であれば、規制された空気の流れと適切な換気フードで行われるべきです。空気の流れが強すぎると、特に長期実験においてカプセル形成に影響を与える可能性があります。滅菌器具および溶液は、カプセル内の細胞の長期維持のために重要である。
現在、生死染色は、カプセル内の細胞の生存率を決定するための確認ツールとして使用されています。カプセル1個当たりの細胞数と現在の条件下(すなわち、通常は1カプセル当たり12〜20細胞)も視覚的に決定されます。カプセル化されたセルバッチの各バッチの実行可能性は、このメソッドによって監視されます。細胞の生存率をさらに決定するために、封入された細胞が溶解し、再培養される。これはさらにカプセル内の細胞の生存率および完全性を示し、成功した細胞カプセル化を検証する。
細胞カプセル...

細胞ベースの治療法は、医学に広く適用されている革命的な生物学的技術を表しています。最近では、神経変性疾患、眼疾患、がんの治療に応用に成功しています。細胞療法は、細胞置換から薬物送達まで幅広い分野をカバーしており、このプロトコルは後者に焦点を当てています。生分解性アルギン酸マイクロカプセル(MC)は、送達系としての有効性を示しており、生物医学分野で広く使用されつつある。アルギン酸は、その単純なゲル化プロセス、生分解性、優れた生体適合性、および生体内,条件1、2、3、42の下での1安定性によるマイクロカプセル化に使用されてきた。3,4
エレクトロスプレー法は、マイクロカプセル化技術として、アルギン酸(塩基高分子)およびポリ-lオルニチン(二次被覆ポリマー)を用いてペプチドおよびタンパク質をカプセル化するために有効に利用されている。両方のポリマーは自然に発見され、その生体適合性55、6、76,のために使用されます。しかし、細胞ベースの治療法における主な課題は、免疫抑制薬によって引き起こされる副作用を避けるために宿主免疫系の抑制である。アルギン酸マイクロカプセルの透過性は、細胞カプセル化に適した性質と考えられており、宿主免疫応答88、9、109からそれらをマスキングしながら、細胞への栄養素、廃棄物、および治療因子の細胞への注入を10可能にする。
眼では、封入された細胞は、網膜色素変性症または加齢黄斑変性症の治療のために、生物学的製剤(すなわち、成長因子11、12および12成長因子アンタゴニスト13)の一定の送達のための臨床試験で使用されてきた。補体阻害剤14などの他の標的も現在、前臨床設定で検討されている。

<table><tbody><tr><td>3 mLシリンジ</td><td>BD</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>30 G 1 "鈍い針</td><td>SAI注入技術</td><td>B30-100</td><td></td></tr><tr><td>アルギン酸ナトリウム塩、褐藻</td>シ<td>グマ</td><td>A0682</td><td></td></tr><tr><td>アトロピン硫酸眼液(1%)</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-215-15</td><td>瞳孔拡張用</td></tr><tr><td>BD 1 mLシリンジ26 G x 3/8(0.45 mm x 10 mm)</td><td>ベクトン、ディキンソン、会社</td><td>DG518105 500029609 REF 309625</td><td>、ガイドホールを生成する</td></tr><tr><td>塩化カルシウム、無水、粒状</td><td>シグマ</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>ジェンティール ティアーズ</td><td>アルコン</td><td>NDC 0078-0429-47</td><td>麻酔中に目を滑らかにする</td></tr><tr><td>ゴニオテール: ヒプロメロース (2.5%) 眼炎用粘液 (滅菌)</td> <td>アルタイル ファーマシューティカルズ インク</td><td>NDC 59390-182-13</td><td>麻酔中に目を滑らかにする</td></tr><tr><td>ハミルトン ニードル/シリンジ ヒント: 27 G、スモール ハブ RN NDL、カスタム長 (12 mm)、ポイント スタイル 3、カプセル</td><td>の硝子体内送達用</td>6/PK <td>ハミルトン</td><td>7803-01</td></tr> ハ<tr><td>ミルトン シリンジ: 2.5 & マイクロ;L、モデル62 RN SYR、NDL 別売り</td><td>カプセルの硝子体内送達用</td><td>ハミルトン</td><td>7632-01</td></tr><tr><td>HEPESバッファー、1 M</td><td>フィッシャー バイオ試薬</td><td>BP299100</td><td></td></tr><tr><td>高電圧発生器</td><td>ESD EMC テクノロジー</td><td>ES813-D20</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 生存能力/細胞毒性キット</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>L-オルニチン塩酸塩、99%</td><td>アルファAesar</td><td>A12111ネオ</td><td></td></tr><tr><td>マイシンおよびポリミキシンB硫酸塩およびデキサメタゾン眼炎軟膏</td><td>SANDOZ</td><td>NDC 61314-631-36</td><td>硝子体内注射後の感染を防ぐための抗生物質</td></tr><tr><td>フェノールフリン塩酸塩眼炎溶液(2.5%)</td><td>瞳孔拡張用</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-201-15</td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>滅菌注射器フィルター、0.2 &mu;m</td><td>VWR</td><td>28143-312</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>GRASEBY</td><td>MS16A</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスアイへの生物学的製剤の送達のためのカプセル化された細胞技術

Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

眼の後極の疾患の開発中の多くの現在の治療法は、生物学的製剤である。これらの薬物は頻繁に投与される必要があります, 典型的には、細胞内注射を介して.選択した生物学的製剤を発現するカプセル化細胞は、局所的なタンパク質産生および放出(例えば、長期薬物送達を介して)のためのツールになりつつある。また、カプセル化システムは、細胞への栄養素、廃棄物、および治療因子の拡散を可能にする透過性物質を利用します。これは、宿主免疫応答から細胞をマスキングする際に起こり、宿主免疫系の抑制の必要性を回避する。このプロトコルは、マイクロカプセル化法と結合したマイクロカプセル化におけるポリマーとしてのアルギン酸塩の使用をマイクロカプセル化技術として説明する。ARPE-19細胞は、ヒトRPE細胞株の自然発生により、その生涯機能により長期細胞療法実験に用いられており、ここではカプセルをカプセル化し、マウスの目に送達するために使用されています。この原稿は、細胞マイクロカプセル化、品質管理、および眼の送達のためのステップを要約する。

ARPE-19細胞は、眼にカプセルを移植した際のカプセル化および長期生存に適性であることが示されている、自然消滅ヒトRPE細胞株である。アルギン酸カプセル化のツールを図 1に示します。本研究では、アルギン酸塩に封入した際に、アルギン酸カプセル内の細胞を明視野イメージングにより確認したことが実証された(図2A)。カプセル内の細胞に対して生死性アッセイを行い、90%の生存率ポストカプセル化を実証した(図2B)。カプセル内の細胞の長期生存率を確保するために、カプセルをクエン酸ナトリウムに溶解し、次いで細胞を再めっきした(図2C)。安定したトランスフェクトARPE-19細胞が望まれていた生物学的製剤を発現し分泌したことを独立実験で確認した後、細胞を安全に封入するためのパラメータを確立した後、眼内注射用にカプセルを製造した。
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ここで提示されるは、齧歯類の目への生物学的製剤の長期配信のための不死化細胞のマイクロカプセル化におけるポリマーとしてのアルギン酸塩の使用のためのプロトコルである。

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...

この技術は、薬物、タンパク質、細胞などのコンテンツを組織や動物の特定の場所に配信する信頼できる方法です。配信を追跡し、目的の実験に合わせてコンテンツのリリースを調整できます。創傷治癒から眼疾患および心疾患まで多くの疾患を治療するために使用することができる。この方法の主な利点は、免疫反応を引き起こすことなく、標的部位にアルギン酸マイクロカプセルを使用して治療細胞を送達し、より長い期間、新しい分泌された治療薬の持続的な送達を維持する能力である。原稿の指示に従って、レチナル上皮細胞を培養することから始めます。それらは標準的な組織培養手順を使用して70〜80%の合流に達したときに細胞を通過させる。細胞をカプセル化するには、アルギン酸ナトリウムと脱イオン水を混合して2%重量の最終濃度で体積を計り、0.2マイクロメートルの滅菌シリンジフィルターで濾過して混合物を精製します。トリプシン化、遠心分離、10ミリモルHEPES緩衝生理液で細胞を洗浄する。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、最終的な細胞濃度をアルギン酸溶液1ミリリットル当たり100万に調整します。アルギン酸と細胞混合物の300マイクロリットルのアリコートを3ミリリットルシリンジにロードし、シリンジポンプに取り付けます。原稿の指示に従ってゲル化浴を準備し、7ミリメートルの針で注射器の先端の下の無菌50ミリリットルビーカーに入れ、噴霧距離を浴びる。電圧を8キロボルト、流量を1時間あたり30ミリメートルに調整し、約150マイクロメートルのマイクロカプセルを製造します。黒いグラウンド クリップを、ゲル化槽に中途半端に沈んだ銅線に接続し、赤いアノード ワイヤのクリップを針に接続します。アルギン酸と細胞混合物の各1ミリリットルバッチからカプセル化された細胞を調製するのに約30分かかります。形成されたら、マイクロカプセルを洗浄液で2回洗浄し、摂氏37度と5%CO2の加湿インキュベーターで10%FBS補充DMEM培地でインキュベートします。24時間インキュベーションした後、マイクロカプセルの500マイクロリットルサンプルを洗浄液で2回洗浄して染色します。生存率のためにそれらを染色するためにLIVE / DEADアッセイキットを使用してください。マイクロカプセルのサイズを適切に調整するには、無血清培地で希釈します。慎重に2.5マイクロリットルハミルトン注射器でそれらを吸引します。ゆっくりと顕微鏡スライドに1マイクロリットルの滴を排出し、直立したブライトフィールド顕微鏡を使用してマイクロカプセルの完全性を決定します。適切に麻酔をかけられるマウスでは、眼の潤滑剤を塗布して眼の水分を維持し、26ゲージ3/8インチのベベリングシリンジ針を使用して、手足のすぐ下に最初の目の穿刺を確立します。レンズの穿光を避けるために、斜めの先端を上に保つ45度の角度で鼻方向から目に近づくことを確認してください。次に、針先全体がガイド穴の生成のために目に挿入されていることを確認しますが、遠くに移動しすぎないように注意し、経時的な経時的な残量を穿刺してください。これが完了したら、ゆっくりと針を引っ込みます。マイクロマニピュレーター内に、カプセル溶液で満たされた27ゲージの鈍い先端2.5マイクロリットルハミルトン注射器を置き、最初のガイドホールで針を並べます。動物の頭を安定した位置に保持し、意図的に針を目に向かって操縦します。正しい針の位置を確認するために、針先がレンズの後ろに視覚化されるまで注射器を挿入します。その後、カプセル溶液を25~30秒間ゆっくりと注入します。そして、完成したら、目の損傷を最小限に抑えるために、鈍い先端の注射器を徐々に引き込む。必要に応じて、原稿の方向に応じて電圧と流量を調整してカプセルサイズを調整します。アルギン酸中の細胞のカプセル化はブライトフィールドイメージングで確認され、LIVE/DEADアッセイは細胞の90%が封入後に生存していることを示した。細胞の長期生存率は、カプセルをクエン酸ナトリウムに溶解し、再めっきすることによって保証された。ビトリア内注射は、膜内のカプセルの可視化を可能にする目視検査の下で行われた。この手順を試みる場合、PBSが形成したアルギン酸マイクロカプセルを溶解するので、いかなる洗浄工程にもPBSを使用しないでください。その開発後、私たちの研究室は心不全や高血圧の形態を治療するためのデリバリーシステムとして使用されます。この技術は、異なる心血管疾患および神経疾患の将来の治療のための有望なツールと考えられています。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

メソッドは、マウスにヒトの網膜芽細胞腫の腫瘍を伝播するために記述されています。腫瘍細胞は、直接免疫欠損マウスの眼に注入されています。二次腫瘍が正常に直接ヒト腫瘍および培養tumorspheresから採取した細胞の両方を使用して確立されている。...

免疫不全マウスにおけるヒト網膜芽細胞腫の腫瘍の確立と伝播

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

ゲインまたは機能研究の損失のいずれかを実行する目的のためのマウス網膜細胞へのプラスミドDNAの取り込みのための方法...

開発マウス網膜の in vivoエレクトロポレーションで

この手術法は、マウスの眼の網膜下腔への遺伝子治療用ベクターと幹細胞の注入を示しています。...

マウスの眼の中に遺伝子治療ベクターと幹細胞の網膜下注入

このビデオでは、細菌性眼内炎(眼の硝子体腔への細菌の侵入に起因する眼内感染)を模倣するマウスモデルを、細菌懸濁液を眼に注入することで生成する方法を説明しています。このマウスモデルは、疾患のメカニズムを研究し、その治療法を評価するのに役立ちます。...

細菌性眼内膜炎マウスモデル:マウスの眼への細菌懸濁液の硝子体内注入による細菌性眼内炎の作製法

このビデオは、マウスの脳への抗体送達のための対流増強送達(CED)技術を示しています。麻酔をかけたマウスの頭蓋骨を露出させ、抗体送達のための標的領域にバリ穴をあけます。抗体を含むステップカテーテルを標的部位に挿入し、輸液ポンプを介して圧力勾配を作成し、制御された速度で抗体を送達します。...

マウス脳への抗体の対流増強送達

網膜下注射は、マウスの眼の網膜色素上皮に効果的な遺伝子送達を行うための外科的技術です。...

マウス網膜色素上皮における遺伝子治療用ウイルスベクターの縁アプローチ、網膜下注射

網膜への遺伝子治療薬の配達をお手伝いし、その地域の範囲を評価する視細胞活力を特徴付ける高分解能スペクトル領域光干渉断層法 (HR-SD-OCT)...

超高解像度マウス光コヒーレンストモグラフィー網膜遺伝子治療研究における眼内注入を支援するために

ここでは細菌性内膜炎のマウスモデルにおけるビトリアル内注射とその後の細菌定量の方法について説明する。このプロトコルは、宿主の免疫応答および細菌および宿主遺伝子発現を測定するために拡張することができる。...

細菌性内眼炎マウスモデルにおけるウイルス感染の注入と感染量の定量

我々は、結膜下注射後の眼のリポソームの時空間分布を非侵襲的に研究するための光ファイバー共焦点レーザー微小内視鏡検査(CLM)の使用のためのプロトコルを提示する。...

光ファイバー共焦点レーザー微小内視鏡検査を用いた眼内ドラッグデリバリーシステムの時空間的イン ビボ イメージング

我々は、凍結保存後のヒトES細胞由来の光受容体前駆細胞の調製と、 rd10...

rd10マウスにおけるヒト胚性幹細胞由来光受容体前駆細胞の網膜下送達

学ぶアルジン酸マイクロカプセルを用いた細胞封入技術により、マウス眼への生物学的製剤の長期的かつ標的送達を実現する方法。免疫反応を最小限に抑えながら治療効果を持続させ、眼疾患や心疾患などへの応用が期待されます。

マウスアイへの生物学的製剤の送達のためのカプセル化された細胞技術

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