Name: 単純ヘルペスウイルス1型にオートファジーを調節するsiRNAエレクトロポレーション 1-感染単球由来樹状細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学ぶ単純ヘルペスウイルス1型感染樹状細胞におけるオートファジー調節法。siRNAエレクトロポレーションと阻害剤を比較し、より特異的な標的制御を実現する手法を解説します。

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この研究は、ASに授与されたプロジェクトSTE 432/11-1を通じてドイツ研究評議会(DFG)によって支援され、LGに付与されたプロジェクト18-12-21-1を介して医学部(フリードリヒ・アレクサンダー・ユニバーシテット・エアランゲン・ニュルンベルク)からELANプログラムによって支援されました。

単球由来DCは、健康なドナーの白血球化産物から生成された。このため、地方倫理委員会から肯定的な投票が得られた(参照番号4556)。本研究の実験は、「フリードリヒ・アレクサンダー・ユニバーシテット・エアランゲン=ニュルンベルク」の倫理委員会の勧告に従って行われた(参考番号4556)。すべての寄付者は、ヘルシンキ宣言に従って、書面によるインフォームド・コンセントを承認しました。
1. 未熟樹状細胞(iDC)及び成熟樹状細胞(mDC)の生成と取り扱い
<ol><li>ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、前述の27のように白血縮系チャンバ(LRSC)から単離する。PBMCの凍結保存を避け、分離時に直接使用して、より高いDC収率を得ます。</li>
	<li>前述の10、27に記載のT175細胞培養フラスコにおける異なる健康ドナーのPBMCからヒトDCを生成する。簡単に言えば、30mLのDC培地(L-グルタミンを含まないRPMI 1640、1%(v/v)AB-血清、100 U/mLペニシリン、100mg/mLストレプトマイシン、0.4 mM L-グルタミン、10mM HEPES)細胞を単細胞の浸着細胞1株当たりに使用する。1時間後、RPMI 1640を用いて非付着画分を洗い流す。800 U/mL GM-CSFおよび250 U/mL IL-4を補充した新鮮なDC培地を加え、3日間インキュベートする。<ol>
<li>3日目のポスト付着で、GM-CSFとIL-4を含む新鮮なDC培地を5mL追加し、それぞれ400 U/mL、細胞培養フラスコあたり250 U/mLの最終濃度をDC分化にします。</li>
		<li>iDCを収穫するには、細胞培養フラスコの底部から緩やかに接着したiDCを軽く洗い、4日目に付着した後にすすすします。この手順を 2 回繰り返します。mDCの生成には、GM-CSF(最終濃度:40 U/mL)、IL-4(最終濃度:250 U/mL)、IL-6(最終濃度:1000 U/mL)、IL-1β(最終濃度:200U/mL)、TNF-α(最終濃度:10ng/)で構成される成熟カクテルを追加します。mL)、プロスタグランジンE2(PGE2;最終濃度:1μg/mL)。</li>
		<li>6日後の付着後(サイトカインカクテルを用いた成熟誘導の2日後)、細胞培養フラスコの底部からmDCをリンスする。この手順を 2 回繰り返します。 注:未熟なDCと成熟したDCは、1細胞培養フラスコ内の同一のドナーから順次生成することができる。これを行うには、(i)iDCの適切な数を分離し、(ii)ステップ1.2.2に記載されたサイトカインカクテルを使用してフラスコ内の残りの細胞の成熟を誘導する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>それぞれの細胞培養培地のiDCまたはmDCを50mLチューブに移します。300 x gで5分間遠心分離を介して細胞を収穫します。<ol>
<li>細胞培養フラスコあたり5~10 mLのRPMI 1640でDCを穏やかに再サスペンド(=洗浄)します。それぞれのDCサスペンションを1本のチューブに組み合わせます。</li>
		<li>棚卸室または別の方法を使用してセル番号を定義します。iDC を取り扱う際の温度変化を避け、フェノールトの変化のリスクを軽減します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. フェノチピック成熟状態を監視するフローサイトメトリック解析
<ol><li>iDC または mDC (0.5 x 106)をステップ 1.3.1 から 1.5 mL チューブに転送します。3390 x gで遠心分離を介して細胞を1.5分間収穫し、FACS緩衝液(2%胎児子牛血清(FCS)を補充したPBS)で細胞を一度洗浄します。</li>
	<li>定義された表面分子に対する特異的フルオロクロム標識抗体を含む抗体染色溶液(FACSバッファー)の100μLで細胞を再中断する。<ol>
<li>以下の抗体を使用して、純度(CD3-FITC、CD14-PE)およびDC(CD80-PacBlue/-PE-Cy5、CD11c-PE-Cy5、CCR7-PE-Cy7、CD83-APC、CD86-PE、MHCII-APC-Cy7)の成熟状態を検証します。</li>
		<li>コントロールとして100°LのFACSバッファに染色されていないサンプルを1つ用意します。</li>
		<li>暗闇の中で細胞を氷の上に30分間染めます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>その後、FACS緩衝液1mLで細胞を2回洗浄し、3390 x gで1.5分間遠心分離機を洗浄する。</li>
	<li>最後に、2%PFAを補完したFACS緩衝液の200μLで細胞を再サスペンドし、フローサイトメトリーにより細胞を分析します。固定細胞は、2日間まで暗闇の中で4°Cで保存することができます。</li>
</ol>3. 単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)によるDCの感染手順と、スパウチン-1またはバフィロマイシン-A1を介したHSV-1誘導オートファジーフラックスの干渉
注:本研究で使用した株HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43(HSV-1 EGFP)は、実験室株HSV-1株17+から得られた。HSV-1 EGFP株は、CMVプロモーターの制御下でUL43遺伝子遺伝子座に挿入された増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)を発現する。EGFPはHSV-1感染のマーカーとして機能する。さらに、株HSV1-RFPVP26は、DC感染研究に使用された(前述のトゥーランら、2019年参照)。このウイルスは、カプシド表面タンパク質VP26をモノマー赤色蛍光タンパク質(mRFP)に融合して発現する。
<ol><li>iDC または mDC (2 x 106)をステップ 1.3 から 2 mL チューブに転送します。その後、3390 x gの細胞を1.5分間遠心分離し、上清を廃棄する。</li>
	<li>感染培地(RPMI 1640 20 mM HEPESを添加)で細胞を穏やかに再中断します。<ol>
<li>オートファゴソーム・リソソーム分解経路を阻害するには、感染前にスプーチン-1またはバフィロマイシン-A1 1時間でDCを前処理する。感染媒体に10μMスパウチン-1または1μM BA1、またはDMSOを未処理のコントロールとして追加します。300rpmで300rpmで1時間揺れる加熱ブロック内の細胞をインキュベートする。</li>
		<li>感染研究では、2の感染の多重度(MOI)でHSV-1ビリオンで細胞を接種します。MNT緩衝液のそれぞれの体積(30mM 2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)、100 mM NaCl、20 mMトリス)をモックコントロールとして加えます。300rpmで300rpmで1時間揺れる加熱ブロック内の細胞をインキュベートする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1時間後感染(hpi)、3390 x gで細胞を1.5分集め、GM-CSFの40 U/mL、IL-4の250 U/mL、および10μMスパウチン-1、1μM BA1、またはDMSOを含むDC培地中の細胞を穏やかに再サスペンドします。種子模擬処理およびHSV-1感染細胞を最終濃度1x 106/mLで6ウェルプレートに入れた。</li>
	<li>16~24 hpiで、すすす(mDC)またはセルスクレーパー(iDC)を使用して細胞を収穫します。細胞を1.5 mLのセーフロックチューブに移します。<ol>
<li>3390 x gで1.5分間遠心分離で細胞を採取し、1mLのPBSを加えてペレットを1回洗浄します。</li>
		<li>2x Roti-Loadの29°L、1μL 100 mM MgCl2および12.5 U/mLベンゾマーゼを含むリシスミックス中の細胞を激しく再サスペンドします。</li>
		<li>ベンゾラーゼを用いた細胞リシスおよびDNA消化の場合、サンプルを37°Cで10分間インキュベートします。その後、タンパク質を95°Cで10分間変性する。</li>
		<li>SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析を実行して、LC3BI/II、p62、ICP0/5、およびGAPDHのタンパク質レベルを検証します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. FIP200-siRNAを用いたiDCのエレクトロポレーションによるHSV-1誘導オートファジーフラックスの干渉
注:siRNAエレクトロポレーションの本プロトコルは、Prechtelら(2007)およびGererら(2017)から改変された。
<ol><li>iDC (12 x 106) を 3.5 日目に 50 mL チューブに転送します。続いて、細胞を300 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。並行して、フローサイトメトリック分析を実行して、ステップ 2(CD80-PacBlue の代わりにライフ/デッドバイオレットを使用)の説明に従って成熟状態を監視します。</li>
	<li>フェノールレッドなしでOptiMEMの5 mLでiDCを軽く洗浄し、細胞を300 x gで5分間遠心分離します。細胞を氷の上に置き、温度変化を避けてください。迅速に移動し、フェノールレッドなしでOptiMEMのiDCの長い潜伏期間を避けてください。</li>
	<li>FIP200特異的siRNAの75pmolまたはスクランブルsiRNAの75 pmolのいずれかをコントロールとして、4mmの電気キュベットに移し、細胞懸濁液の100μL(6x106細胞)を加える。エレクトロポレーション装置Iを用いて直接パルスiDC、以下の設定を適用する:500V/1ms。<ol>
<li>実験手順の前に、メーカーの指示に従ってsiRNA懸濁液を調製し、アリコートし、-20°Cで保存します。エレクトロポレーションにこれらのsiRNAを使用する場合は、解凍し、氷の上に保ちます。試料を電気分解する前に、テストパルスを行います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>エレクトロポレーション後、新鮮な事前温めDC培地(GM-CSFの40 U/mLとIL-4の250 U/mLを補足)でiDCを6ウェルプレートに直接移します。細胞を1 x 106/mLの最終濃度で播種し、インキュベーターに入れ子にします。エレクトロキュベットから細胞をすすり抜けないでください。</li>
	<li>48時間後、まず電気ポレーションされたiDCの形態を顕微鏡で調べる。次いで、細胞スクラップを用いて細胞を収穫し、15mLチューブに移す。0.01%EDTAを補充した1 mLのPBSで井戸をすすいで、それぞれのチューブに溶液を転写します。</li>
	<li>続いて、次のステップで説明するように、siRNA条件ごとに6 x 10 6 iDCを分割する。<ol>
<li>0.5 x 106細胞を使用して、ステップ2で説明したように成熟状態および細胞生存率を評価する。CD11c-PE-Cy5、CCR7-PE-Cy7、CD83-APC、MHCII-APC-Cy7、ライフ/デッドバイオレットの抗体を使用してください。</li>
		<li>ウェスタンブロット解析には1 x 106セルを使用して、FIP200固有のノックダウン効率を検証します。3390 x gで1.5分間遠心分離して1.5 mLのセーフロックチューブに細胞を移し、収穫します。</li>
		<li>HSV-1感染実験には残りの細胞(4.5 x 106)を使用してください。実験条件ごとに、2.25 x 106 iDC を 2 mL チューブに転送し、2 の MOI で HSV1 に感染させるか、MNT バッファをモック コントロールとして追加します。ステップ3.3の説明に従って感染を実行する。</li>
		<li>20 hpiで、細胞スクレーパーを用いて細胞を採取し、ステップ3.4で説明したようにウェスタンブロット分析のために細胞溶解物を調製する。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. KIF1B/2A-siRNAエレクトロポレーションを用いたHSV-1感染mDCにおけるオートファゴソーム-リソソーム経路の変調
<ol><li>4日目にiDC(24 x 106)を50 mLチューブにポスト付着して転送します。続いて、細胞を300 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。</li>
	<li>PBSの8mLでiDCを穏やかに再サスペンド(=洗浄)し、3x 106/mLの最終細胞濃度を調整する。3 x 106細胞を1.5mLチューブに移し、3390 x gで1.5分間収穫します。</li>
	<li>サプリメントミックスを含むバッファP3の100μLでiDCを再サスペンド(メーカーの指示に従い、エレクトロポレーションキット装置II)と(i)KIF1B特異的siRNAの75 pmol、(ii)KIF2A特異的siRNAの75 pmol、または(iii)両方。(iv)スクランブルsiRNAの各量を対照として用いる。siRNA条件ごとに2本のチューブ(6 x 106細胞)を準備し、懸濁液を別々のエレクトロキュベットに移します。エレクトロポレーション装置IIを用いてパルス「EH-100」を印加する直接パルスiDC。<ol>
<li>実験手順の前に、メーカーの指示に従ってsiRNA懸濁液を調製し、アリコートし、-20°Cで保存します。エレクトロポレーションにこれらのsiRNAを使用する場合は、解凍し、氷の上に保ちます。氷の上にiDCを置き、温度変化を避けないでください。迅速に移動し、PBSまたはバッファP3内のiDCの長いインキュベーションを避けてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>エレクトロポレーション直後に、500 μL の事前温め RPMI 1640 をエレクトロキュベットに追加します。インキュベーターで細胞を5~10分間インキュベートし、iDCを新鮮な事前温めDC培地(GM-CSFの40 U/mL、IL-4の250 U/mLを補充)で6ウェルプレートに移します。それぞれの条件を1つのウェルに結合し、1·106/mLの最終濃度で細胞を播種し、インキュベーターに入れ子にします。</li>
	<li>インキュベーション後4時間、ステップ1.2.2に記載のサイトカインを含む成熟カクテルを加える。 注:エレクトロポレーション後2日のフローサイトメトリック解析の制御として、非エレクトロポレーションドDC(1 x 106)から1つのサンプルを準備します。制御細胞を電気ポレーションされたサンプルと同様に扱います。</li>
	<li>エレクトロポレーション後2日間、懸濁液により細胞を収穫し、15mLチューブに移す。1 mLのPBSで井戸をすすいで、それぞれのチューブに懸濁液を移します。以下のステップで説明するように、siRNA条件ごとに6·10 6 DCを分割します。<ol>
<li>0.25 x 106 DC(電気ポレーションおよび非エレクトロポレーション)を使用して、ステップ 2 で説明したように成熟状態とセルの生存率を確認します。CD80-PE-Cy5、CD83-APC、CD86-PE、MHCII-APC-Cy7、ライフ/デッドバイオレットの抗体を使用してください。</li>
		<li>ウェスタンブロット解析には0.75 x 106セルを使用して、KIF1B/2A特異的ノックダウン効率を評価します。3390 x gで1.5分間遠心分離して1.5 mLのセーフロックチューブに細胞を集め、ステップ3.4の説明に従って細胞溶解物を準備し、ウェスタンブロット分析を行います。</li>
		<li>各siRNA状態から残りの細胞(5 x 106)を使用し、HSV-1感染実験を行います。実験条件ごとに、2.5 x 106 iDC を 2 mL チューブに転送し、2 の MOI で HSV-1 に感染させるか、MNT バッファをモック コントロールとして追加します。ステップ3.3の説明に従って感染を実行する。</li>
		<li>20時間後の感染では、懸濁液によって細胞を採取し、ウェスタンブロット分析のために細胞溶解液を調製し、ステップ3.4で上述したようにHSV-1誘発オートファジー回転の誘導を検証する。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

本プロトコルの範囲は、(i)ヒト単球由来iDCおよびmDCの取り扱い、(ii)HSV-1への感染、(iii)オートファジーを阻害することが知られている化合物による治療、および(iv)2つを用いたsiRNAによるエレクトロポレーションを含む異なる技術的な設定。本プロトコルを用いて、自動ファジーフラックスは、HSV-1感染iDCで遮断されるか、またはHSV-1感染したmDCに誘導され得る。
DC、特にiDCは非常に脆弱な細胞であるため、これらの細胞を操作するにはかなりデリケートなステップが必要です。DC生成では、より高い細胞収率を得るために、新鮮に分離されたPBMCを使用し、その凍結保存を避けることをお勧めします。さらに、その後の栽培を含む実験中にiDCを取り扱う場合は、過酷な温度変化や長時間の温度変化を防ぎます。さもなければ、iDCは表現型の変化を起こす可能性があるため、フローサイトメトリーによって未熟な表現型を検証する必要があります。iDC には、成熟した対応するマーカーとは対照的に、CD80、CD83、CD8628、29などの明確なマーカーがないことに注意してください。HSV-1を使用したiDCおよびmDCの感染は、確立された方法2、3、4、5、6、10である。私たちは、1または2のMOIが使用されている場合、DCがHSV-1感染の影響を非常に受けやすいことを示しました(図2)。私たちの手では、感染媒体の体積を低レベル(250-350°Lの1-3 x 106細胞)に保つことは、感染効率の向上につながります。
所定の明確な細胞経路を妨害する古典的なアプローチは、特定の化合物の使用です。オートファジーの様々な異なるモジュレーター、すなわち活性化剤ならびに阻害剤は、現在30で利用可能である。DCにおけるHSV-1誘導オートファジーに関しては、トゥランら(2019)最近、iDC10におけるオートファジー回転率に対するスプーチン-1およびバフィロマイシン-A1(BA1)の阻害効果を示した。オートファジー阻害のためのこの技術は、感染率もDC(特にiDC)の成熟状態も損なわれていないので、その後のHSV-1感染との組み合わせに適している。将来のアプリケーションでは、この阻害剤ベースのアプローチは、他の感染剤、飢餓などのストレス状態、ならびに異なる細胞タイプと組み合わせて適用することもできる。しかしながら、阻害剤を使用する場合、細胞生存率に重大な影響を及ぼすことなく、効率的なオートファジー阻害に適した濃度を決定する際に制限が生じる。阻害剤を使用する際の主な制限は、しかし、潜在的なオフターゲットまたは副作用の発生であり、誤解を招く結果31、32につながる可能性がある。
オートファジーを妨害する第2のアプローチは、本プロトコルでカバーされ、siRNA33、34、35を用いた具体的なノックダウンである。一方、エレクトロポレーション装置Iを用いてFIP200の発現を特異的に棄却し、iDCにおけるHSV-1誘導オートファジー回転を抑制した。一方、エレクトロポレーション装置IIを用いて2つの異なるKIFタンパク質(すなわち、KIF1BおよびKIF2A)を無音化し、HSV-1感染mDCにおけるオートファジーフラックスを容易にした。どちらのエレクトロポレーションプロトコルも、iDCのFIP200とほぼ完全なアブレーション、およびmDCのKIF1B/KIF2Aをほぼ完全にアブレーションし、ウェスタンブロット分析を介して検証された(図4A、図5A)。DCの生存率に影響を与えないエレクトロポレーション装置Iとは対照的に、エレクトロポレーション装置IIを用いたmDCのエレクトロポレーションは、死細胞の割合がわずかに高くなる(図4B、図5B).したがって、将来のアプリケーションでは、エレクトロポレーション装置は、iDCとmDCの両方に優先的に使用されるべきです。驚くべきことに、siRNAベースの技術は、オートファジーフラックスを調節するために、iDCまたはmDCのいずれかの後続のHSV-1感染と互換性がある。さらに、iDCの未熟な表現型もmDCの成熟表現型も、ポストエレクトロポレーションの後に変化しない。
FIP200特異的siRNAを用いたiDCのエレクトロポレーションは、HSV-1感染時の自動羽束の阻害と同様に、遺伝子ノックダウンのための効率的かつ高度に特異的な方法である。FIP200の特定のサイレンシングに加えて、このプロトコルは、オートファジーカスケード中に異なるステップで参加し、他のオートファジーコンポーネントを無音に適合させることができます。しかしながら、オートファジーの効率的なsiRNA媒介阻害のための適切な標的を同定することは、懸念のいくつかの側面を含む。第一に、オートファジー関連遺伝子(ATG)のノックダウン効率は、必ずしもオートファジーの効率的な阻害と正に相関するものではなく、36で沈黙している特異的ATGタンパク質に大きく依存する。第二に、異なるATGタンパク質は、オートファジーとは異なる経路にさらに関与しており、したがって、そのアブレーションはまた、副作用につながる可能性があります37,38,39.第三に、異なるATGは、冗長な機能を有し得、したがって、1つの成分のノックダウンは、オートファジーを阻害するのに十分ではないかもしれない(例えば、beclin-1およびbeclin-2)40。
また、DCのエレクトロポレーション装置I系エレクトロポレーションプロトコルもmRNAに適しており、PBMC25などの様々な追加の一次セルタイプに用いることができる。したがって、このシステムは、異なる一次細胞型に異なるRNA種を提供するための一般的な戦略を提供します。結論として、iDCの後続のHSV-1感染と組み合わせた阻害剤またはsiRNAベースのアプローチを用いて、オートファジーフラックスを阻害する2つのプロトコルを提示する。さらに、HSV-1感染時にmDCに自己ファジーフラックスを誘導するsiRNAエレクトロポレーションアプローチについて説明する。

ヒト単球由来樹状細胞(DC)の生成は、この重要な免疫細胞型の機能および生物学を研究するための適切なin vitroモデルを構成する。DCへの単球の単一化と同様に分離は、近年1、2で確立されている。αヘルペスウイルスヘルペス単純型ヘルペスウイルス1型(HSV-1)によるDCの感染は、DC生物学2、3、4、5、6のHSV-1媒介変調を研究するモデルシステムとして機能する。.これは、ヘルペスウイルスが強力な抗ウイルス免疫応答を減衰または阻害する方法を解明し、宿主7、8内の免疫特権ニッチにおける遅延を確立する方法を解明するために特に重要である。この点で、ヘルペスウイルスは、地理的領域9に従って最大90%の血清有病率に達する集団全体に広がっている非常に成功した病原体である。これを理解し、おそらく防ぐために、宿主の免疫系、特にDCなどの免疫細胞のHSV-1媒介変調に関するより多くの洞察が必要です。
HSV-1とのDCの相互作用に関する全く新しい観察は、最近、トゥーランら10によって発表されました。著者らは、HSV-1レプリケーションの達成はDCの成熟状態に厳密に依存することを実証した。iDCでは、HSV-1の完全な複製はオートファジー依存機構によって容易にされる。HSV1 は iDC と mDC の両方でオートファジーを誘導しますが、オートファジーフラックスは iDC でのみ観察されます。これは今度は、iDCの核ラミンの自動ファジーック分解を介してウイルスキャプシドの核出口を促進する。iDCとmDCにおけるこのHSV-1誘導劣化経路に関する機械的洞察を得るためには、オートファジーフラックスを調べるには、新しく効率的な戦略が不可欠です。
マクロオートファジー(オートファジー)は、リソソーム消化のための細胞内タンパク質または全オルガネラを標的とする十分に保存された多段階プロセスである。単純化的に、オートファジーは、(i)開始、(ii)膜核形成、(iii)小胞膨張、および(iv)オートファゴソーム-リソソーム融合相12に分けることができる。開始(i)の間、活性化ULK1/2キナーゼ複合体のような成分は、200kD(FIP200)の焦点接着キナーゼファミリー相互作用タンパク質を含み、beclin-1-Vps34-AMBRA1複合体を活性化するために重要である。続いて、膜核形成(ii)は、p6214などの分子によってマークされた細胞質貨物を巻き込む貪食形成13を開始する。小胞膨張およびオートファゴフォア成熟(iii)微小管関連タンパク質軽鎖3(LC3)-Iは、オートファゴソーム膜に挿入されるその脂質型LC3-IIに変換される。従って、LC3-Iから-IIへの変換速度は、成熟オートファゴソーム15、16の形成をミラー化することによってオートファジー誘導のための指標である。オートファゴソームリソソーム融合(iv)の際には、オートファジーカル貨物だけでなく、関連するp62およびLC3-IIタンパク質も分解を受ける(例えば、加水分解による)。したがって、p62およびLC3-IIの損失は、オートファジーフラックス17のマーカーとして機能する。オートファゴソームとリソソームの融合は、オートファジーターンオーバーに続き、細胞内リソソーム局在化に大きく依存する。これは、とりわけ、キネシンファミリーメンバーKIF1BおよびKIF2Aによって調節され、オートファゴソームリソソーム融合18に悪影響を及ぼすことが示された。興味深いことに、KIF1BおよびKIF2Aのタンパク質発現は、DC成熟時に誘導され、それによって完全なHSV-1複製10を妨げるHSV-1感染したmDCにおける非効率的な自己ファジーフラックスを担っている。
オートファジーを調節する実験的試みは、この特定の経路19、20、21を誘導または阻害することが知られている化合物の使用を含む。本研究では、HSV-1感染iDCにおけるオートファジー回転を遮断する2つの阻害剤ベースの戦略について述べ上す。我々の実験で用いられる最初の化合物は、オートファジー22の開始段階におけるベクリン-1-Vps34-AMBRA1複合体分解を促進するために記載された特異的かつ強力なオートファジー阻害剤-1(スパウチン-1)である。本研究で用いられる第2の化合物は、後期オートファジー事象を遮断するV-ATPアーゼ阻害剤であるバフィロマイシン-A1(BA1)である(すなわち、オートファゴソーム-リソソーム融合ならびにオートリソソーム酸性化)23、24。HSV-1によるiDC感染前のこれら2つの阻害剤のいずれも使用するとオートファジーを強力に阻害するが、効率的なウイルス遺伝子発現を妨げない。したがって、HSV-1感染前のこの阻害剤ベースの戦略は、HSV-1誘導性自己ファジーフラックスを阻害する強力なツールを提供し、異なる細胞型やウイルスの多くに対して容易に膨張させることができ、オートファジーを誘発する可能性もある。
阻害剤ベースのアプローチの大きな欠点(すなわち、非特異的なオフターゲット効果)を克服するために、我々は(HSV-1感染した)iDCにおける自己ファジークフラックスを遮断するsiRNAベースの方法を開発した。siRNAエレクトロポレーションの技術は、異なるタンパク質(すなわち、オートファジー成分)の発現の選択的アブレーションを介して、強力な代替戦略を表す。我々の実験では、iDCをエレクトロポレーション装置I(材料表参照)とGerer et al.(2017)およびPrechtelら(2007)によって記載された改変プロトコルを用いてFIP200特異的siRNAで電気化し、中のオートファジーを阻害する。開始フェーズ25,26.この技術により、iDCにおけるFIP200発現を特異的にノックダウンすることができました。注目すべきことに、HSV-1感染は、効率的なウイルスタンパク質発現によってミラーリングされたこれらの電気合成iDCにおいて確立された。このsiRNAベースの技術は、独自の利点(すなわち、様々な異なるオートファジー成分が組み合わせてであっても)、その発現のアブレーションを特異的に標的にすることができるというユニークな利点を提供する。
本研究では、HSV-1感染mDCにおいてもオートファジーフラックスを誘導するsiRNAベースの方法についてさらに説明する。この場合、iDCは、エレクトロポレーション装置IIを用いてDC成熟前にKIF1BおよびKIF2Aを対象としたsiRNAで電気ポポー化した(材料表参照)。両方のタンパク質はDC成熟時にアップレギュレートされ、リソソーム10、18とオートファゴソームの融合を否定的に調節することが知られているので、HSV-1感染時にmDCのオートファジーフラックスを強く誘発するノックダウン。これにより、siRNAベースの技術により、mDCにおけるKIFタンパク質発現を妨害することでオートファジーターンオーバーを特異的に誘導することができ、iDCにおける発現レベルを模倣することができました。
要約すると、HSV-1感染iDCにおけるオートファジーフラックスを阻害する2つの異なる方法を提示する。第1の阻害剤ベースのアプローチは、オートファジー分解を妨害する簡単で安価で迅速な方法を構成するが、第2のsiRNAベースの技術は、より具体的で、阻害剤ベースの結果を支持し、検証するための非常に適切な方法である実験。また、2つのKIFタンパク質のsiRNA媒介性ノックダウンを介して、HSV-1感染mDCにおいても自己泳束を誘導する方法について説明する。

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector Core Unit (エレクトロポレーション装置 II)</td><td>Lonza (Basel, Switzerland)</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>AB-Serum</td><td>Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td><td>H4522</td><td>Dendritic cell cultivation</td></tr><tr><td>ACD-A</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td><td>9007281</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (エレクトロポレーションキット装置 II)</td><td>ロンザ(スイス、バーゼル)</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td><td>GE Healthcare(ゾーリンゲン、ドイツ)</td><td>RPN2232</td><td>ウェスタンブロット検出</td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム(APS)</td><td>Sigma Aldrich Chemie GmbH(シュタインハイム、ドイツ)</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse-IgG (mouse, polyclonal, HRP)</td><td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td><td>7076</td><td>Western Blot検出</td></tr><tr><td>抗ウサギ-IgG (ヤギ、ポリクローナル、HRP)</td><td>細胞シグナル伝達 (ライデン、オランダ)</td><td>7074</td><td>ウェスタンブロット検出</td></tr><tr><td>Bafilomycin A1</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (シュタインハイム、ドイツ)</td><td>tlrl-baf1</td><td>オートファジーおよびリソソーム分解の阻害</td></tr><tr><td>BD FACS Canto II Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences (ハイデルベルク、ドイツ)</td><td>338962</td><td></td></tr><tr><td>ベンゾナーゼ</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (シュタインハイム、ドイツ)</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>ブロッティングチャンバー Fastblot B44</td><td>Biometra (G&ouml;ttingen, Germany)</td><td>846-015-100</td><td></td></tr><tr><td>CCR7 (mouse, Pe-Cy7)</td><td>BioLegend (Fell, Germany)</td><td>557648</td><td>Flow cytometry 希釈率: 1:100 Clone: G043H7</td></tr><tr><td>CD11c (mouse, Pe-Cy5)</td><td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td><td>561692</td><td>Flow cytometry 希釈率: 1:100 Clone: B-ly6</td></tr><tr><td>CD14 (mouse, PE)</td><td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td><td>555398</td><td>フローサイトメトリー 希釈率:1:100 クローン:M5E2</td></tr><tr><td>CD3 (マウス、FITC)</td><td>BD Biosciences(ハイデルベルク、ドイツ)</td><td>555332</td><td>フローサイトメトリー 希釈率:1:100 クローン:UCHT1</td></tr><tr><td>CD80(マウス、V450)</td><td>BD Biosciences(ハイデルベルク、ドイツ)</td><td>560442</td><td>フローサイトメトリー 希釈:1:100 クローン:L307.4</td></tr><tr><td>CD83(マウス、APC)</td><td>eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany)</td><td>17-0839-41</td><td>Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: HB15e</td></tr><tr><td>CD86 (mouse, PE)</td><td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td><td>553692</td><td>Flow cytometry Dilution: 1:100</td></tr><tr><td>EVOS FL Cell Imaging</td><td>System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>AMF4300</td><td></td></tr><tr><td>FIP200 (rabbit)</td><td>Cell Signaling (Leiden), オランダ)</td><td>12436</td><td>Western Blot detection 希釈率: 1:1000 Clone: D10D11</td></tr><tr><td>GAPDH (mouse)</td><td>Merck Millipore (Massachusetts, USA)</td><td>AB2302</td><td>Western Blot detection Dilution: 1:5000 Clone: MAB374</td></tr><tr><td>Gene Pulser II apparatus (electroporation apparatus I)</td><td>BioRad Laboratories GmbH (M&uuml;nchen、ドイツ)</td><td>165-2112</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF(4x104U / mL)</td><td>Miltenyi Biotec(ベルギッシュグラートバッハ、ドイツ)</td><td>130-093-868</td><td></td></tr><tr><td>HLA?DR (マウス, APC-Cy7)</td><td>BioLegend (Fell, Germany)</td><td>307618</td><td>Flow cytometry 希釈率: 1:200 クローン: L243</td></tr><tr><td>HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43</td><td>BioVex</td><td></td><td>DC infection ;</td></tr><tr><td>ICP0 (マウス)</td><td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz;ダラス、テキサス州、米国)</td><td>sc-53070</td><td>ウェスタンブロット検出 希釈:1:1000 クローン:11060</td></tr><tr><td>ICP5 (マウス)</td><td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz;米国テキサス州ダラス)</td><td>sc-56989</td><td>ウェスタンブロット検出 希釈率:1:1000 クローン:3B6</td></tr><tr><td>IL-1&beta;(0.1x106 U/mL)</td><td>Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany)</td><td>1411-050</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 (1x106 U/mL)</td><td>Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)</td><td>130-093-924</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 (1x106 U/mL)</td><td>Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany)</td><td>1404-050</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000</td><td>GE Healthcare (ゾーリンゲン, ドイツ)</td><td>28955810</td><td></td></tr><tr><td>KIF1B (マウス)</td><td>サンタクルスバイオテクノロジー(セントクルーズ;米国テキサス州ダラス)</td><td>sc-376246</td><td>ウェスタンブロット検出 希釈率:1:1000 クローン:E-12</td></tr><tr><td>KIF2A (マウス)</td><td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz;米国テキサス州ダラス)</td><td>sc-271471</td><td>Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D-7</td></tr><tr><td>LC3B (rabbit)</td><td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td><td>3868</td><td>Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D11</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Lonza (Basel, Switzerland)</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Violet dead cell stain kit</td><td>Life Technologies (Carlsbad, CA</td><td>L34964</td><td>L/D staining in Flow cytometry</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies AS (Oslo, Norway)</td><td>04-03-9391/01</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td><td>A537.1</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 2.0 RS</td><td>Heraeus (Hanau, Germany)</td><td>75015505</td><td></td></tr><tr><td>N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamine (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer counting chamber</td><td>Brand (Wertheim, Germany)</td><td>717805</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Cell culture flasks (175.0 cm2)</td><td>Thermo Scientific (Rockford, USA)</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>p62 (rabbit)</td><td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td><td>88588</td><td>Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D5L7G</td></tr><tr><td>PageRuler 染色済みタンパク質ラダー</td><td>Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany)</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16 %</td><td>Alfa Aesar, Haverhill, USA</td><td>43368.9M</td><td></td></tr><tr><td>PerfectSpin 24 Plus</td><td>Peqlab (Erlangen, Germany)</td><td>C2500-R-PL</td><td></td></tr><tr><td>PGE2 (1 mg/mL)</td><td>Pfizer(ベルリン、ドイツ)</td><td>BE130681</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered生理食塩水 (PBS)</td><td>ロンザ (バーゼル、スイス)</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質ゲルシステム MiniProtean II</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH (M&uuml;nchen, Germany)</td><td>1652960</td><td></td></tr><tr><td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td><td>Thermo Scientific, Rockford, USA</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>ロッキングプラットフォーム wt 15</td><td>Biometra (G&ouml;ttingen, Germany)</td><td>042-590</td><td></td></tr><tr><td>RotiBlock</td><td>Carl Roth GmbH (カールスルーエ, ドイツ)</td><td>A151.4</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Load 1 (4x)</td><td>Carl Roth GmbH (カールスルーエ, ドイツ)</td><td>K929.3</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese Gel 30 (37.5:1)</td><td>Carl Roth GmbH (カールスルーエ, ドイツ)</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza (バーゼル, スイス)</td><td>12-167F</td><td></td></tr><tr><td>ドデシルナトリウム硫酸塩 (SDS)</td><td>Carl Roth GmbH (カールスルーエ、ドイツ)</td><td>2326.2</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf (ハンブルク、ドイツ)</td><td>5355 000.011</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha;(10 &mu;g/mL)</td><td>Peprotech (ハンブルク、ドイツ)</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Carl Roth GmbH (カールスルーエ、ドイツ)</td><td>4855.3</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液 (0.4 %)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (シュタインハイム、ドイツ)</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Carl Roth GmbH (カールスルーエ、ドイツ)</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 &mu;m ニトロセルロースメンブレン</td><td>GE Healthcare (ゾーリンゲン、ドイツ)</td><td>10600001</td><td></td></tr><tr><td>WhatmanTM Chromatography Paper 3 mm Chr</td><td>Fisher Scientific GmbH (シュヴェルテ、ドイツ</td><td>)3030917</td><td></td></tr></tbody></table>

単純ヘルペスウイルス1型にオートファジーを調節するsirnaエレクトロポレーション 1-感染単球由来樹状細胞

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)は、未熟樹状細胞(iDC)と成熟樹状細胞(mDC)の両方でオートファジーを誘導するのに対し、自己ファジーフラックスはiDCでのみ観察されます。機械的な洞察を得るために、HSV-1誘発オートファジー回転を妨害する効率的な戦略を開発しました。阻害剤ベースの戦略は、HSV−1誘導オートファジーを調節するために、それが容易かつ迅速な方法であるので、第一選択を構成する。このような化合物の潜在的な非特異的なオフターゲット効果を回避するために、HSV-1感染時のiDCにおけるオートファジー回転を調節する代替siRNAベースの戦略を開発しました。実際、HSV-1感染前のFIP200特異的siRNAを用いたiDCのエレクトロポレーションは、FIP200タンパク質発現を棄却し、それによって自己形成フラックスを阻害する非常に特異的かつ成功した方法である。両方の提示された方法は、iDCにおけるHSV−1誘導オートファジー回転の効率的な阻害をもたらし、それによってsiRNAベースの技術はより標的特異的である。KIF1BおよびKIF2Aのタンパク質発現を選択的に沈黙させ、mDCにおけるHSV-1感染時の自動ファジーックターンオーバーを促進する追加のsiRNAベースのアプローチが開発された。結論として、siRNAエレクトロポレーションの技術は、選択的に異なるタンパク質の発現を棄却し、HSV-1感染に及ぼす影響を分析する有望な戦略を表す。

本稿では、樹状細胞におけるHSV-1誘導オートファジーを妨害する方法について説明する。これには、フローサイトメトリーによってフェノ典型的に分析されたヒト単球由来iDCおよびmDCの生成が含まれる(図1)。4日目のポスト遵守では、DCはCD80、CCR7、およびCD83の弱い発現と、高いCD11cおよび中間MHCII発現を特徴とする未熟な表現型を示す。CD3およびCD14シグナルが欠落しているため、T細胞および単球汚染を排除することができる。6日目のポスト付着(すなわち、成熟の2日目の誘導)において、DCはCD80、CCR7、CD83、およびMHC-II表面発現の有意な増加によって反映される成熟した表現型を示す。eGFP発現HSV-1株(図2)による感染により、iDC(図2A上部パネル)またはmDC(図2下パネル、図2B)の感染がほぼ完全に発生します。蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーによって分析される強いGFPシグナル。
最近のレポートで示されているように、HSV-1はiDCとmDCの両方でオートファジーを誘導しますが、iDCではオートファジー回転率が10回しか発生しません。最初のアプローチでは、iDC と mDC を spautin-1 (図 3A) で処理し、オートファジーの開始をブロックするか、バフィロマイシン-A1 (BA1;図3B)−最終的なオートファゴソームリソソーム融合を阻害する。スプーチン-1およびBA1がない場合のiDCのHSV-1感染では、オートファジーフラックスはそれぞれp62およびLC3B発現の低下によってミラーリングされる。対照的に、スパウチン-1がない場合のmDCのHSV-1感染はp62発現に影響を与えないが、スパウチン-1およびBA1治療はLC3B-IIの蓄積を誘発する。これはオートファジーの誘導を反映しているが、mDCにおけるオートファジー回転率の失敗である。iDCでは、スプーチン-1前処理は、開始段階でオートファジーの阻害に起因するHSV-1感染時のp62のオートファジー分解を強く回復する。BA1による前処理の際、モックおよびHSV-1感染iDCはLC3B-IIタンパク質レベルの強い蓄積を示し、後期オートファゴソーム-リソソーム融合を遮断することによってオートファジーックターンオーバーの阻害に成功したことを示す。これと一致して、mDCのスプーチン-1およびBA1前処理はまた安定したp62およびLC3B-IIタンパク質レベルの増加をもたらす。
オートファジーフラックスを損なう第2の方法では、HSV-1感染iDCにおけるオートファジーフラックスを遮断する能力について、FIP200を標的とするsiRNAエレクトロポレーションを検討する。図4Aに示すように、iDC48時間後エレクトロポレーションにおいて、FIP200タンパク質レベルが強く低下し、対照siRNAと比較して検出された。この時点で、iDCは細胞死の兆候を示しておらず(図4B)、未熟な表現型を維持している(図4C)。HSV-1によるFIP200沈黙iDCの感染は、対照siRNA処理型の対応と比較してオートファジーフラックスの強い減少を明らかにする(図4D)。これは、FIP200がHSV-1感染iDCで沈黙している場合、LC3Bのタンパク質レベルとp62の増加を伴う。
逆の試みとして、HsV-1感染mDCにおいても、KIF1BおよびKIF2Aタンパク質発現のsiRNA媒介アブレーションがオートファゴソーム・リソソーム回転を可能にするかどうかを検討した。したがって、iDCは、これらのタンパク質の一方または両方を標的とする特定のsiRNAを用いて電気合成し、その後細胞を成熟させた(図5)。エレクトロポレーション後2日間、mDCは、特定のsiRNAを使用した場合のKIF1Bおよび/またはKIF2Aタンパク質発現の強力な低下を示す(図5A)。この方法は、顕著な細胞死(図5B)にも、彼らのフェノチピック成熟状態の変化にもつながりませんでした(図5C)。オートファゴソーム・リソソーム分解時のKIF1BおよびKIF2Aの重要性を支持し、HSV-1感染前の枯渇はmDCにおけるオートファジーフラックスの増加を促進する。これは、それぞれの制御条件とは対照的に、残留p62タンパク質レベルの低下によって反映される(図5D)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig01.jpg"> 図1:フローサイトメトリーを用いたヒト単球由来iDCおよびmDCのフェノチピック特性評価DCを生成し、その純度を検証するために特定の抗体で染色した:(A)CD3はT細胞汚染を排除し、(B)CD14は単球による汚染を除外し、(C)CD11cはDCのマーカーとして。彼らの表色成熟状態を評価するために、以下の抗体を用いた:(D)CD80、(E)CCR7、(F)CD83、および(G)MHCII。これらの分子はmDC上で高度に発現しているため、未熟なDC表現型と成熟したDC表現型との間の判別を可能にする。データはFCSエクスプレス5.0を用いて分析した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig02.jpg"> 図2:HSV-1に感染したiDCおよびmDCの顕微鏡およびフローサイトメトリック解析iDCおよびmDCは、GFP信号に基づいて感染速度の定量を可能にするために、EGFP(HSV-1 EGFP)を発現するHSV-1株に感染した。(A)GFP陽性HSV-1感染型iDCおよびmDCの顕微鏡分析は、2のMOIで感染し、24hpiで感染していない対応と比較した。感染細胞を可視化するために、GFP蛍光をモニタリングした。スケールバーは、感染動態中のモックまたはHSV-1感染mDCの400μm(B)フローサイトメトリック測定を表します。上部パネル(黒い裏地のヒストグラム)は模擬状態を示し、下部パネル(黒塗りヒストグラム)は、示されたタイムポイントが感染後にHSV-1感染細胞を示す。データはFCSエクスプレス5.0を用いて分析した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig03.jpg"> 図3:スプーチン-1およびbアフィロマイシン-A1は、HSV-1感染iDCにおけるオートファジーフラックスを調節する。iDCおよびmDCは、感染前に1時間(A)スパウチン-1または(B)バフィロマイシン-A1(BA1)で治療した。その後、2のMOIを用いて模擬またはHSV-1感染(HSV1-RFPVP26)を細胞化した。16〜18時間後、DCを採取し、タンパク質溶解剤をウェスタンブロッティングに供し、オートファジーマーカーとしてp62またはLC3B-I/-IIの発現を決定し、感染制御としてICP0、およびGAPDHをローディング制御として決定した。LC3B-IおよびLC3B-IIタンパク質レベルを定量し、Bio1D(光学密度)を用いて参照タンパク質GAPDHに正規化した。正規化LC3B-I信号に対する正規化LC3B-IIの比率を示す。この図は、JCBに掲載された©2019 Turanらから改変され、適応されています。https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig04.jpg"> 図4:FIP200-siRNAエレクトロポレーションにおけるHSV-1感染iDCにおけるオートファジーフラックスの解析iDCをエレクトロポレーション装置I.(A)DCを用いて制御siRNAまたはFIP200特異的siRNAで電気ポポー化し、FIP200ノックダウン48hポストエレクトロポレーションの効率について分析し、ウェスタンブロット分析を行った。(B)細胞生存率ならびに(C)成熟状態は、水性サイトメトリーによるエレクトロポレーション(水色ヒストグラム)および48時間ポスト(濃い青色および灰色のヒストグラム)エレクトロポレーションの前に分析した。3つの異なるドナーの中央値が示されます。FIP200および未熟表現型の効率的なノックダウンを確認した後、細胞は2のMOIを用いてHSV-1感染(HSV-1 EGFP)を行った。データはFCSエクスプレス5.0を用いて分析した。(D)20時間後感染時に、細胞を自己戦マーカーとしてLC3B-I/-IIおよびp62の発現を決定するためにウェスタンブロット分析を行った。ICP5は感染制御として検出され、GAPDHは負荷制御として検出された。パネルAおよびDは、JCBで最初に公開された©2019トゥーランらから改変され、適応されています。https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig05.jpg"> 図5:KIF1Bおよび/またはKIF2AのsiRNA媒介アブレーションは、HSV-1感染したmDCにおけるオートファジー回転を調節する。iDCをKIF1B特異的および/またはKIF2A特異的siRNAと電気化し、ならびに制御siRNAを、エレクトロポレーション装置IIを用いた。4hポストエレクトロポレーションでは、成熟カクテルの添加を介して成熟を誘導した。48時間後のエレクトロポレーションで、DCは、ウェスタンブロッティングによるKIFノックダウンの効率、(B)細胞生存率、およびフローサイトメトリック分析を用いた(C)表現型成熟状態(2つの異なる)に関して分析した。ドナーが表示されます)。「w/o EP」はエレクトロポレーションなしで、成熟の誘導後を意味します。「ポストコントロールEP」は、制御siRNAを用いたポストエレクトロポレーションを意味する。「ポストKIF1B、KIF2A、KIF1B/2A EP」は、KIF1Bおよび/またはKIF2A特異的siRNAを用いたポストエレクトロポレーションを意味する。KIF1Bおよび/またはKIF2Aおよび成熟表現型の効率的なノックダウンを確認した後、細胞は2のMOIを用いてHSV-1感染(HSV-1 EGFP)を行った。データはFCSエクスプレス5.0を用いて分析した。(D)細胞をウェスタンブロット分析20時間ポスト感染に供し、オートファジーマーカーとしてp62の発現を評価した。ICP5は感染制御として、GAPDHは負荷制御として使用された。図A及びDは、JCBに掲載された©2019トゥーランらから改変・改変された。https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

本研究では、単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)に感染した単球由来樹状細胞におけるオートファジーフラックスを妨害する阻害剤およびsiRNAベースの戦略を提示する。

単純ヘルペスウイルス1型にオートファジーを調節するsiRNAエレクトロポレーション 1-感染単球由来樹状細胞

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

我々のプロトコルは、樹状細胞におけるHSV-1誘導オートファジー回転を効率的に妨害する方法を記述する。特に、感染前にオートファジーを遮断するsiRNAベースの戦略と阻害剤ベースを比較します。オートファジーに対する阻害剤ベースの干渉は潜在的および特異的なオフターゲット効果を含むが、我々の開発されたsiRNAベースの戦略はより標的特異的である。重要なことに、提示された技術は、疾患の成熟段階に影響を与えない。この手順のデモンストレーションは、技術者のペトラ・ミュール=ズルベスと、私の研究室の卒業生であるアレクサンドラ・デュソーンです。4日目のポスト付着で、緩やかに接着性の細胞を細胞培養フラスコの底からそっとすすいで未熟な樹状細胞またはiDCを収穫することから始めます。成熟した樹状細胞またはmDCを生成するために細胞に成熟カクテルを追加します。成熟誘導の2日後、細胞培養フラスコの底部からmDCをリンスする。リンスを2回繰り返し、iDCとmDCをそれぞれの培養培地中の50ミリリットルチューブに移します。5分間300回gで遠心分離を介して細胞を収穫する。細胞培養フラスコあたり5~10ミリリットルのRPMI 1640で細胞を穏やかに再懸濁し、各DC懸濁液を1本のチューブに組み合わせます。次に、計数チャンバーを使用して細胞を定量化し、DCを扱う際の温度変化を避けるようにします。200万個のiDCまたはmDCを2ミリリットルチューブに移し、3,390倍gで1〜1/2分間遠心し、上清を捨てます。感染培地中の細胞を穏やかに再懸濁する。10マイクロモル・スパイン-1または1ミクロモル・バフィロマイシンA1を感染の1時間前の感染培地に添加することにより、オートファゴソームリソソーム分解経路を阻害する。未処理のコントロール用DMSOを追加し、300 RPMで振ると摂氏37度の加熱ブロック上の細胞をインキュベートします。感染研究のために、HSV-1ビリオンを有する細胞を2つの感染の多重度で接種する。MNTバッファーのそれぞれの体積をモックコントロールとして加え、摂氏37度の加熱ブロック上の細胞を揺れで1時間インキュベートします。感染の1時間後、3分3、390回ggで1〜1/2分間遠心分離を経て細胞を採取し、接種物を穏やかに吸引し、DC培地中の細胞を再懸濁する。種子モック処理し、HSV-1感染細胞を6ウェルプレートに1ミリリットル当たり100万個の最終濃度で感染した。感染後16〜24時間で、細胞スクレーパーまたはmDCをリンスしてiDCを収穫し、細胞を1.5ミリリットルのセーフロックチューブに移し、3、390倍gの1〜1/2分間遠心分離で収集する。ウェルに残った細胞を用いて収穫と遠心分離を繰り返し、その後、PBSの1ミリリットルでペレットを1回洗浄し、精力的にリシスミックスで細胞を再懸濁します。サンプルを摂氏37度で10分間インキュベートし、摂氏95度まで10分間加熱します。SDSページおよびウェスタンブロット分析を実行して、LC3B1およびLC3B2、P62、ICP0およびICP5、およびGAPDHタンパク質レベルを検証します。3.5日のポスト付着では、1,200万個のiDCを50ミリリットルチューブに移し、300倍gで5分間遠心し、上清を捨てます。並行して、フローサイトメトリック解析を実行して成熟状態を監視します。フェノールレッドなしで5ミリリットルのOpti-MEMでiDCを静かに洗い、遠心分離機を300gで5分間洗浄します。上清を捨て、細胞濃度を100マイクロリットル当たり600万細胞に調整するOpti-MEMの200マイクロリットルで細胞を再懸濁する。FIP200特異的またはスクランブルされたsiRNAの75ピコモールを4ミリメートルのエレクトロキュベットに加え、100マイクロリットルの細胞懸濁液をそれぞれのキュベットに移します。エレクトロポレーション装置を使用してiDCを直接パルスします。エレクトロポレーション後、iDCを新鮮な事前温められたDC培地で6ウェルプレートに移し、1ミリリットル当たり100万個の細胞の最終濃度で細胞を播種し、インキュベーターに入れる。48時間後、電気ポレートされたiDcの形態を顕微鏡で調べ、次に細胞スクレーパーで細胞を収穫し、15ミリリットルのチューブに移します。0.1%EDTAを補充したPBSの1ミリリットルでウェルをすすい、それぞれのチューブに溶液を移す。次に、原稿に記載されているように、各siRNA条件に対する細胞を分割する。500,000個の細胞を使用して成熟状態と細胞生存率を評価し、ウェスタンブロット分析に100万個の細胞を使用してFIP200特異的なノックダウン効率を検証し、残りの細胞をHSV-1感染実験に使用します。生成されたiDCとmDCは、他の細胞タイプとの汚染を排除し、成熟状態を検証するために、フローサイトメトリーによって平定的に分析されました。細胞をCD3およびCD14抗体で染色し、それぞれT細胞および単球汚染を排除した。細胞は、DCの高発現一般マーカーとして機能するCD11cについて染色した。成熟したDCで成熟状態を評価するために、CD80、CCR7、CD83、およびMHCII抗体が使用されました。HSV-1を発現するEGFPによる感染を判定するために蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーを用いた。強いGFP信号は、iDCとmDCのほぼ完全な感染を示します。ウェスタンブロット分析は、SPAUTIN-1またはバフィロマイシンA1がHSV-1感染細胞のオートファジーフラックスを阻害するかどうかを判断するために使用した。iDCでは、オートファジーフラックスは、それぞれspautin-1およびbafilomycin A1の不在時のP62およびLC3B発現の低下によって示される。対照的に、spautin-1の不在時のmDCのHSV-1感染はP62発現に影響を及ぼさないが、spautin-1およびBA1治療はオートファジーの誘導を反映するLC3B-IIの蓄積を誘発したが、mDCにおけるオートファシー回転率の障害である。siRNAエレクトロポレーションを用いてFIP200タンパク質レベルを低下させることも、HSV-1感染iDCのオートファジーフラックスの強い減少を引き起こす。オートファジーの阻害のためのこのsiRNAベースのエレクトロポレーションプロトコルは、細胞の生存率、画像表現型またはiDCにおけるHSV-1タンパク質発現の確立に影響を与えません。当社のエレクトロポレーションプロトコルは、疾患やその他の一次細胞タイプに明確なDNAまたはRNA種を送達する機会を提供します。その後、様々な分子、機能、および感染解析を行うことができます。siRNAベースの疾患の発現サイレンシング戦略は、関心のあるタンパク質の機能を探求する道を開き、その後の機能アッセイと組み合わせる。

sirna-electroporation-to-modulate-autophagy-herpes-simplex-virus-type

Research

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Immunology and Infection

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編集を表す DNA エピゲノム強力な治療アプローチを対象としました。このプロトコルは、生産、精製、ひと誘導多能性幹細胞 (こと) のエピゲノム編集アプリケーションに CRISPR dCas9 DNMT3A 遺伝子をかくまっているオール ・ イン ・ ワン...

レンチウイルスベクター人間にエピゲノム編集ツールの効率的な配信用誘導多能性幹細胞由来の疾患モデル

本研究では、特定のshRNAを使用して、PERK経路の2つの下流シグナル伝達成分である細胞保護カルシニューリンとアポトーシス促進型CHOPの発現をノックダウンします。反対に、これらは小胞体ストレスの誘導後の神経突起萎縮に対する初代皮質ニューロンの感受性を調節する。...

小胞体ストレスニューロンにおけるレンチウイルス送達特異的shRNAによる分子調節

免疫蛍光染色中のチラミドシグナル増幅により、HSV-1感染後のZBP1誘発ネクロトーシス中のリン酸化RIPK3およびMLKLの高感度検出が可能になります。...

ヒト細胞におけるHSV-1感染後のRIPK3およびMLKLのZBP1依存性リン酸化の免疫蛍光染色のためのチラミドシグナル増幅

ここでは、化学的に再プログラムされた幹細胞をドーパミン作動性前駆細胞に分化させ、パーキンソン病のマウスモデルに移植し、移植された細胞の成功した統合と機能的有効性を確認するために、これらの細胞を正確なニューロン調節を達成するためのプロトコルについて説明します。...

神経変性疾患の治療における再プログラム幹細胞由来前駆細胞における化学遺伝学的制御

学ぶ単純ヘルペスウイルス1型感染樹状細胞におけるオートファジー調節法。siRNAエレクトロポレーションと阻害剤を比較し、より特異的な標的制御を実現する手法を解説します。

単純ヘルペスウイルス1型にオートファジーを調節するsiRNAエレクトロポレーション 1-感染単球由来樹状細胞

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