カーディオトキシン損傷による骨格筋再生中の衛星細胞機能の解析と生体内での自己送出型siRNAの注射

この技術は、ヘビ毒心毒毒素の筋肉内注射の組み合わせを可能にし、自己送出siRNAの筋肉内注射を行い、それによって骨格筋の再生の解析を可能にする。自己提供siRNAの適用は筋肉再生の間に単一の遺伝子の機能喪失を調査する優雅な方法であり、それによってトランスジェニック動物を避ける。足の指のピンチに対する応答の欠如を確認した後、膝から足に頭蓋下肢の注入領域を剃り、任意の緩い髪を除去します。

無菌の外科用布で覆われた見出しパッドの上に、マウスを上肢の状態に置き、70%エタノールを使用して頭蓋下肢の注入領域を消毒する。次に、29ゲージの針を装備したインスリン注射器を20マイクロモルカートキシンの50マイクロリットルでロードし、皮膚を完全に筋肉に突き刺し、膝まで遠位にします。針が所定の位置にある場合、筋の全長に沿って10〜20秒の送達期間にわたってカーディオトキシンを注入し、針を前後に動かしながら、心筋の均等な分布を可能にし、それによって脛知前筋全体を傷つける。

その後、完全な再実行まで監視と加熱パッド上のケージにマウスを戻します。手術の3日後、ちょうど実証したように注射領域を消毒する。ちょうど示したように、目的の標的遺伝子に対して向けられたsiRNAの最大50マイクロリットルを麻酔マウスの脛表筋の前筋に注入する。

その後、完全な再実行まで監視して、そのケージにマウスを戻します。負傷した筋肉組織を収集する前に、鉛筆の周りにホイルを巻き付け、カビの底が均一で閉じた表面を提供するようなテープで鉛筆を密封する。金型の準備ができたら、70%エタノールで動物全体を消毒し、足首の皮膚を除去するために余分な鋭いはさみを使用します。

筋肉を収穫する前に、細かい鉗子を使用して、負傷した脚の足首の脛骨の隣の筋膜を通して閉じた鉗子をつまみ、膝に向かって鉗子を動かして筋膜を引き裂き、脛骨前筋を露出させる。脛表筋を分離するには、遠位腱を露出し、細かい鉗子で腱をつかむ。スプリングハサミを使って腱を切り、腱の筋肉をつかんで膝に向かって筋肉を引っ張ります。

中腹領域の分析を可能にするには、ストレートハサミを使用して、ミッドベリー領域の脛石症前筋肉を同じサイズの2つの半分に切断し、鉛筆型を氷点下溶液で半分に充填します。チシアリス前筋の2つの半分を直立した位置の凍結型に挿入し、中腹領域は金型の底を向けます。鉗子を使用して、凍結金型を液体窒素の中途半端に移します。

凍結媒体が透明から白色に変化し、固体になったら、凍結金型を80°Cの冷凍庫に移すか、または将来の処理のために氷をドライに移します。対照筋肉において、組織の構造は、ミオファイバーの周囲の核の局在化、および間質空間内の単核細胞の蓄積の欠如によって観察されるように、そのまま残っている。心筋薬介在損傷の7日後、新しい筋繊維は、中央に位置する核によって特徴付けられ、主に衛星細胞からなる単核細胞の蓄積と、免疫細胞のような非起原細胞も形成される。

安静条件下では、Pax7染色で赤く示された衛星細胞は、ここに緑色で示された基底層層の下に位置しています。怪我の3日後、衛星細胞の数が増加し、衛星細胞はもはや基礎層の下に位置していません。怪我の後の10日目には、衛星の数はまだ増加しています。

さらに再生過程を解析するために、新たに形成されたミオファイバーは、発達筋に対する抗体で染色することができる。siRNAによる注入の2日後、衛星細胞は、蛍光標識されたsiRNAの存在について分析することができる。本代表的実験では、再生筋肉中の衛星細胞の約75%が、蛍光標識siRNAに陽性であった。

さらに、再生筋線維の約74%が蛍光標識siRNAについても陽性であり、再生ミオファイバーの74%がsiRNAを取り込んだか、siRNA陽性衛星細胞が融合して新しいミオファイバーを形成したか、または既存の再生マイオファイバーとの融合が起こったことを示唆している。最も重要なステップは、脛表筋の完全な傷害を達成することです。組織学的分析に加えて、生成された力などのパラメータを記録して骨格筋の再生を機能的に解析することができる。