Name: マイクロピペット吸引による電気形成による巨大ユニラメラハイブリッド小胞の閉塞と機械的性質の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 学ぶマイクロピペット吸引法による巨大ユニラメラハイブリッド小胞の膜機械特性測定。電気形成で作製した合成・天然ポリマー脂質小胞の柔軟性と不安定性を評価し、細胞膜ダイナミクスの理解に貢献します。

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著者たちは、ANRの財政支援(ANR Sysa)を感謝して認めた。

1. マイクロピペットの製造
注:ここでは、内径が6~12μmのマイクロピペットと、約3~4mmのテーパ長が必要です。マイクロピペットの製造方法の詳細な方法を以下に説明する。
<ol><li>ホウケイ酸ガラスキャピラリーをプーラーのドローバーに入れ、ノブを締めて両端を固定します。</li>
	<li>ヒーター室の側面の穴からガラスを慎重にスライドさせます。</li>
	<li>もう一方の端の締め付けノブを締めます。</li>
	<li>チップのサイズとテーパの長さを制御して、目的の仕様を実現します。そのためには、加熱温度、プル、速度、遅延、圧力などの技術的パラメータを最適化します。使用するプログラムの例を次に示します。 熱:550°C プル:10(機械の範囲:任意の単位で0-255) 速度:30(範囲:任意の単位で0-255) 遅延: 1 (範囲: 0 から 255 任意の単位) 圧力:500(範囲:任意の単位で0-999)</li>
	<li>PUL Lをクリックして、プログラムによって定義されたイベントを実行します。毛細血管は2つのマイクロピペットに分けられ、その寸法はマイクロフォージを使用して調整する必要があります。</li>
	<li>マイクロピペットをマイクロフォージの金属ピペットホルダーに挿入します(図1を参照)。10倍の目的を使用して、ピペット先端がガラスビーズ表面に近づくまで、顕微鏡ステージとピペットマニピュレータ(垂直および水平移動)を調整します。</li>
	<li>フットスイッチを押してガラスビーズを溶かします。先端を下げ、溶融ガラスビーズに合わせます。溶融ガラスは毛細血管作用によりピペットに流れ込みます。図 1の挿入に示すように、溶融ガラスのレベルが特定の高さに達するまで数秒待ちます。</li>
	<li>フットスイッチの圧力を取り除いて加熱を停止し、垂直ピペットマニピュレータを使用して先端を素早く引き離して急激なブレークを引き起こします。</li>
	<li>目的の直径(6~12μm)が得られるまで、手順1.7と1.8を繰り返します。 注:直径測定の精度を向上させるには、最後のステップで、レチクルを装備した32倍の目的を使用します。</li>
</ol>2.BSA(ウシ血清アルブミン)でピペットチップをコーティング
<ol><li>純水中に1%重量BSAを含むグルコースの0.1M溶液を調製した。<ol>
<li>180mgのブドウ糖粉末の重量を量り、15 mLポリプロピレン円錐チューブに入れ、10 mLの純水を完備した。</li>
		<li>0.1gのBSA粉末を加え、試験管回転式ミキサーを使用して溶解(約4時間)になるまで穏やかに振ります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>針を取り付けた10 mL使い捨てルアー注射器で溶液を取ります。充填したら、針を取り外し、0.22μmの酢酸セルロースフィルターを取り付けます。先端を浸すのに使用するいくつかのポリプロピレンマイクロ遠心管(1.5 mL)を充填します。</li>
	<li>毛細血管をホルダーに垂直に配置します。ホルダーを下げ、チップをブドウ糖/BSA溶液に一晩浸します。溶液は、毛細血管作用によって約1cm高く上昇する必要があります。</li>
	<li>ブドウ糖/BSA溶液からピペットチップを取り外します。0.1Mグルコース溶液(純水5mLで90mgのグルコース粉末を希釈)の5mLを調製し、0.22μmの酢酸セルロースフィルターを通して濾過する。</li>
	<li>柔軟な融合シリカキャピラリーを装備した500°Lガラスシリンジを使用して、ピペットにブドウ糖溶液を充填します。次に、すべてのグルコース溶液を吸い戻して取り除き、廃棄します(図2)。この手順を数回繰り返して、無制限の BSA を削除します。</li>
</ol>3. 電気形成によるGUVとGHUVの形成
注:電気形成は、アンジェロバ9によって開発された一般的に使用される技術です。電気形成チャンバを得る手順は、脂質またはポリマーフィルム(またはGHUV(ジャイアントハイブリッドユニラメラ小胞)の両方)を堆積させ、代替電界の下でフィルムを水和する手順を以下に説明する。得られたGUVを収集する手順についても説明する。
<ol><li>両親媒性、スクロースおよびグルコース溶液調製<ol>
<li>1mg/mLの濃度で両親媒性溶液を調製する。10mgの両親媒性物質を重量を量り、クロロホルムの10mLに溶解する。溶剤の蒸発を避けるために、溶液を密閉されたバイアルに保管してください。</li>
		<li>1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(リサミンロダミンBスルホニル)(DOPE-Rhod)のストック溶液をクロロホルム中の1mg/mLで調製する。</li>
		<li>両親媒性溶液に10μLの蛍光脂質溶液を加えます。溶剤の蒸発を避けるために、溶液を密閉されたバイアルに保管してください。</li>
		<li>スクロースとグルコース溶液をそれぞれ0.1Mの濃度で調製し、それぞれ342mgと180mgのスクロースとグルコースを調製し、純水10mLに溶解する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>電気形成室の準備 注:異なる導電性材料は、電気形成装置(例えば、白金線10、ステンレス針11)を作るために使用することができる。電気形成チャンバは、開口部を作成するために片側に切断されたOリングゴムスペーサーによって分離された2つのITOスライドで構成されています。スライドは、2本の電線を介して電圧発生器に接続されています(図3と図4A)。<ol>
<li>ITOスライドを有機溶媒(例えば、クロロホルム)で洗浄します。オームメーターを使用して導電性表面を識別します。</li>
		<li>粘着テープを使用して導電面に電線を取り付けます。</li>
		<li>両親媒性溶液沈着<ol>
<li>毛細血管作用によってレベルが上がるまで溶液中に毛細血管を浸し、溶液の約5°Lを収集します。</li>
			<li>毛細血管をITOガラス板の中心に接触させ、溶液をゆっくりと広げます。10 秒間待って、完全な溶媒蒸発を確認します (図 4A)。</li>
			<li>両側に対してこの手順を 3 回繰り返します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>開いたOリングスペーサーの両側にシリコンフリーグリースの層を追加します。堆積の領域の周りにそれを置きます。2 番目の ITO ガラスプレートの導電面をスペーサーの上部に配置します。</li>
		<li>電気形成チャンバを真空下に3時間置き、有機溶媒の痕跡を除去します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>電気形成手順<ol>
<li>電線を発電機に差し込みます。</li>
		<li>ジェネレータには次の設定を使用します。 代替弦波張力 周波数:10 Hz 振幅:2Vピークツーピーク メモ:最適な電圧周波数と持続時間は、各システムに対して見つかる必要があります。</li>
		<li>チャンバー内の溶液を注入する前に電圧が印加されていることを確認します。</li>
		<li>0.8mmの内径針を用いた注射器を使用して1mLの溶液を注入し、チャンバーを充填します。最終的な気泡を削除します。</li>
		<li>75分間、印加電圧/周波数の下のチャンバを75分間使用します(図4B)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>GUVの収穫<ol>
<li>発電機の電源を切ります。</li>
		<li>0.8 mmの内径針で1 mLシリンジを使用して、チャンバー内の気泡を生成するために溶液の小さな部分を吸引します。この気泡がチャンバー内を移動させるためにチャンバーをわずかに傾けます。これは、GUV が ITO サーフェスからデタッチするのに役立ちます(図 4C)。</li>
		<li>すべての溶液を吸い、1 mLのプラスチックチューブに移します。</li>
		<li>ワイヤーを取り外し、有機溶媒(トルエン、クロロホルム)でITOスライドをきれいにします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. マイクロマニピュレーションの設定
注:マイクロピペット吸引の原理は、うつ病を適用することによってガラスマイクロピペットを介して単一の小胞を吸引することです。ピペット内部の舌の長さは吸引圧力の関数として測定される。前述のBSAによるピペットコーティングは、小胞膜とピペットとの間の接着を防止または最小化するために不可欠です。
プロトコルを次に示します。
<ol><li>ピペットおよび水満たされた貯水池の関係 メモ:水満タンクとマイクロメータはスライディングプレートに固定されています。マイクロメータヘッド付きのデジタルカウンタは、0~2.5cmの範囲でデバイスの垂直方向の変位を可能にし、アルミニウム光学レールに沿った1μmの変位の精度を可能にし、長さ1メートルまで可能です。シリコンチューブは、貯蔵所と毛細血管ホルダーを接続します(図5A)。<ol>
<li>タンクに純水を入れます。使い捨て5 mLシリンジをシリコーンチューブを介してキャピラリーメタルホルダーに接続し、吸引してタンクからホルダーへの水の流れを作り出します。</li>
		<li>気泡を除去するためにチューブをわずかにタッチします。同時に、水タンクを上げて正の圧力を作り出します。5 mL シリンジはホルダーに取り付けられています。</li>
		<li>前に説明したコーティングおよび洗浄工程(ステップ2を参照)の後、最後に滴が形成されるまで、毛細血管にブドウ糖溶液を充填する。金属ホルダーからシリンジチューブを取り外し、端にわずかな水の流れを作ります。</li>
		<li>毛細血管を逆さまにし、グルコースドロップをホルダーからの水の流れと接続します。毛細血管とホルダーをねじ込んで固定します。</li>
	</ol></li>
	<li>ピペットを配置する 注:この操作中、水タンクは正の圧力を維持するためにアルミニウムレールにまだ置かれます。<ol>
<li>2枚のガラススライド(以前はエタノールで洗浄)を備えた自家製のアルミニウムステージを取り、両側に真空グリースで接着します。顕微鏡ステージに設置し、図5B,Cに示すように0.1Mのグルコースを含む1mLシリンジを用いて2つのスライド間にメニスカスを形成する。</li>
		<li>ピペットとそのホルダーをマイクロマニピュレータのモーターユニットに置き、クランプノブを締めます。</li>
		<li>コントロールパネルのジョイスティックを粗いモードで使用して、グルコース半月板の近くのマイクロピペットを下げます。ファインモードを使用して、先端の位置をメニスカスの中心に調整します。</li>
		<li>チップをブドウ糖に数分間浸して外面と内面を清掃します(正圧が維持されると、水の流れがピペットの内面をすすいで未塗布のBSAを除去します)。</li>
		<li>マイクロマニピュレータキーボードに先端の位置を保存し、半月板から引き出します。</li>
		<li>ブドウ糖半月板を取り除き、新鮮なものに置き換えます。20μLマイクロピペットを使用して0.1MスクロースでGUVの2μLを吸引し、新鮮なグルコースメニスカスに入れます。DICモード(差動干渉コントラスト)で、スクロース(主にGUV内部)とグルコース(主にGUVの外側)の密度の違いにより、下部に位置するGUVを観察します。</li>
		<li>小胞がわずかに膨張したら、吸引ピペットを挿入し直し、先端に焦点を合わせる。圧力がほぼ0である水タンクの高さH0を設定します。そのためには、溶液中に自然に存在する小胞または粒子を利用し、これらの粒子の動きが止まるまで水槽の高さを調整する。</li>
		<li>この時点で、水蒸発を防ぐためにメニスカスをミネラルオイルで囲み、図5Dを参照してください。 メモ:室温は、エアコンを使用して20〜22°Cの間で制御する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>マイクロピペット吸引実験<ol>
<li>ピペット先端(直径6~12μm)を下げ、小さな吸引(-1cm)を作成して小胞(直径15~30μm)を吸引します。選択した小胞の膜はわずかに変動する必要があり、目に見える欠陥(芽やフィラメントなし)を示してはならない(図6)。</li>
		<li>ピペットをより高いレベルに上げて、マイクロマニピュレータを使用して他の小胞から吸引された小胞を分離し、実験全体の間にこの位置を維持します。</li>
		<li>水満タンクを約-10cmに下げて小胞を予め応力し、その後、圧力を下げて初期値(-1cm)に戻します。この手順を数回繰り返して、膜から膜過剰および小さな欠陥を除去します。</li>
		<li>水タンクの位置によって定義される-0.5cmの高さから、マイクロメータで吸引圧力をゆっくりと下げ、膜が変動する体制に到達する。次に、圧力を上げ、先端の舌をかなりの投影長(数ミクロン)で明確に視覚化します。 注: 最も小さい膜投影長(L0)を吸い上げることができる最も低い加圧(P0)は、基準点α0(図7A)を定義します。曲線のすべての点は、この基準に従って測定されます (ΔL = L-L0および ΔP = P-P0)。</li>
		<li>マイクロメータで吸引圧力を0.5-0.8 mN/mに達するまで段階的に高めます。各ステップで、5 s を待って、舌のスナップショットを取ります。低張力でのこのプロシージャは曲げ弾性率の決定を可能にする。</li>
		<li>レール上でスライディングする水の高さを調整して、吸引圧力を0.5 mN/mから破裂張力まで上げ続けます(図7B-D)。高張力体制におけるこの実験から、領域圧縮率、溶解緊張および溶解株が測定される。</li>
		<li>有意な統計を得るために約15-20小胞を伸ばす。各マイクロピペット吸引実験は7〜10分かかります。LASAFソフトウェアを使用して、舌の投影長、小胞の直径、毛細血管の半径を測定するための画像解析を行います。</li>
	</ol></li>
	<li>曲げ弾性率、面積圧縮率、溶解張力、溶解株の測定<ol>
<li>これらのパラメータにアクセスするには、E. Evans12によって確立された形式主義を使用します。方程式 1 から膜上に適用される吸引圧力を計算します。 Δ P = εwg (h-h0) (1) ここで、gは重力加速度(9.8 m∙s−2)、εwは水の密度(ε = 1 g∙cm−3)、hは水タンクの位置、h0は圧力がゼロに等しい初期位置です。</li>
		<li>ラプラス方程式から膜張力を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq1.jpg">(2) ここでΔPはマイクロピペットの吸引圧力であり、RpおよびRvはそれぞれマイクロピペットおよび小胞半径(マイクロピペットの外側)である。膜の表面積ひずみ(α)は次のように定義されます。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq2.jpg">(3) <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq3.jpg">より低い吸引圧力の小胞の膜区域である。</li>
		<li>式412に従って毛細管先端内の小胞の投影長ΔLの増加からαを計算する: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq4.jpg">(4)</li>
		<li>非常に低い張力体制の下で、熱曲げうねりの平滑化は明らかな膨張を支配する。プロット ln(σ) と α をプロットします。低 σ 値(通常 0.001 ~0.5 mN.m-13)では、傾きが曲げ弾性率にリンクされた直線、Kb (方程式 5 の最初の項)14: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq5.jpg">(5) メモ:高張力(&gt;0.5 mN.m−1)では、膜のうulationが完全に抑制され、分子間の間隔が大きくなった結果、膜面積が増加します。この体制では、方程式5の第2項が支配し、面積圧縮率Ka (図8と図9)へのアクセスを与える。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+univalent+ions+across+the+lamellae+of+swollen+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids.</a> Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).</li>
<li>Discher, D. E., Eisenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polymer vesicles.</a> Science. 297 (5583), 967-973 (2002).</li>
<li>Hammer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymersomes%3A+vesicles+from+block+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Polymersomes: vesicles from block copolymers.</a> Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).</li>
<li>Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+polymer%2Flipid+vesicles%3A+state+of+the+art+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives.</a> Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).</li>
<li>Schulz, M., Binder, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+Hybrid+Lipid%2FPolymer+Vesicles+as+a+Novel+Membrane+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform.</a> Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).</li>
<li>Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+fluctuations+of+large+quasi-spherical+bimolecular+phospholipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+De+Physique%22%5BJournal%5D)">Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles.</a> Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).</li>
<li>Dimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+the+field+of+bending+rigidity+measurements+on+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).</li>
<li>Rodríguez-García, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymersomes%3A+smart+vesicles+of+tunable+rigidity+and+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability.</a> Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).</li>
<li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+electroformation%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discussions+of+the+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Liposome electroformation.</a> Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).</li>
<li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+properties+of+giant+polymer+and+lipid+vesicles+obtained+by+electroformation+and+pva+gel-assisted+hydration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+A%3A+Physicochemical+and+Engineering+Aspects%22%5BJournal%5D)">Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).</li>
<li>Pereno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroformation+of+Giant+Unilamellar+Vesicles+on+Stainless+Steel+Electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+omega%22%5BJournal%5D)">Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes.</a> ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).</li>
<li>Evans, E., Rawicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropy-driven+tension+and+bending+elasticity+in+condensed-fluid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes.</a> Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).</li>
<li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+phase+separation+at+the+micron+scale+and+nanoscale+in+giant+polymer%2Flipid+hybrid+unilamellar+vesicles+%28GHUVs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs).</a> Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).</li>
<li>Helfrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+properties+of+lipid+bilayers%3A+theory+and+possible+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Naturforsch+C%22%5BJournal%5D)">Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments.</a> Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).</li>
<li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+block+copolymers+and+phospholipids+to+form+giant+hybrid+unilamellar+vesicles+%28GHUVs%29+does+not+systematically+lead+to+%26%2334%3Bintermediate%27%27+membrane+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to &#34;intermediate'' membrane properties.</a> Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).</li>
<li>Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Material+Studies+of+Lipid+Vesicles+in+the+L%CE%B1+and+L%CE%B1-Gel+Coexistence+Regimes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Material Studies of Lipid Vesicles in the Lα and Lα-Gel Coexistence Regimes.</a> Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).</li>
<li>Longo, M. L., Ly, H. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLongo%2C+ML+%22Methods+in+Membrane+Lipids%22">Methods in Membrane Lipids</a>. Dopico, A. M. , Humana Press. 421-437 (2007).</li>
<li>Chen, D., Santore, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+copolymer-phospholipid+vesicles%3A+phase+separation+resembling+mixed+phospholipid+lamellae%2C+but+with+mechanical+stability+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control.</a> Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).</li>
<li>Mabrouk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+material+properties+of+giant+liquid+crystal+polymersomes%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes.</a> Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).</li>
<li>Henriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+behavior+of+membranes+with+sterols%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Universal behavior of membranes with sterols.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).</li>
<li>Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+Tension+Effect+of+Ethanol+on+Lipid+Bilayer+Rigidity%2C+Stability%2C+and+Area%2FMolecule%3A%E2%80%89+A+Micropipet+Aspiration+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule:  A Micropipet Aspiration Approach.</a> Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).</li>
<li>Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Bilayer+Thickness+on+Membrane+Bending+Rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity.</a> Langmuir. 20, 540-543 (2004).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

マイクロピペットのコーティングは信頼できる測定を得るための重要なポイントの1つである。小胞のマイクロピペットへの付着を防止する必要があり、コーティングは、BSA、β-カゼインまたはサーファシルを用いて文献17、18、19、20、21で一般的に使用される。塗布手順の詳細はめったに言及されない。
BSAの溶解は、良好な可溶化を達成するために攪拌下で少なくとも4時間行われるべきである。それにもかかわらず、濾過工程は、マイクロピペット先端を妨げる可能性のある凝集体を除去するために依然として必要である。BSAが十分に溶解しない場合、そのほとんどは濾過によって除去され、コーティングは効果がありません。理想的な濃度および溶解時間はそれぞれ0.8-1重量%および4時間である。...

リン脂質から得られる巨大小胞(リポソーム)は、1970年代から塩基性細胞膜モデル1として広く用いられている。1990年代後半には、共重合体の自己集合から得られた小胞形態は、脂質類似体2、3を参照してポリマーソームと命名され、機械的安定性が弱く、モジュラー化学機能が悪いリポソームに代わる興味深い代替手段として急速に登場した。しかし、後者は細胞膜の主成分であるリン脂質から構成されているため、細胞バイオミメティックキャラクターはリポソームに比べてかなり限定的である。さらに、膜透過性が低い場合は、膜を介した種の拡散を制御する薬物送達のような一部の用途で問題となる可能性があります。近年、ハイブリッドポリマー脂質小胞および膜を設計するブロック共重合体とリン脂質の会合は、研究の数が増加している4、5である。主なアイデアは、各成分の利点(脂質二重層の生体機能性と透過性とポリマー膜の機械的安定性および化学的多様性)を相乗的に組み合わせたエンティティを設計することです。
今日、異なる科学コミュニティ(生化学者、化学者、生物物理学者、物理化学者、生物学者)は、より高度な細胞膜モデルの開発に対する関心が高まっています。ここで、我々の目標は、可能な限り詳細に、既存の方法論(電気形成、マイクロピペット吸引)を提示し、ハイブリッドポリマー脂質巨大小胞である最近の「高度な」細胞膜モデルと巨大小胞の機械的特性を得て特徴付ける。
これらの方法の目的は、膜の領域圧縮性および曲げモジュライならびに溶解応力およびひずみの信頼性の高い測定を得るすることである。巨大小胞の曲げ剛性を測定するために存在する最も一般的な技術の1つは、直接ビデオ顕微鏡観察に基づく変動分析6、7です。しかし、これは大きな目に見える膜の変動を必要とし、厚い膜(例えばポリマーソーム)上で体系的に得られません。エリア圧縮率係数は、ラングミュア・ブロジェット技術を使用して実験的に決定できますが、ほとんどの場合、単層8上で。マイクロピペット吸引技術は1つの実験の二重層形成巨大な二重小胞小胞(GUV)の両方のモジュライの測定を可能にする。
以下の方法は、二重層を形成できるすべての両親媒性分子または高分子に対して適切であり、その結果、電気形成によって小胞が生じる。これは、電気形成の温度で二重層の流体特性を必要とします。

<table><tbody><tr><td>><<マイクロピペットの設計に必要な機器と材料></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリー</td><td>ワールド精密機器</td><td>1B100-4</td><td>の外径と内径がそれぞれ1mmと0.58mmです。</td></tr><tr><td>フィラメントは</td><td>Sutter Instrument Co.をインストールしました。</td><td>FB255B</td><td>2.5mm * 2.5mmボックスフィラメント</td></tr><tr><td>フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー</td><td>サッターインストゥルメント株式会社</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>型 Microforge</td><td>NARISHGE Co.</td><td>MF-900</td><td>2つの対物レンズ (10x と 32x)</td></tr> <tr><td>Materials with coating pipette tips with BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>10735078001</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て 1 ml シリンジ ルアーチップ</td><td>Codan</td><td>62.1612</td><td></td></tr> 使い捨て <tr><td>10 ml シリンジ Luer Tip</td><td>Codan</td><td>626616</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て可能な5つのmlのスポイト Luer Tip</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て可能なアセテートのセルロース フィルター</td><td>Cluzeauの情報のLabo</td><td>L5003SPA</td><td>毛穴のサイズ:0.22&micro;メートル、直径:25mm</td></tr><tr><td>フレキシブルフューズドシリカキャピラリーチューブ</td><td>Polymicro Technologies。</td><td>TSP530660</td><td>内径536&micro;m、外径660&マイクロ;m、</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ 500 &micro;L ルアー ロック GASTIGHT</td><td>ハミルトン シリンジ</td><td>カンパニー 1750</td><td></td></tr><tr><td>試験管回転ミキサー</td><td>Labinco</td><td>28210109</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーション セットアップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アルミニウム 光学レール、長さ 1000 mm、M4 スレッド、X48 シリーズ</td><td>ニューポート</td><td></td><td></td></tr><tr><td>減衰光学テーブル</td><td>ニューポート</td><td></td><td>顕微鏡の支持体として使用され、外部振動を防ぎます。</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP 2</td><td>モジュールユニット(X、Y、Z移動用のモーターユニット)は、アダプターを介して倒立顕微鏡に取り付けられています。</td></tr><tr><td>マイクロメータ</td><td>ミツトヨコーポレーション</td><td>350-354-10</td><td>デジマティックLCDマイクロメータヘッド 25,4 mm 範囲 0,001 mm</td></tr><tr><td>プレキシガラス水リザーバー (100 ml)</td><td>レ</td>ゾナントスキャナと水浸対物レンズ(HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I)を装備したホームメイド<td></td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5倒立共焦点顕微鏡(DMI6000)。</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X48レールキャリア80 mm長さ、1 / 4-20、8-32、4-40スレッドNewport</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ショ糖および両親媒性溶液調製用の材料<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/2oleoyl1palmitoylsnglycero3phosphocholine760082685331611" target="_blank">2-オレオイル-1-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン</a></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>VWR</td><td>22711.244</td><td></td></tr><tr><td>L-&α;-ホスファチジルエタノールアミン-N-(リサミンローダミンBスルホニル)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>810146C</td><td>ローダミンタグ付き脂質</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Electroformationセットアップ</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>10 & マイクロ;Lガラスキャピラリーリングキャップ</td><td>ヒルシュマン</td><td>9600110</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て1mlシリンジ ルアーチップ</td><td>コーダン</td><td>62.1612</td><td></td></tr><tr><td>Hグリース</td><td>アピエゾン</td><td>アピエゾンHグリース</td><td>シリコンフリーグリース</td></tr><tr><td>酸化インジウムスズコーティングガラススライド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>703184</td><td></td></tr><tr><td>針</td><td>テルモ</td><td>AN2138R1</td><td>0.8×38mm</td></tr><tr><td>オーム計(マルチメーター)</td><td>ボルトクラフト</td><td>VC140</td><td></td></tr><tr><td>トルエン</td><td>VWR</td><td>28676.297</td><td></td></tr><tr><td>電圧発電機</td><td>キーサイト</td><td>33210A</td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロピペット吸引による電気形成による巨大ユニラメラハイブリッド小胞の閉塞と機械的性質の測定

Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

リン脂質と共重合体から得られる巨大小胞は、制御および標的薬物送達、診断のためのバイオセンサー内の生体分子認識、人工細胞の機能膜、バイオインスピレーションマイクロ/ナノ反応器の開発など、さまざまな用途で利用できます。これらのすべてのアプリケーションにおいて、膜特性の特徴付けは基本的に重要である。既存の特性評価技術の中でも、E.Evansによって開拓されたマイクロピペット吸引は、領域圧縮率率、曲げ弾性率および溶解応力および歪みなどの膜の機械的特性の測定を可能にする。ここでは、脂質または共重合体(またはその両方)の薄膜から巨大小胞を得るためのすべての方法論と詳細な手順、マイクロピペットの製造および表面処理、および前述したすべてのパラメータの測定につながる吸引手順を提示する。

前述のプロトコルでは、 我々は、異なる合成巨大ユニラメラ小胞(GUV)を研究し、リン脂質から得られる:2-オレオロイル-1-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)、三重黒分子:ポリ(エチレキシド)-b-ポリ(ジメチルシロキサン)-b-ポリ(エチレオキシド)(PEO12-b-PDMS43-b-PEO12)以前の研究で合成された13、およびジブロック共重合体ポリ(ジメチルシロキサン)-b-ポリ(エチレンオキシド) (PDMS27-b-PEO17)トリブロック共重合体PEO8-b-PDMS22-b-PEO8とリン脂質POPCとの会合は、得られたGHUV(ジャイアントハイブリッドユ...

プロトコルの目的は、マイクロピペット吸引によって巨大小胞の膜機械的特性を確実に測定することである。

Giant vesicles obtained from phospholipids and copolymers can be exploited in different applications: controlled and targeted drug delivery, biomolecular ...

このプロトコルは、マイクロピペット吸引技術を用いて、合成および実ポリマー脂質小胞の膜機械的特性の信頼性の高い測定を容易にする。これは、単一の実験で評価される膜の柔軟性と不安定性を引き伸ばすことができる唯一の技術です。このプロトコルには、小胞の調製から機械的評価までの一連の手順が含まれます。忍耐強く、技術的な問題が発生したときに解決することは非常に重要です。これらの手法の視覚化は、毛細管表面を適切に処理する方法と必須のプレストレスステップを実行する方法を理解するために重要です。欠陥のない小胞を表示します。デモンストレーション手順は、ハイブリッドポリマー脂質小胞の開発に取り組んでいる研究室の博士課程の学生、マーティン・ファウキニョンです。手順を開始する前に、冷たいガラスのマイクロピペット毛細血管をホルダーに垂直に置きます。そして、先端が一晩で作りたてのブドウ糖牛血清アルブミン溶液に浸漬されるまでホルダーを下げる。翌朝までに、溶液は毛細血管作用によって先端に約1センチメートル上昇するはずです。柔軟な融解シリカ毛管を装備した500マイクロリットルガラスシリンジを使用して、各ピペットにグルコース溶液を充填します。次いで各ピペットから溶液を吸引し、ピペットを新鮮なグルコース溶液で補充する前に、すべての血清が除去されるまで数回再生する。電気構造チャンバを準備するために、まず適切な有機溶媒でITOスライドを洗浄し、オーメータで導電面を識別します。各スライドの導電性側に、粘着テープで電線を取り付けます。約5マイクロリットルの溶液が毛管作用によって回収されるまで、1本の毛細管を円形溶液に浸す。1つのガラスITOプレートの中心に接触して、そっとスライド全体に溶液を広げます。溶剤が完全に蒸発したら、ちょうど実証したように、溶液をさらに2回塗布します。堆積の領域の周りに開いたOリングスペーサーの両側にシリコンフリーグリースの層を追加する前に。次に、スペーサーの上部に第2のITOガラス板の導電面を置き、電気構造チャンバを真空下に3時間置き、有機溶媒の痕跡を除去する。ジャイアントユニラメラベシクルの電気構造のために、発電機に電線を差し込みます。ジェネレータ周波数を10ヘルツに、振幅を2ボルトに設定し、ピークをピークにします。電圧が設定されたら、0.8ミリメートルの内径の針を装備したシリンジを使用して0.1モルショ糖溶液を1ミリリットル注入し、適用された電圧と周波数の下に75分間チャンバーを残します。電気の終わりに、発電機をオフにします。そして、空気泡がチャンバー内で生成されるまで、溶液の少量を吸引するために1ミリリットルのシリンジを使用してください。チャンバーに泡を移動し、小胞がスライド表面から切り離されるのを助けるために、チャンバーをわずかに傾けます。そして、溶液の全容を注射器に吸引する。次いで、ベシクル溶液を1ミリリットルのプラスチックチューブに移します。マイクロマニピュレーション用の材料を設定するには、吸引して水の流れ、純水のタンクを1つのホルダーに作り出す。そして、任意の気泡を排除し、陽圧を作成するために、タンクを上げながら軽くタップします。先端に滴が形成されるまで、新鮮なグルコース溶液で血清コーティング毛細管を充填します。金属ホルダーからシリンジチューブを取り外してホルダーの端にわずかな水の流れを作り、キャピラリーを逆さまにしてグルコースドロップを水の流れに接続します。次に、キャピラリーとホルダーを一緒にねじ込みます。ピペットを配置するには、カスタムメイドのアルミニウムステージから2つのガラススライドを真空グリースと一緒に接着します。そして顕微鏡の段階にスライドを取付ける。1ミリリットルのピペットを使用して、0.1モルグルコースで2つのスライド間に半月板を形成する。ピペットとそのホルダーをマイクロマニピュレーターのモーターユニットに置きます。クランプノブを締め、コントロールパネルのジョイスティックを粗いモードで使用します。グルコース半月板付近のマイクロピペットを下げます。細かいモードを使用して、半月板の中心に先端の位置を調整します。先端をブドウ糖に浸して、その外面と内面をきれいにします。数分後、半月板から毛細血管を引き出し、ブドウ糖を新鮮な半月板に置き換えます。0.1モルショ糖のジャイアントユニラメラベシクルの2マイクロリットルを20ミリリットルのマイクロピペットチップに吸引する。半月板に小胞を導入します。顕微鏡を使用して、スライドチャンバーの底部の小胞を観察します。小胞がわずかに収縮したら、吸引ピペットを再挿入し、ピペットの先端に焦点を当てます。次に、水タンクのベースライン高さを、パーティクルの運動が停止する圧力に設定します。蒸発を防ぐためにミネラルオイルで半月板を囲みます。マイクロピペット吸引実験を行うために、ピペットチップを半月板に下げる。小胞を吸引するために少量の吸引圧力を作成します。選択された小胞の膜はわずかに変動する必要があり、目に見える欠陥を提示すべきではありません。マイクロマニピュレーターを使用してピペットを高いレベルに上げて、吸引した小胞を他の小胞から分離します。水槽を約10センチメートルに下げて小胞をプレストレスしてから、タンクを上げて圧力を初期値に戻します。0.5センチメートルの高さから、膜が変動する圧力に達するまで、ゆっくりと吸引圧力を下げます。次に、圧力を高くして、先端の舌を明確に視覚化し、数ミクロンの投影長を示す。曲げ弾性率を決定するには、吸引圧力を段階的に1マイクロメートルずつ増加させる。1メートル当たり0.5〜0.8ミリニュートンに達するまで。5秒待って、各ステップの後に舌のスナップショットを撮る。面積圧縮率を決定するために、溶解の緊張とひずみは、破裂緊張に達するまで1メートル当たり0.5ミリニュートンから吸引圧力を増加させ続ける。この代表的な実験では、POPCの領域圧縮率と溶解株は、文献から期待されるものと完全に一致していた。この表では、得られたポリマーソームの典型的な値が観察できる。なお、ジブロックコポリマーから得られる膜の靭性は、三重重合体から得られるものよりもはるかに大きい。興味深いことに、ジブロックコポリマーを使用して、リポソームについて測定したものよりも強靭性を発揮するジャイアントハイブリッドユニラミラー脂質ポリマーベシクルを得ることができる。このプロトコルは、例えば、アマティックショックを通して膜の透過性を測定するために、ピペットでベシクルを測定するのに役立ちます。特にトリビューン接続を設定する際には、各ステップを厳格かつ正確に完了してください。この技術は、改変小胞の主な境界での線張力の測定を通じて、膜分裂の物理的起源を理解するために利用されてきた。

obtention-giant-unilamellar-hybrid-vesicles-electroformation

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

定義されている物の巨大リポソームに機能的な膜タンパク質を再構成すると、パッチクランプ電気生理学と組み合わせた強力なアプローチである。しかし、従来の巨大リポソーム生産は、タンパク質の安定性と互換性がないかもしれません。私たちは純粋な脂質やイオンチャネルを含む小さなリポソームから巨大リポソームを製造するためのプロトコルを記述します。...

イメージングとパッチクランプ電気生理学用ジャイアントリポソーム製剤

液滴界面の脂質二重層に対するマイクロ流体噴射は、膜の非対称性、膜貫通タンパク質の取り込み、および材料のカプセル化を制御して小胞を生成するための信頼できる方法を提供します。この技術は、区画化された生体分子が所望される生体系の様々な研究に適用することができる。...

マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

電鋳し、ゲル支援腫れ - 巨人層小胞（GUVs）に貫通タンパク質、KvAPの再構成は、2脱水 - 再水和法について実証されている。両方の方法では、タンパク質を含む小さな単層小胞を蛍光顕微鏡法およびパッチクランプ電気生理学によって研究することができるGUVsを形成するために一緒に融合される。...

膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、KvAP、

私たちは、原子間力顕微鏡と力分光法を使用して、支持脂質二重膜の調製とその特性評価のためのプロトコルを記述します。...

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

蛍光顕微鏡による監視対称および非対称のソリューションの条件下での荷電ベシクルの相挙動

多くのタンパク質の細胞感覚し、膜の曲率を誘発します。湾曲した膜体外タンパク質または任意曲率活性分子の相互作用を研究する脂質小胞から膜ナノチューブをプルする方法について述べる。...

巨大リポソームの膜カーボンナノ チューブを引っ張ってください。

ローカライズされたカルシウム イオン勾配を使用して小胞の非接触マイクロマニピュレーション用手法を提案します。巨大な脂質ベシクルの近くのカルシウム...

ローカライズされたカルシウム イオン勾配に対応した膜小胞の膜を改造

このプロトコルは、ユニ脂質および多脂質小胞、支持脂質二重層、および懸濁された脂質二重層を模倣する細胞の形成を記述する。これらの in vitro モデルは、様々な脂質タイプを組み込むために適応することができ、様々な分子および高分子相互作用を調査するために使用することができる。...

分子相互作用研究のための細胞模倣支援及び懸濁脂質二重層モデルの組み立て

この記事では、小胞内構造を持ち、内側、環状、および外側の領域で電気伝導性がカスタマイズされた化合物ジャイアントユニラメラベシクル(cGUV)を調製する方法を紹介します。電気形成は単純なGUVを合成し、浸透圧ショックによって気孔細胞やcGUVに変換されるため、有核細胞の生物物理学を研究するための貴重なモデルを提供します。...

化合物巨大ユニラメラ小胞の合成:核細胞の生体模倣モデル

この初心者向けガイドでは、液滴移動法による巨大単層小胞(GUV)の調製に関する一般的なプロトコルを紹介し、重要なステップについて説明し、合成生物学やマイクロロボティクスなどのさまざまな用途に必要な調整に役立つ洞察を提供します。...

液滴移動法による巨大単層小胞の確実な作製

学ぶマイクロピペット吸引法による巨大ユニラメラハイブリッド小胞の膜機械特性測定。電気形成で作製した合成・天然ポリマー脂質小胞の柔軟性と不安定性を評価し、細胞膜ダイナミクスの理解に貢献します。

マイクロピペット吸引による電気形成による巨大ユニラメラハイブリッド小胞の閉塞と機械的性質の測定

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