Name: マイクロ流体チップを使用した決定論的方法で単一細胞ベースの共培養を確立する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 学ぼうマイクロ流体チップを用いた単一細胞共培養法。PDMSデバイスで高効率に細胞を捕獲し、動的イメージングで細胞間相互作用をリアルタイムに追跡する手法です。細胞生物学研究に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、科学技術省(105-2628-E-400-001-MY2)の助成金と、組織工学・再生医療の博士課程、国立中成大学、国立衛生研究所の助成を受けて行われました。

1. 柔らかいリソグラフィーによるウエハ金型の製造
注: マスク パターン データは、以前のパブリケーション14で使用できます。
<ol><li>4インチのシリコンウェーハを120°Cのオーブンで15分間脱水します。</li>
	<li>SU-8 2陰性フォトレジストのスピンコート4gを1,000rpmの4インチシリコンウエハに30sで取り付け、5μmの厚い層(層#1)を作成します。</li>
	<li>柔らかいベーク層は65°Cのホットプレートに1分間#1し、その後3分間95°Cのホットプレートに#1層を移します。</li>
	<li>室温に#1する層を冷やし、半自動マスクアライナーのホルダーの上に置き、クロムメッキフォトマスク(キャプチャサイト層)#1層に合わせます。</li>
	<li>150 mJ/cm2の用量で365 nmの紫外線が付いている#1の層を露出させる。</li>
	<li>アライナーから層#1を取り出し、65°Cのホットプレートで1分間焼く後焼き#1、95°Cのホットプレートに1分間移します。</li>
	<li>室温に#1涼しい層。プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート溶液に浸漬し、架橋されていないフォトレジストを2分間洗い流し、窒素ガスで穏やかに乾燥し、アライメントマーク#1層を明らかにする。</li>
	<li>粘着テープで層#1アライメントマークを覆い、SU-8 10陰性フォトレジストのスピンコート4gを30sの1,230 rpmで層#1上にスピンコートし、25μmの厚い層#2を作成する。</li>
	<li>65°Cホットプレート上のテープ、ソフトベーク層#2を3分間取り出し、#2層を95°Cのホットプレートに7分間移します。</li>
	<li>室温に#2層を冷却し、半自動マスクアライナーのホルダーに#2層を配置し、層#2クロムメッキフォトマスク(バイパスチャネルレイヤー)をアライメントマーク#1レイヤーに位置合わせします。</li>
	<li>200 mJ/cm2の線量で365 nmの紫外線が付いている#2の層を露出させる。</li>
	<li>アライナーから層#2を取り出し、65°Cのホットプレートで1分間焼き、#2層を95°Cのホットプレートに3分間移します。</li>
	<li>室温に#2層を冷却し、粘着テープで層#1アライメントマークを覆う。SU-8 2050陰性フォトレジストのスピンコート4gを30sの1,630 rpmで#2層上に#3。</li>
	<li>テープ、柔らかいベーク層を65°Cのホットプレートに5分間#3取り外し、#3層を95°Cのホットプレートに20分間移します。</li>
	<li>室温に#3する層を冷却し、半自動マスクアライナーのホルダーに#3層を置き、層#3クロムメッキフォトマスク(培養室層)をアライメントマーク#1層に合わせます。</li>
	<li>240 mJ/cm2の用量で365 nmの紫外線と#3層を露出させる。</li>
	<li>アライナーから#3層を取り出し、65°Cのホットプレートで5分間焼く後焼き#3、95°Cのホットプレートに10分間移します。</li>
	<li>室温に#3層を冷やします。プロピレングリコールモノメチルエーテルエーテル酢酸溶液に浸漬し、架橋されていないフォトレジストを10分間洗い流し、窒素ガスで穏やかに乾燥させます。</li>
</ol>2. 複数の単一セルキャプチャのためのPDMSデバイスの準備
<ol><li>100μLのトリクロロシランを含むウエハ金型と計量皿をデシケータ(サイラ化のみ)に入れ、真空(-85kPa)を15分間塗布します。 注:ウェーハ表面をトリクロロシランでシラミ化し、PDMS鋳造の前に疎水性表面特性を作成し、ウエハPDMS金型から簡単に剥離できるようにします。</li>
	<li>真空を停止し、少なくとも1時間37°Cでデシケータ内のウエハ金型をシラン化します(シラン化のみ)。</li>
	<li>PDMSベースとPDMS硬化剤を10:1の比率で混合します。15cmの皿でウエハ型に合計20gの混合PDMSを注ぎます。</li>
	<li>15cmの皿をデシケータに入れ、真空(-85 kPa)を1.5分間塗布します。その後、デシケータから15センチの皿を取り出します。室温で20分間保管してください。最後に、窒素ガスでPDMSの残留気泡を除去します。</li>
	<li>15 cmの皿を65°Cのオーブンに入れ、PDMSを治すために2-4時間。</li>
	<li>ウェーハ金型からPDMSレプリカを取り外し、内径1.5mmと内径0.5mmのパンチャーを使用して、PDMSに1.5mmの入口と0.5mmの出口をパンチします(図1C)。</li>
	<li>PDMSレプリカとスライド面を取り外し可能なテープで清掃し、表面を酸素プラズマ(14秒100W)で処理します。</li>
	<li>PDMS レプリカをスライドに手動で合わせて配置し、互いに接触させます。</li>
	<li>PDMSスライドを65°Cのオーブンに1日置きます。 注: スライドと PDMS レプリカの間の永続的な結合が実現され、デバイスが形成されます。</li>
	<li>PDMSデバイスをリン酸緩衝生理食べ物で満たされた容器に浸し、デシケータに入れます。その後、気泡を除去するために15分間真空(-85 kPa)を適用します。</li>
	<li>PDMSデバイスを細胞培養フードに入れ、UV光(光波長:254nm)で30分間デバイスを殺菌します。</li>
	<li>PDMSデバイスバッファを媒体(1%の抗生物質および10%の胎児ウシ血清を含むDMEM-F12基底媒体)に置き換え、1日4°CでPDMS装置をインキュベートする。これにより、セルが PDMS サーフェスに付着するのを防ぐことができます。</li>
</ol>3. 単細胞懸濁液の調製
注:細胞型は、ヒトリンパ内皮細胞(LEC)、WNT5B特異的shRNA(WNT5B sh4)およびベクターコントロール(pLKO-GFP)を発現するヒトOSCC TW2.6細胞を含む15。詳細な栽培手順については、前回の出版物をご覧ください。
<ol><li>細胞が70〜80%の合流を達成したときに培養培地を除去する。その後、無菌PBSの5 mLで細胞を3回静かに洗浄します。</li>
	<li>1 μM蛍光色素を含むDMEM-F12培地をWNT5B sh4およびpLKO-GFP細胞(LECにMV2培地を使用)に加え、室温で30分間細胞をインキュベートします。 注:LECは緑色クロロメチルフルオレセインジアルセイン(CMFDA)色素で染色し、WNT5B sh4細胞は青色7-アミノ-4-クロロメチルクマリン(CMAC)色素で染色し、pLKO-GFP細胞は赤色の黄斑色色で染色した。</li>
	<li>無菌PBSの5 mLで細胞を3回ゆっくり洗います。</li>
	<li>PBSを取り外し、0.25%トリプシン-EDTA(0.05%トリプシン-EDTA)の2 mLを追加します。</li>
	<li>室温で4分間細胞をインキュベートし、組織培養皿を軽くタップして細胞剥離を促進します。</li>
	<li>WNT5B sh4およびpLKO-GFP細胞を分散させるためにDMEM-F12培地を4mL添加する(LECの場合はMV2培地3mL、トリプシン中和液1mLを使用)。次いで細胞を15mLチューブに移し、遠心分離機を3分間300xgで遠心分離する。 </li>
	<li>上清を取り出し、DMEM-F12培地の1mLで細胞ペレットを静かに再不通する。標準的なトリパンブルー排除方法16を使用して、ヘモサイトメーター内の生細胞数をカウントする。DMEM-F12培地中に3 x 105細胞/mL濃度で1mLの細胞懸濁液を調製し、細胞凝集を防ぐために氷の上に細胞を保ちます。 注:単一細胞捕捉効率を向上させるためには、十分に解離された単一細胞懸濁液の慎重な準備が必要です。</li>
</ol>4. 複数の単一細胞捕捉とトリプルシングルセル培養
<ol><li>デバイスの出口とシリンジポンプの間にポリテトラフルオロエチン(PTFE)チューブを接続します。培地を取り出し、3 x 105セル/mLの濃度で1 μLの細胞懸濁液をPDMS装置の入り江に加える。</li>
	<li>0.3 μL/minの流量でシリンジポンプによって装置に細胞懸濁液をロードする(図2A)。流れ方向は、入口から出口までです。 注:細胞の堆積を防ぐために、入り込みに細胞懸濁液を追加した直後にロードします。</li>
	<li>ステップ4.2の後にPDMSデバイスの入り江にDMEM-F12培地の1 μLを追加し、DMEM-F12培地を0.3 μL/minの流量でシリンジポンプでデバイスにロードします(図2B)。流れ方向は入口から出口に流れていた。</li>
	<li>DMEM-F12培地の0.3 μLを10 μL/minの流量でシリンジポンプで装置に積み込みます(図2C)。流れ方向は出口から入口に流れていた。</li>
	<li>他のセルタイプをデバイスに読み込むには、手順 4.1 ~ 4.4 を繰り返します。</li>
	<li>細胞捕捉を完了した後、4倍のレンズを持つ顕微鏡を使用して、各培養室を画像化します。 注:細胞の蛍光放出は、各培養室内の個々の細胞数を同定し、カウントするために使用された。</li>
	<li>PTFEチューブを取り外し、入口と出口をポリオレフィンテープで密閉し、密閉培養システムを作成します。</li>
	<li>PDMS デバイスを 10 cm 培養皿に移動し、デバイスからの媒体の蒸発を避けるために、PDMS デバイスの周囲に 10 mL の滅菌 PBS を追加します。</li>
	<li>培養皿をインキュベーター(37°C、5%CO2および95%湿度)に移し、3倍の単細胞培養を行います。</li>
	<li>顕微鏡で細胞の成長を12時間ごとに観察し、写真を撮る。</li>
</ol>

<ol><li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+systems+and+technologies%3A+taking+synthetic+biology+to+the+next+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society%2C+Interface%22%5BJournal%5D)">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065(2014).</li>
<li>Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Poisson+distribution+and+beyond%3A+methods+for+microfluidic+droplet+production+and+single+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).</li>
<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456, 804(2008).</li>
<li>Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+manipulation+and+analysis+using+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).</li>
<li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li>
<li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Single-Cell+Trapping+And+Imaging+Using+Microwell+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li>
<li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+platform+for+stem+cell+niche+co-cultures+and+downstream+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 340(2015).</li>
<li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li>
<li>Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li>
<li>Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+droplet-based+co-encapsulation+and+pairing+of+microparticles+via+active+sorting+and+downstream+merging%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+single+cell+co-culture+microenvironments+isolated+by+two-phase+flow+with+continuous+nutrient+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal.</a> Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).</li>
<li>Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li>
<li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+TCR+T+cell+screening+using+single-cell+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).</li>
<li>He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+shuttling+for+deterministic+high-efficiency+multiple+single-cell+capture+in+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip.</a> Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).</li>
<li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+cell-derived+WNT5B+modulates+in+vitro+lymphangiogenesis+via+induction+of+partial+endothelial-mesenchymal+transition+of+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells.</a> Oncogene. 36, 1503(2016).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li>
<li>Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer-a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li>
<li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).</li>
<li>Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microfluidic+co-culture+system+for+investigation+of+bacterial+cancer+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting.</a> Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).</li>
</ol>

著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。

腫瘍微小環境における様々な細胞間相互作用は、腫瘍17の進行において重要な役割を果たす。細胞相互作用のメカニズムを理解するために、共培養システムは一般的な分析方法として使用される。しかし、複数の細胞型と細胞自体の不均一性は、実験的な複雑さと分析上の困難を引き起こしています。
流体力学シャトルチップは、希釈法およびマイクロウェルプラットフォームにおけるポアソン分布制限に制限されることなく、確定的な方法によって培養室内の複数の単一細胞負荷を可能にする。高い三重単細胞捕捉効率(45%を超える、ポアソン分布法は5%)培養室では、細胞増殖と増殖に十分な空間があることを実証する(図4)。簡単なセットアップとプロトコルで複数の単一細胞捕捉とライブ細胞培養観察を効率的に実行する能力により、これらのマイクロ流体デバイスは、セルセルを含む幅広いアプリケーションに役立つツールとして考えています。複数の細胞間の相互作用18, 薬物スクリーニング<sup ...

異なるタイプの単一細胞の効率的な捕捉と十分な培養空間の提供は、複数のタイプの単一細胞1の単一細胞共培養実験に必要である。希釈を制限することは、必要な機器の低コストのために、このような実験のために単一細胞を調圧するために最も一般的に使用される方法です。しかし、ポアソン分布の制限により、最大単一細胞獲得確率はわずか37%であり、実験操作は手間と時間のかかる2を作る。これに対し、蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いることは、単一細胞3を高効率に調製するポアソン分布の限界を克服できる。ただし、高額な計装費やメンテナンスコストにより、一部のラボではFACSにアクセスできない場合があります。微細加工デバイスは、最近、単一細胞トラッピング4、単一細胞ペアリング5、および単一細胞培養用途用に開発された。これらの装置は、単一細胞6を正確に操作する能力、ハイスループット実験を行う、またはサンプルおよび試薬の消費量を減らす能力に基づいて有利である。しかし、現在のマイクロ流体デバイスを用いて複数の細胞型を用いて単一細胞共培養実験を行うことは、ポアソン分布1、7、8、または不能の制限のために依然として困難である。2種類以上の単一セル4、5、6、9、10をキャプチャするデバイス。
例えば、ユンらは細胞相互作用研究11のためのマイクロ流体装置を報告した。この装置は1つの部屋の細胞を対一にするために確率的な方法を使用する。ただし、デバイス構造の幾何学的制限により、2 つの異なるセル タイプのペアリングのみが実現できます。Leeらからの別の報告は、単一細胞12を捕捉し、対にする確定的方法を実証した。この装置は、確定的方法によってペアリング効率を高めるが、細胞のペアリングに必要な長時間の操作時間によって制限される。具体的には、第2の細胞捕捉は、24時間後に最初に捕捉された細胞が表面に取り付けられた後にのみ行うことができる。液滴系マイクロ流体装置は依然としてポアソン分布に限定されており、非接続細胞でのみ使用でき、栽培過程で培養液を変更することはできないことが分かります。
以前は、決定論的な流体力を利用して複数のタイプの単細胞を培養室に捕捉し、その後細胞共培養実験を行って分析できるマイクロ流体「流体力学シャトルチップ」を開発しました。細胞相互作用における個々の細胞移動行動14.流体力学シャトルチップは、それぞれが蛇行バイパスチャネル、キャプチャサイト、および培養室を含むユニットの配列セットで構成されています。蛇行バイパスチャネルと培養室との間の流れ抵抗の差を使用することにより、特別に設計された操作手順により、異なるタイプの単一細胞を培養室に繰り返し捕捉することができる。特に、培養室の十分なスペースは、細胞の捕捉中に細胞がフラッシュされるのを防ぐだけでなく、細胞が広がり、増殖し、移動するのに十分なスペースを提供し、生きている単一細胞相互作用を観察することを可能にする。この記事では、このデバイスの生産と詳細なプロトコル手順に焦点を当てます。

<table><tbody><tr><td>3M 高度なポリオレフィン診断マイクロ流体医療テープ</td><td>3M 会社</td><td>9795R</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質</td><td>Biowest</td><td>L0014-100</td><td>グルタミン - ペニシリン - ストレプトマイシン</td></tr><tr><td>AutoCAD ソフトウェア</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD LT 2011</td><td>部品番号 057C1-74A111-1001</td></tr><tr><td>CellTracke Blue CMAC 染料</td><td>Invitrogen</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA 染料</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>コンベンショナルオーブン</td><td>YEONG-SHIN company</td><td>ovp45</td><td></td></tr><tr><td>デシケーター</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42020-0000</td><td>省スペース 真空デシケーター 190 mm ホワイトベース</td></tr><tr><td>DiIC12(3) 細胞膜色素</td><td>BD Biosciences</td><td>354218</td><td>細胞トラッカーとして使用</td></tr><tr><td>DMEM-F12 培地</td><td>Gibco</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞増殖培地 MV 2</td><td>PromoCell</td><td>C-22022</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 Hyclone</td><td>Thermo</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 700 シリーズ ガラスシリンジ ( 0.1 ml )</td><td>Hamilton</td><td>80630</td><td>100 &micro;L、モデル710 RN SYR、小型リムーバブルNDL、22s ga、2インチ、ポイントスタイル2</td></tr>ハリ<tr><td>スユニコアパンチャー</td><td>テッドペラ株式会社</td><td>15075</td><td>内径1.5mmハリ</td></tr><tr><td>スユニコアパンチャー</td><td>テッドペラ社</td><td>15071</td><td>内径0.5mmホット</td></tr><tr><td>プレート</td><td>YOTEC社</td><td>YS-300S</td><td></td></tr><tr><td>Msakアライナー</td><td>Deya Optronic CO.</td><td>A1K-5-MDA</td><td></td></tr><tr><td>酸素血漿</td><td>ノードソン マーチ</td><td>AP-300</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>ノードソン</td><td>AP-300</td><td>ベンチトップ プラズマ処理システム</td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン (PDMS) キット</td><td>ダウ コーニング</td><td>シルガード 184</td><td></td></tr><tr><td>ポリテトラフルオロエテン (フッ素樹脂)</td><td>エバーシャープテクノロジー株式会社</td><td>TFT-23T</td><td>内径0.51mm、外径0.82mm</td></tr><tr><td>リムーバブルテープ</td><td>3M社</td><td>スコッチリムーバブルテープ 811</td><td></td></tr><tr><td>シリコンウェーハ</td><td>エルテック社</td>製 <td>SPE0039</td><td></td></tr><tr><td>スピンコーター</td><td>シンレックス(株)</td><td>SC-HMI 2インチ ~ 6インチ</td><td></td></tr> <tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td>ライカ E24</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 10 ネガ型フォトレジスト</td><td>MicroChem</td><td>Y131259</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2 ネガ型フォトレジスト</td><td>MicroChem</td><td>Y131240</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050 ネガ型フォトレジスト</td><td>MicroChem</td><td>Y111072</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 開発元</td><td>グランドケミカルカンパニー</td><td>ズGP5002-000000-72GC</td><td>プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>ハーバード</td><td>703007</td><td></td></tr><tr><td>装置トリクロロシラン</td><td>Gelest、Inc</td><td>SIT8174.0</td><td>トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル。危険な。気道を腐食し、水と激しく反応します。</td></tr><tr><td>トリプシン中和剤溶液</td><td>Gibco</td><td>R-002-100</td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロ流体チップを使用した決定論的方法で単一細胞ベースの共培養を確立する

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

細胞共培養アッセイは、がんを含む疾患の生物学をよりよく理解するために、異なる細胞タイプ間の細胞間相互作用を研究するために広く使用されてきました。しかし、細胞亜集団の不均一性が平均値によって不明瞭であるため、従来の共培養システムを用いた高度異種細胞集団における細胞間相互作用の複雑なメカニズムを明らかにすることは困難である。従来の共培養システムは、集団信号を記述するためにのみ使用できますが、個々の細胞の挙動を追跡することはできません。さらに、従来の単細胞実験法はポアソン分布により細胞操作の効率が低い。微細加工デバイスは、単一細胞研究のための新しい技術であり、高スループットで単一細胞を正確に操作でき、サンプルおよび試薬の消費量を削減できるためです。ここでは、複数の単細胞共培養に対するマイクロ流体チップの概念と応用について述べている。このチップは、培養室内の複数のタイプの単一細胞を効率的に捕捉できる(~46%)単一細胞レベルでの細胞相互作用下での細胞の挙動(例えば、移動、増殖など)を研究するのに有用な十分な培養空間を有する。リンパ内皮細胞と経口扁平上皮癌は、複数の単細胞相互作用研究のためのマイクロ流体プラットフォーム上で単一細胞共培養実験を行うために使用された。

このデバイスは、切断されたPDMS装置の断面写真に示すように3層構造を有する(図1A)。最初の層には、培養室とバイパスチャネルを接続するキャプチャサイト(幅6.0 μm、高さ4.6μm)が含まれています。培養室とバイパスチャネルの間の流れ抵抗の違いにより、細胞は捕捉位置に流れ込み、小さな経路の入り口を埋めます。セルがキャプチャ位置でキャプチャされると、小さなパスの流れ抵抗が増加し、次の着信セルが次のダウンストリーム キャプチャ サイトに向かってバイパス チャネルに向かって移動します。第2層のバイパスチャネル(幅25.0μm、高さ26.4μm)の蛇行設計は、その流れ抵抗を高めるために使用されます。第3層(直径500.3μm、高さ111.3μm)の培養室の寸法は、細胞培養実験に十分なスペースを提供し、細胞がチャンバから洗い流されないようにチャンバ内の流量を減らすように設計されています。
<p class="jove_content" fo:keep-together.with...

本報告では、複数の単一細胞の高効率ペアリングと顕微鏡解析を実現する単一細胞培養実験を設定するマイクロ流体チップベースの方法について説明する。

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

細胞の挙動に対する細胞間相互作用の影響を理解するために、キャプチャ効率と動的なライブ細胞画像観察を効果的に組み合わせることが重要です。このチューブは、より大きなチャンバ内の複数の単一細胞を非常に効率的に捕捉し、十分な培養ベースを提供し、複数の単一細胞相互作用行動の動的追跡を行うことができます。PDMS デバイスを準備して開始します。100マイクロリットルのトリクロロシランを付した計量皿にウエハーモールドをデシケータに入れ、15分間真空を塗布します。真空を止め、デシケータのウエハーモールドを37°Cで少なくとも1時間はアルカリ化します。PDMSベースとPDMS硬化剤を10対1の比率で混合し、15センチメートル皿のウエハーモールドに合計20グラムの混合物を注ぎます。15センチメートルの皿をデシケータに入れ、1分半真空を塗ります。次に、デシケータから皿を取り出し、窒素ガスを用いてPDMS内の残留気泡を除去します。2〜4時間摂氏65度のオーブンに皿を置くことによってPDMSを治します。完了したら、ウエハ金型からPDMSレプリカを取り出し、PDMS上で1.5ミリメートルの入口と0.5ミリメートルの出口をパンチします。PDMSレプリカとスライド面を取り外し可能なテープでクリーニングします。酸素プラズマで表面を処理します。次に、PDMS レプリカをスライドに手動で合わせて、相互に接触させます。PDMSスライドを65度の摂氏オーブンに1日放置します。翌日、PDMSデバイスをPBSで満たされた容器に浸します。デシケータに入れ、15分間真空を適用します。装置を細胞培養フードに移し、30分間UV光で殺菌します。PDMSデバイスバッファを培地に交換し、摂氏4度で1日インキュベートします。細胞が70〜80%の合流性を達成したら、培養培地を取り除き、5ミリリットルのPBSで3回軽く洗います。1つのマイクロモル蛍光色素を含むDMEM/F-12培地をWNT5B sh4およびpLKO-GFP細胞に1ミリリットル加え、室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、5ミリリットルの滅菌PBSで細胞を3回静かに洗浄し、PBSを取り除き、0.25%トリプシン-EDTAの2ミリリットルを加えます。室温で4分間細胞をインキュベートし、培養皿を軽くタップして細胞剥離を促進します。WNT5B sh4およびpLKO-GFP細胞を分散させるためにDMEM/F-12培地を4ミリリットル加え、細胞を15ミリリットルチューブに移し、300 xgで3分間遠心分離します。上清を取り除き、DMEM/F-12培地の1ミリリットルで細胞ペレットを静かに再中断します。1ミリリットル当たり10~5番目の細胞の濃度で1ミリリットルの細胞懸濁液を調製し、氷の上に保管して細胞凝集を防ぎます。デバイスの出口とシリンジポンプの間にポリテトラフルオロエチレンチューブを接続します。培地を取り出し、調製したセル懸濁液の1マイクロリットルをPDMS装置の入口に加える。次に、1分間に0.3マイクロリットルの流量でシリンジポンプを使用して、セル懸濁液をデバイスにロードします。DMEM/F-12培地を1マイクロリットルのデバイスの入口に1マイクロリットル追加し、シリンジポンプを使用してデバイスにメディアをロードします。0.3マイクロリットルのDMEM/F12媒体を、毎分10マイクロリットルの流量でシリンジポンプを備えた装置に積み込みます。細胞がロードされたら、チューブを取り出し、入口と出口をポリオレフィンテープで密封して閉じた培養システムを作ります。PDMSデバイスを10センチメートルの培養皿に移動し、10ミリリットルの無菌PBSをデバイスの周りに加えて培地の蒸発を避けます。培養皿を三重単細胞培養用インキュベーターに移す。PDMS装置は、培養チャンバとバイパスチャネルに接続するキャプチャ部位を有する3層構造を有する。培養チャンバとバイパスチャネルの間の流れ抵抗の違いにより、セルはキャプチャ位置に流れ込み、次のセルはバイパスチャネルを通過して次の捕獲部位に向かう。還流ステップは、捕捉部位から細胞を放出し、培養チャンバーに送るために使用される。このプロトコルの細胞捕捉効率は、3種類の異なる細胞タイプで評価した。ヒトリンパ管内皮細胞、または、PIN、WNT5B特異的短ヘアピンRNAを発現するヒト口腔扁平上皮癌T2.6細胞、およびpLKO-GFPベクターコントロール細胞。実証された3つの細胞の単細胞捕捉効率は、LECsで約71%、WNT5B sh4細胞で74%、pLKO-GFP細胞で78%であった。この方法は、リンパ内皮細胞と扁平上皮癌細胞の複数の単細胞共培養に使用でき、細胞の増殖と形態を顕微鏡で観察することができる。細胞凝集体は単一のペアリング効率を低下させるだけでなく、マイクロチャネルを詰まらせることができるので、準備された細胞懸濁液が最小限の細胞凝集体を持っていることを確認することが重要です。個々の細胞間の細胞間相互作用は、細胞の挙動を制御する上で重要な役割を果たします。我々の方法は、研究者が単一の細胞レベルで細胞と細胞の相互作用を研究するのに役立つ効率的なツールを提供することができ、人口ベースの研究から容易に得ることができない新しいメカニズムの発見につながる可能性があります。

establishing-single-cell-based-co-cultures-deterministic-manner-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、マイクロバイオリアクターにおける細胞の三次元培養のためのチップベースのプラットフォームについて説明します。一つのチップは10ミオまで収容することができる。流体の流れに関しては正確に定義された条件下で培養することができる細胞、滅菌、閉鎖循環ループ内の酸素分圧など。...

灌流マイクロバイオリアクターのチップベースの三次元細胞培養

私たちは、クリーンルームやソフトリソグラフィーを必要とせずに、複数の異なる株に類似した、動的な条件を適用することができるマイクロ流体デバイスを製造するための簡単​​な方法を提示する。...

複数の異なった株を勉強するためのマイクロ流体デバイス

このプロトコルでは、原核微生物のシングルセル分析のためのマイクロ流体ピコリットルバイオリアクター(PLBR)の製作、セットアップ、および基本的な操作が紹介されています。工業的に関連性のある微生物を原理の証明として分析し、従来の方法では不可能だった特定の期間の成長率、形態、表現型の不均一性についての洞察を可能にしました。...

微生物シングルセル解析のためのマイクロ流体ピコリットルバイオリアクター:作製、システムセットアップ、操作

この記事では、単一細胞解析のためのマイクロ流体チップを提示する。これは、蛍光アッセイまたはイムノアッセイによって細胞内タンパク質、酵素、補因子、およびセカンドメッセンジャーの定量化を可能にする。...

単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ

生体材料コーティングのチップ内のプラズマパターニングのための単一ニューロンマイクロ流体アレイ化と水のマスキングのためのプロトコルが記載されている。高度に相互接続された共培養細胞は、最小限の入力を用いて調製することができる。...

単セルの精度で神経共培養の調製

ここでは、初代細胞、組織モデル、パンチ生検をマイクロ流体多臓器チップで最大28日間共培養するプロトコールを紹介します。ヒト真皮微小血管内皮細胞、肝臓凝集体、および皮膚生検は、共通の培地循環で成功裏に組み合わせられました。...

多臓器チップ - 長期マルチ組織の共培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

ここでは、高効率のシングルセルの単離と長期のクローン培養を可能にする新しいマイクロウェル設計コンセプトを利用したマイクロ流体プラットフォームを使用して、単一細胞を分離および培養するためのプロトコルを紹介します。...

ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

マイクロ流体がんオンチップモデル「エボリューションアクセラレータ」技術を提示し、単一細胞における明確な環境条件下でがんダイナミクスを長期リアルタイムで定量的に研究するための制御可能なプラットフォームを提供します。レベル。この技術は、基礎研究や前臨床薬開発のためのインビトロモデルとしての働きが期待されます。...

リアルタイム観察のためのマイクロ流体進化加速器上の癌集団全体にわたる異種薬物勾配の生成

1500の培養ユニット、強化された蠕動ポンプの配列、オンサイトミキシングモジュラスから構成される複雑な寿命機械の高スループット研究のためのマイクロ流体システムを発表します。マイクロ流体チップは、生体内の非常に複雑で動的な微小環境条件の解析を可能にします。...

ハイスループットマイクロ流体装置を用いた動的環境条件の生成

免疫療法と単一細胞ゲノムプロファイリングの時代において、がん生物学は、適切な時空間コンテキストで腫瘍と免疫のインターフェースを研究するための新しいin...

in vitro腫瘍微小環境における免疫応答を解剖するためのマイクロ流体共培養モデル

マイクロ流体チップ上のマウス胚組織の培養および操作のためのプロトコールが提供される。経路変調器のパルスを印加することにより、このシステムは、マウスのソミトジェネシスの機能的調査のためのシグナル伝達振動を外部的に制御するために使用することができる。...

ソミトジェネシスを支配するシグナル伝達振動の機能的調査のためのマイクロフルイディクスアプローチ

学ぼうマイクロ流体チップを用いた単一細胞共培養法。PDMSデバイスで高効率に細胞を捕獲し、動的イメージングで細胞間相互作用をリアルタイムに追跡する手法です。細胞生物学研究に有用です。

マイクロ流体チップを使用した決定論的方法で単一細胞ベースの共培養を確立する

さらに動画を探す