酸素勾配エクタキトメトリーを用いた制御自動脱酸素時の鎌の特性評価
2019年11月5日
ここでは、酸素勾配エクタキトメトリー、制御脱酸素及び再酸素化下の鎌状赤血球疾患患者からの試料中の赤血球変形性を測定する迅速かつ再現性のある方法を提示する。この技術は、赤血球病欠を研究し、鎌状赤血球疾患の治療有効性を監視する方法を提供する。
酸素勾配のエクタキットメトリーは、個々の病気傾向を評価する機能的なアッセイです。現在までに、他の機能アッセイは利用できず、使用されていない。酸素勾配のエクタキトメトリーは、鎌状赤血球病患者の血液細胞が鎌状赤血球に始まる酸素緊張を決定することができる。
この酸素張力は患者固有であり、疾患の重症度のバイオマーカーとして役立つことができる。鎌状赤血球病では、この技術は治療効果を監視するために使用することができ、新しい治療法の開発に使用することができます。この手法の視覚的なデモンストレーションは、非常に敏感であるため、重要です。
このテクニックを使い始めるときには、測定に影響を与える要因は数多くあります。初めてこれを試みる人は、この技術がサンプルの準備とサンプル処理に非常に敏感であることを経験するかもしれません。私のアドバイスは、可能な限り標準化された作業を行い、ルーチンを開発することです。
この手順を開始するには、コンピュータとエクタシトメーターの電源を入れ、コンピュータ上のソフトウェアを開きます。窒素ボンベを開いて、窒素がサンプルを脱酸素化できることを確認します。カップのボブを下げ、カップが自由に回ることができることを確認してください。
ソフトウェアが動作している場合は、メッセージが開いているかどうかを確認し、[OK]をクリックします。ektacytometerがセルフチェックプロセスを開始し、[開始]を選択することを確認します。セルフチェックが失敗した場合は、ハードウェアチェック、pO2、セルフチェックをクリックして再実行します。左側にリストされている別のテストからpO2スキャンを選択します。
画面の右側にある設定を選択し、表 1 のテキスト プロトコルに示されているパラメータに従って設定され、すべての測定に対して同じ設定を維持するようにします。[OK] をクリックして、再度 [OK] をクリックして、これらの設定を保存します。まず、EDTAを含むチューブに静脈穿刺によって血液サンプルを採取し、最低30分間摂氏4度で血液を保存しますが、24時間以下です。
この後、反転によってサンプルを穏やかに混ぜて均質化します。測定前に、試料をローラーベンチで室温まで温めます。血液分析器を使用して、吸引をチューブに入れ、血液分析器の針の後ろのボタンを押して測定を開始し、分析装置は全血の20〜200マイクロリットルの間で使用することによって、完全な血液数を測定します。
次に、追加されるサンプルの体積を計算することによって、PVPの5ミリリットルのRBCカウント2億の赤血球に全血サンプルを標準化します。まず、ピペットチップを切り、血液を3回再中断して事前に濡らします。次に、計算されたサンプル体積をPVPバイアルにピペットします。
均質になるまで反転して手動でサンプルを軽く混ぜます。ゆっくりと針なしで3ミリリットルの注射器に血液とPVP混合物の2ミリリットルを引き出します。1.5~1.8ミリリットルの間まで、目に見える気泡と余分なサンプル溶液を取り除くためにプランジャーを押します。
コネクタを通して、サンプルの総量をゆっくりと均等にボブに注入します。サンプルのレベルが酸素センサーと小さな吸引穴の上にあっていることを確認してください。ソフトウェアで、新規をクリックしてサンプル識別子、注釈、寄付日、およびPVPの粘度を記入します。
[OK] をクリックして吸引します。60秒の吸引の後、カップは15秒間再び回転し、吸引します。回転が停止したら、[OK]をクリックします。機械の蓋を閉じます。
酸素勾配のエクタキットメトリーが固定ゲインで行われるので、続行して今すぐ開始します。測定後、ソフトウェアによって自動的に計算される曲線とパラメータを示すレポートを印刷します。生データが設定の指定されたフォルダに自動的に保存されるようにします。
まず、サンプルシリンジを取り出し、蒸留水または脱イオン水で満たされた注射器に交換します。両方向にフラッシュするように、リンス中にクリーンを押し、ゆっくりとコネクタをフラッシュします。次に、注射器を取り出し、ボブを持ち上げます。
柔らかい布を使って、ボブとコネクタを十分に乾かします。次に、大きな注射器を使用してコネクタを洗い流し、チューブとボブに残っている水を取り除きます。注射器を入口に置き、ボブの出口をふさいでチューブ内の圧力を取り戻し、残りの水を取り除きます。
その後、酸素スポットに触れないようにしながらカップを乾燥させます。ボブとカップを下げて、次の測定のために機械を準備します。機械が正しくすすい上がっていることを確認した後、適切なチューブが洗浄液に関連していることを確認してください。
ソフトウェアを閉じ、閉じるボタンを押し、開始ボタンを押して、1日の終わりのクリーニングプログラムを開始します。その後、廃棄物ボトルを空にし、ボブとカップを乾燥させるために柔らかい布を使用しています。機械の蓋を閉めます。
窒素ボンベを閉じ、コンピュータと機械の電源を切ります。酸素勾配のエクタキトメトリーは、酸素濃度の範囲の下で赤血球の鎌状赤い行動を研究するために使用することができます。酸素勾配のエクタキトメトリーでは、窒素ガスによる試料の連続脱酸素が続き、周囲の空気による迅速な再酸素化が続く。
これらの条件下では、赤血球の鎌状赤血球が脱酸素状態で観察される。これは、鎌状赤い細胞が適用されたせん断応力の下で適切に整列しないため、回折パターンの歪みを引き起こす。鎌状赤血球は、酸素勾配エクタキトメトリー中の状態を模倣する脱酸素中の形状の変化を示すが、酸素化時に形状に変化を示さない。
このプロセスは酸素勾配のエクタキトメトリーの間に回折パターンの歪みを生じ、したがって伸び指数の減少をもたらす。エクタシトメーターで得られた代表的な曲線は、鎌状赤くなる挙動の異なる特性を反映する6つのパラメータを示しています:最大伸び指数、最小伸び指数、デルタEI、鎌状赤血球の点、曲線下の領域、および回復。健康なコントロールからの赤血球の代表的な曲線、HbS形質を有する患者、およびホモ接合鎌状赤血球病患者がここに示されている。
ヒドロキシル尿素と輸血で治療されたホモ接合鎌状赤血球患者の代表的な曲線の明確な違いは、このアッセイの有用性を強調する。PVPの温度、pH、浸透率などの酸素勾配の黄触法に影響を与える要因は数多くありますが、水の残骸や血液サンプル溶液の混合度合いが測定に影響を与える可能性があります。そのため、標準化されたサンプル処理が不可欠です。
酸素勾配エクタキトメトリーの結果は、臨床現場で直接実施され、パーソナライズされた医療に寄与する可能性があります。この技術は、鎌状赤血球病の新しい治療法の可能性を調査するために鎌状赤血球行動を研究することを可能にし、疾患の重症度に臨床的に関連するバイオマーカーとして役立つことができる。
概要
この記事では、鎌状赤血球症患者の赤血球の変形性を測定する迅速な方法である酸素勾配エクタサイトメトリーについて説明します。この技術により、制御された脱酸素化と再酸素化条件下での鎌状化の挙動を評価することができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 血液学
- 臨床研究
背景
- 酸素勾配エクタサイトメトリーは、鎌状化の傾向を評価するための独自の機能的アッセイです。
- 赤血球が鎌状化し始める患者固有の酸素張力を特定します。
- この方法は、疾患の重症度と治療効果のバイオマーカーとして機能します。
- 正確な結果を得るためには、サンプルの準備の標準化が重要です。
研究の目的
- 鎌状赤血球症における赤血球の鎌状化の挙動を評価すること。
- 鎌状赤血球症の治療効果をモニタリングすること。
- 鎌状化の挙動に基づいて新しい治療戦略を開発すること。
使用された方法
- EDTAとPVPによる血液サンプルの準備。
- 伸長指数の測定のためのエクタサイトメーターの使用。
- サンプルの連続的な脱酸素化とその後の再酸素化。
- 鎌状化の挙動に関するレポートを生成するためのソフトウェアによるデータ分析。
主な結果
- 鎌状化の挙動を反映する主要なパラメータの特定。
- サンプルの取り扱いに対する技術の感度の実証。
- 一貫した結果を得るための標準化されたプロトコルの確立。
- さまざまな酸素濃度下での鎌状化の挙動の可視化。
結論
- 酸素勾配エクタサイトメトリーは、鎌状赤血球症の研究に有用なツールです。
- 鎌状化と治療反応の病態生理学的洞察を提供します。
- 方法論の標準化により、結果の信頼性が向上します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Oxygen gradient ektacytometry provides a functional biomarker for sickle cell disease by quantifying red blood cell sickling behavior as a function of oxygen tension. This enables patient-specific assessment of disease severity and treatment response, supporting go/no-go decisions in preclinical and clinical development of anti-sickling therapies. The technique addresses a critical unmet need for rapid, reproducible assays to monitor novel therapeutic candidates targeting HbS polymerization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures the oxygen tension at which sickling initiates (point of sickling) to interrogate therapeutic hypotheses targeting HbS polymerization.
- Operational Value: Enables functional target validation by linking molecular mechanisms to cellular deformability phenotypes.
- Predictive Value: Supports preclinical model selection by identifying patient-representative sickling thresholds for compound screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative elongation index (EI) readouts under controlled deoxygenation-reoxygenation cycles for compound effect evaluation.
- Reproducibility: Requires standardized sample handling (EDTA anticoagulation, PVP resuspension, temperature control) to minimize variability in sickling measurements.
- Scalability: Outputs six parameters including point of sickling and minimum EI, enabling high-content profiling of sickling dynamics across compound concentrations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Correlates point of sickling with hemoglobin oxygen affinity and minimum EI with fetal hemoglobin levels, providing biomarker alignment across discovery and clinical stages.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes sickling from general deformability changes by capturing shape distortion under shear stress during deoxygenation.
- Treatment Monitoring: Detects changes in sickling behavior in response to interventions like hydroxyurea or transfusion, supporting pharmacodynamic assessment.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation by providing a functional readout of sickling behavior that informs lead optimization and candidate prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of anti-sickling agents by quantifying shifts in the oxygen tension at which sickling begins.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible measurements of red blood cell deformability under physiologically relevant oxygen gradients.
- Analytics: Provides quantitative dependent variables (elongation index, point of sickling, area under curve) for comparing compound effects across conditions.
- Translational Research: Links preclinical sickling thresholds to clinical biomarkers via correlation with fetal hemoglobin and oxygen affinity.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable platform for sickle cell disease model characterization across projects and sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly measuring sickling-induced deformability changes under controlled deoxygenation.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized protocols for sample preparation, instrument calibration, and data acquisition.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by offering a predictive biomarker of treatment effect on HbS polymerization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of candidates based on quantitative sickling suppression in patient-derived samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hematology sample handling and ektacytometer operation to manage sensitivity to pre-analytical variables.
- Dependent on controlled access to nitrogen gas for deoxygenation and ambient air for reoxygenation during measurement cycles.
- Necessitates cross-team standardization of anticoagulant (EDTA), resuspension buffer (PVP), and equilibration timing to ensure data comparability.
- Must account for confounding factors such as temperature, pH, and osmolarity of the PVP medium that influence sickling kinetics.
- Limited to research and preclinical use; clinical implementation requires additional validation for diagnostic or monitoring claims.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:12
Start-up of the Ektacytometer
2:13
Sample Collection and Preparation
3:07
Oxygen Gradient Ektacytometry Measurement
4:41
Cleaning of the Ektacytometer
5:29
Shutdown of the Machine
6:02
Results: Characterization of Sickling Oxygen Gradient Ektacytometry
7:32
Conclusion
