Name: 神経膠芽腫における機能的関連miRNAの特徴付けと遺伝子治療のための人工クラスターへの工学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学ぶ 複数のmiRNAを同時に調節する人工クラスター構築法。バイオインフォマティクスを活用し神経膠芽腫などの遺伝子治療応用を実現する革新的なプラットフォームです。

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著者らは、ハーヴェイ・クッシング神経腫瘍学研究所のメンバーに対し、支援と建設的な批判に感謝したいと考えています。この作業は、NINDS助成金K12NS80223およびK08NS101091によってP.Pにサポートされました。

1. 神経膠芽腫における機能的関連miRNAの特徴付け
<ol><li>神経膠芽腫対脳における広い差分miRNA発現の解析
	<ol>
<li>まず、腫瘍内で最も著しく緩和されたmiRNAを決定する。これは、少なくとも 3 つの異なる方法を使用して実現できます。<ol>
<li>https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcgaで見つかったがんゲノムアトラスを採掘し、データ11をシーケンシングする。</li>
			<li>新鮮な手術標本12からマイクロアレイ解析を行う。</li>
			<li>以前にパブリッシュされたデータセット13 を使用します。 注:どちらの方法を選択した場合でも、出力は、発現が腫瘍生物学と統計的に(直接的または逆に)相関するmiRNAのバルクセットを提供します。この初期グループは、以下で説明するように、発現変化のより動的な分析を実行することにより、最も厳格な機能関連を示すmiRNAのサブセットの同定のためにさらに分析されるmiRNAのプールを構成する。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>条件特異的miRNA発現解析
	<ol>
<li>細胞分化の誘導:<ol>
<li>単層培養の形成を支持するために、あらかじめコーティングされたポリD-リジン(PDL)プラスチック皿を使用してください。皿コーティングの場合は、PDLを100μg/mLの濃度で水に溶かします。25 cm2表面あたり 1 mL の溶液を使用します。PDL溶液の塗布後、PBS 6hで2xをすすいで下します。</li>
			<li>ヒト神経幹細胞を等量でプレート(100,000細胞/5mL)幹細胞培地(神経ベース培地+B27サプリメント+20ng/mL EGF/FGF)、星球分化媒体(DMEM+10%FBS)、または神経分化培地(神経基性培地+B27)サプリメント, + 2 μM レチノイン酸)14.オリゴデンドロサイト分化のためのプロトコルは、EGF/FGF除去14、15の後にIGF-1(200 ng/mL)の添加を必要とする。</li>
			<li>細胞めっき後、37°Cで1週間インキュベーターに置き、5%CO2を入れなさい。</li>
		</ol>
</li>
		<li>RNA抽出:<ol>
<li>7日後、インキュベーターから細胞を取り出し、培地を除去する。</li>
			<li>PBS(5 mL)で細胞を洗浄します。次に、1mLのライシス試薬(材料表参照)を加えて細胞をlyseし、細胞スクレーパーを使用して1.5mLのマイクロフュージチューブに細胞を削ります。ライゼルを含むチューブを室温(RT)で5分間保管してください。</li>
			<li>製造元の指示に従って、RNA の完全な分離に進みます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>miRNA発現分析:<ol>
<li>リアルタイムPCRによる3つの分化パターンの中でステップ1.1で同定された特定のmiRNAの微分発現を定量化し、TaqManプローブを使用し、リバース転写およびPCR増幅のためのメーカーのプロトコルに従う(図 1)</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>ストレス特有の課題によるmiRNAクラスターの検証
	<ol>
<li>神経基底培地+B27サプリメント+20 ng/mL EGF/FGFにおける培養G34神経膠芽腫幹細胞様細胞。25 cm2低い付属フラスコで 5 mL の 1 x 106セルから開始します。</li>
		<li>めっき後48時間を開始し、次のように5日ごとにDNAアルキル化剤テモゾロミド(TMZ)の二重濃度を追加します。<ol>
<li>5 μM から 5 日間開始します。5日後、培地を取り出し、テモゾロミドを使わずに新鮮な培地に置き換え、生き残った細胞が回復できるようにする。48時間後、10 μM TMZを追加し、さらに5日間インキュベートします。</li>
			<li>ステップ1.3.2.1を繰り返し、TMZ濃度を毎回倍増させ、少なくとも100μMの濃度に達し、細胞が薬物10に対して耐性になるまで。</li>
		</ol>
</li>
		<li>並列実験では、次のようにG34細胞を照射します。<ol>
<li>25cm2低アタッチメントフラスコで5mLで1 x 106細胞をめっきした後48時間を開始し、2Gyのエネルギーを有する細胞を照射する(フォトン発光を提供する任意の照射器が許容される)。細胞をインキュベーターに戻し、邪魔をしないでください。48時間後、エネルギーの追加2 Gyで再び細胞を照射する。</li>
			<li>合計 10 Gy のエネルギーが投与されるまで、ステップ 1.3.3.1 4 倍を繰り返します。</li>
			<li>細胞をインキュベーターに戻し、下流分析の前に少なくとも5日間新鮮な培地で回復させます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>抵抗性誘導後、ライシス試薬を用いて細胞をlyseし、製造元のプロトコルに従って全RNAを抽出する。</li>
		<li>ステップ 1.2.1 (図 2)で説明されているように、セクション 1.1-1.2 で識別される特定の miRNA の式を分析します。</li>
	</ol></li>
	<li>クラスタ化されたmiRNAの機能収束の特徴付け
	<ol>
<li>miRNAターゲティング予測ツールを用いて得られたセクション1.2-1.3で定義された各miRNAの予測標的を得る。 注:アルゴリズムは定期的に16を更新されているので、一般的に TargetScan に頼ります。その他の予測ツールは、miRanda17、miRDB18、および DIANA-miRPath19です。これらのプログラムはすべて無料の Web ベースのアプリケーションです。<ol>
<li>Targetscan のフロントページから、事前に設定されたドロップダウン メニューから関心のある miRNA を選択します。[送信]ボタンをクリックします。</li>
			<li>[ダウンロード] テーブルリンクを使用して、結果のターゲットの一覧をスプレッドシートとしてダウンロードします (補足図 1)。</li>
			<li>誤検知の可能性を減らすには、下流分析で保存されたサイト列内のターゲットのみを含めます。また、追加のmiRNA予測プログラム(上記参照)を使用し、すべてのアルゴリズムに共通するターゲットのみを含めることによって、さらなるストリンジェンシーを得ることができます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ToppGene Suite20を使用して遺伝子オントロジーカテゴリに従って得られた標的を分類し、各miRNAに共通する経路の濃縮を評価する。<ol>
<li>HGNCシンボルをエントリータイプとして使用して、「トレーニング遺伝子セット」ウィンドウにステップ1.4.1から得られたターゲットのリストを貼り付けます。[送信]をクリックします。プログラムは、入力された遺伝子のリストの最も重要な「囲碁」カテゴリを示す出力テーブルを提供します(補足図2)。</li>
		</ol>
</li>
		<li>最終的に共通の経路または細胞プロセス(この場合はクロマチン調節)の調節に対する各miRNAの寄与を確立するために、ステップ1.4.1で得られた各標的を特定の細胞プロセスに関与する遺伝子の完全なリストに対してチェックしてください(すなわち、クロマチン調節)は、バイオインフォマティクスおよび進化ゲノミクスウェブサイトに提供されるベン図関数を使用して、http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn。 注:このプログラムでは、複数のグループを同時に交差することができます (図 3)。各miRNAによって提供される特定のユニークな標的にアニテンを付け、下流の機能実験のために選択されます。<ol>
<li>プログラムのフロントページで、各miRNAのターゲットmRNAまたはそれぞれのウィンドウに関心がある場合は、リストをアップロードまたはコピー/貼り付けます。各リストに一意の識別子を付けます。</li>
			<li>[送信]をクリックします。プログラムは、各セクターの遺伝子の数を持つベン図の視覚的な出力だけでなく、各サブセットと交差の組み合わせのためのmRNAの完全なリストを提供します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. miRNAモジュールをポリシストニックトランスジェニッククラスターに組み込む
<ol><li>
miR-17-92クラスター遺伝子座に基づくトランスジェニック足場の調製
	<ol>
<li>ensemblゲノムブラウザ21からmiR-17-92クラスターのヌクレオチド配列を得る。遺伝子座の6つのエンコードされたmiRNAヘアピンと、コア配列の上流(5')と下流(3')の両方の少なくとも200ヌクレオチドフランク配列を包含する〜800塩基対「コア」配列を選択する。</li>
		<li>上記のシーケンスを任意の単語編集プログラムに貼り付けます。</li>
		<li>miRBase22でそれらを取得することにより、6 つのネイティブ ヘアピンの各シーケンスを定義します。これらのシーケンスのそれぞれを、以前に識別した「コア」シーケンスのスパン内にマークします。各ヘアピン間のシーケンスはスペーサー配列を表し、トランスジーンの正しい処理に重要です。</li>
		<li>新しいヘアピンの受け入れ者として機能する各ヘアピンの5'と3'の両端で3-5ヌクレオチドを除いて、「コア」シーケンスからネイティブヘアピンシーケンスを削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
複数のmiRNAをコードする新しいトランスジーンの構築
	<ol>
<li>miRBaseからトランスジーンで過剰発現することを意図したmiRNAのヘアピン配列を取得する。マイクロプロセッサ切断の部位である特定のヌクレオチドに注意してください。</li>
		<li>取り外したヘアピン(ステップ2.1.4)を、ステップ2.2.1で得られた目的のmiRNAのヘアピンシーケンスに置き換えます。</li>
		<li>トランスジーンの両方の側面領域に所望の制限配列を追加して、選択した送達ベクターへのサブクローニングを容易にする。選択した制限シーケンスがシーケンス自体に存在しないことを確認します。</li>
		<li>陰性対照の場合、20ヌクレオチドスクランブル配列を使用して、各成熟したmiRNAの天然20ヌクレオチド配列を置き換える。https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequenceなどのオンライン ツールを使用して、これらのスクランブル シーケンスを生成します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
トランスジーンの2次元構造の検証
	<ol>
<li>RNA構造予測ソフトウェアプログラムRNAwebフォールド23に完全なトランスジェニックシーケンスをコピーします。</li>
		<li>標準のプログラム設定を使用して、[続行]をクリックします。</li>
		<li>グラフィカル出力を分析し、特に明確に定義されたヘアピンの存在と、マイクロプロセッサ切断部位に近い少なくとも11個のヌクレオチド構造の存在について分析する。また、ヘアピンシーケンス内に分岐点がないかどうかを探します(図4)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. DNA合成によるトランスジーンの取得
<ol><li>キメラmiRNAクラスターの設計およびシリコ検証後、商業ベンダー24からのDNA合成を用いて作業配列を得て、ベクターおよびトランスジーン送達への下流クローニングを進める。我々は、インビトロ送達10およびアデノ関連ウイルス(AAV)にレンチウイルスベクターを生体内頭蓋内送達25に使用した。</li>
</ol>

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</ol>

著者は利益相反を報告しない。

このプロトコルは、単独で機能するのではなく、miRNAがグループで働くことによって生物学的に関連するという概念に基づいており、これらのグループは、特定の細胞コンテキスト26によって転写的に決定される。翻訳の観点からこのアプローチを正当化するために、細胞/組織におけるこのマルチmiRNAパターンの再構成を可能にするフォローアッププロトコルが導入される。これは、miRNAの比較的単純な生体発生を利用することにより、マイクロプロセッサによる特徴的なmiRNAヘアピンの認識が必要であり、正しいmiRNA処理27に十分である。同時に、この最小限の要件により、自然発生するmiRNAクラスターの遺伝的足場を、任意の送達ベクターに適合させることができる短いDNA配列内に含まれる所望のmiRNAモジュールの発現のバックボーンとして使用することができます。選択の。このプロトコルの主な要件は、適切な切断を可能にするために、ヘアピン構造とステム成分の十分な長さを維持することです。
このプロトコルの実行に関しては...

miRNAは、がん4、5を含む多くの疾患1、2、3に対する広範な遺伝子治療アプローチの開発のための比類のない機会を提供する。これは、これらの生体分子のいくつかのユニークな特徴に基づいており、その小さいサイズ6、単純な生体発生7、および関連8で機能する自然な傾向を含む。多くの疾患は、しばしば複雑な生物学的機能の調節に収束する特定のmiRNA発現パターンによって特徴付けされる9.この方法の目的は、最初に特定の細胞機能に相乗的に関連するmiRNAのグループを識別する戦略を定義することです。その結果、下流の研究および応用におけるこのようなmiRNA組み合わせの再確立のための戦略を提供する。
この方法により、複数のmiRNAの機能解析を一度に行い、多数のmRNAを同時に標的化し、疾患の複雑な景観を再現することができます。このアプローチは、最近、1)脳癌で同時に制御され、2)放射線による無毒性ストレスに応答する神経分化中に強い共発パターンを示す3つのmiRNAのグループを定義するために採用されている。DNAアルキル化剤以下に説明するクラスタリング法による3つのmiRNAのこのモジュールの組み合わせ再発現は、癌細胞の生物学に対する深い干渉をもたらすものであり、前臨床研究10の遺伝子治療戦略として容易に使用することができる。このプロトコルは、miRNA研究およびその翻訳アプリケーションに関与する人々に特に関心があるかもしれません。

<table><tbody><tr><td>0.4%低融点アガロース&nbsp;</td><td>IBIサイエンティフィック</td><td>IB70058</td><td></td></tr><tr><td>0.45&micro;M 滅菌フィルターユニット</td><td>Merck Millipore</td><td>SLH033RS</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Microcentrifuge tube</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>6-Well plates&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>アチミックマウス (FoxN1 nu/nu)</td><td>Envigo</td><td>069(nu)/070(nu/+)</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scraper, 16cm</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td></td></tr><tr><td>Cesium 137 照射器&nbsp;</td><td>JLシェパードアンドアソシエイツ</td><td>コアファシリティ(ハーバード大学医学部)</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>439142-4L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース、ピルビン酸&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11995040</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ」リン酸緩衝生理食塩水&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y ソリューション&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1051750500</td><td></td></tr><tr><td>ヒト原発性神経膠腫幹様細胞 (GBM62)</td><td></td><td></td>E<td>. A. Chiocca 博士 (Brigham and Women' 提供)S Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Human primary glioma stem-like cells (MGG4)</td><td></td><td></td><td>Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>レンチウイルスベクター pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP</td><td>System Biosciences</td><td>CD511B-1</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td> 冷蔵エ<td>ッペンドルフ</td><td>モデル番号5424 R, カタログ番号 5404000138</td><td></td></tr><tr><td>封入剤&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4112APG</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 高速ポリカーボネート丸底遠心チューブ&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>3117-0380PK</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NanoDrop Thermo Fisher Scientific</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>神経前駆細胞 (NPC)</td><td></td><td></td><td>提供:ヤクブ・ゴドレフスキー博士(Brigham and Women's Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>ニコン eclipse Ti 電動蛍光顕微鏡システム</td><td>ニコン</td><td>14314</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>PCR チューブ&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>CLS6571-960EA</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ94/16&nbsp;</td><td>グライナー バイオワン</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン&nbsp;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトEGF&nbsp;</td><td>ペプロテック&nbsp;</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトFGF-basic&nbsp;</td><td>ペプロテック&nbsp;</td><td>AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>Gibco</td><td>12587-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNA Miniprep Kit</td><td>Direct-zol</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>S1000 サーマルサイクラー&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1852196</td><td></td></tr><tr><td>小動物画像誘導マイクロ照射器&nbsp;</td><td>Xstrahal Life Sciences、英国</td><td>中核施設(Dana-Farber Cancer Institute、マサチューセッツ州ボストン)</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX+超遠心分離機&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>75000100</tr><tr><td>StemProアキュターゼ&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>StepOne リアルタイム PCR システム</td><td>Applied Biosystems&nbsp;</td><td></td><td></td>4376357</tr><tr><td>SterilGARDバイオセーフティキャビネット&nbsp;</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A-HE</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>T98-G</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC CRL-1690</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan ユニバーサル PCR マスターミックス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4324018</td><td></td></tr><tr><td>テモゾロミド</td><td>トクリス バイオサイエンス</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュテック 最適な切断温度&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC9636948</td><td></td></tr><tr><td>トリゾール試薬&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15596026</td><td>溶解試薬</td></tr><tr><td>U251-MG</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC HTB-17</td><td></td></tr><tr><td>U87-MG&nbsp;</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>ViraPower レンチベクター発現システム&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>K4970-00</td><td></td></tr><tr><td>水、HPLCグレード</td><td>フィ</td><td>ッシャーW54</td><td></td></tr><tr><td>キシレン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

神経膠芽腫における機能的関連mirnaの特徴付けと遺伝子治療のための人工クラスターへの工学

Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy

健康および疾患におけるマイクロRNA(miRNA)の生物学的関連性は、単一のmiRNAの作用ではなく、多くの同時に規制緩和されたmiRNAの特定の組み合わせに大きく依存する。これらの特定のmiRNAモジュールの特徴付けは療法の使用を最大にする基本的なステップである。組み合わせ属性が実質的に悪用される可能性があるため、これは非常に重要です。ここで説明する、神経膠芽腫における発癌性クロマチン抑制剤の制御に関連する特定のmiRNAシグネチャを定義する方法である。このアプローチは、最初に正常組織と比較して腫瘍で調節解除されるmiRNAの一般的なグループを定義する。分析は、差動培養条件によってさらに洗練され、特定の細胞状態の間に同時に発現されるmiRNAのサブグループを強調する。最後に、これらのフィルタを満たすmiRNAは、自然に存在するmiRNAクラスター遺伝子の足場に基づく人工ポリシストロントランス遺伝子に結合され、これらのmiRNAモジュールを受け取る細胞に過剰発現するために使用されます。

この方法は、脳腫瘍において一貫してダウンレギュレーションされている3つのmiRNAのモジュールの特徴付けを可能にし、これは神経分化(図1)の間に特異的に発現され、その後の腫瘍生存応答に関与するセラピー(図2)。これは、複雑な発発性クロマチン抑圧経路を調節することによって達成される。この共発現パターンは、これら3つのmiRNAの間で強い相乗活性を示唆した(図3)。その結果、miRNAの小さなサイズと単純な生体発生を利用して、このプロトコルの第2部は、神経膠芽腫細胞における3つのmiRNAの発現を同時に要約することができるトランスジーン(図4)を設計するために使用された。インビトロとインビボの両方で、腫瘍生物学に重大な干渉を有し、有望な翻訳適用性(図5A、B、C)1...

ここで説明する、生物学的に相乗的なmiRNAとその組み立てモジュールを短いトランス遺伝子に特徴付けるプロトコルであり、遺伝子治療用途に対する同時過剰発現を可能にする。

神経膠芽腫における機能的関連miRNAの特徴付けと遺伝子治療のための人工クラスターへの工学

The biological relevance of microRNAs (miRNAs) in health and disease significantly relies on specific combinations of many simultaneously deregulated ...

このプロトコルは、真核細胞における多くのマイクロRNAの同時変調を可能にし、分子クローニングステップを最小限に抑える非常にシンプルで柔軟な方法に基づいています。この技術は、インビトロでのマイクロRNA機能相互作用の研究に影響を与えますが、より重要なのは、治療におけるマイクロRNAのより効果的な使用のためのプラットフォームを提供することです。私たちは主に脳癌の文脈でそれを開発し、使用してきましたが、遺伝子発現の複数の変化が関与しているあらゆる疾患に適用されます。この技術の再現性を示す乳癌および甲状腺癌ラインなどの他のモデルで人工トランス遺伝子を試験しました。バイオインフォマティクスとマイクロRNA生物学の基礎知識は、このプロトコルには役立ちますが、不可欠ではありません。バイオインフォマティクスのアプローチは、関連するマイクロRNAの組み合わせとTRK-11を定義するために重要ですが、マイクロRNA処理に精通していることは、これらの異なるマイクロRNAを特定の細胞に安定した一度安定に処理できる人工DNAクラスターにどのように組み立てられるかを理解するために重要です。皿をコーティングするには、まずポリD-リジンを1ミリリットル当たり100マイクログラムの濃度で水中に溶解する。25平方センチメートルの表面あたり溶液の1ミリリットルの量で皿に溶液を注ぎます。皿全体のカバレッジを確認するために皿を渦巻きます。6時間後にポリD-リジン溶液を吸引し、PBSで2回リンスする。ヒト神経幹細胞を培地の5ミリリットル当たり100,000個の細胞の量で、幹細胞培地、星状分化培地または神経分化培地のいずれかでプレートする。細胞メッキ後、皿を摂氏37度、炭酸ガス5%で1週間インキュベーターに入れ、原稿に従ってマイクロRNA発現解析を行う。GBM-34神経膠芽腫幹細胞を培養するには、25平方センチメートルの低い付着フラスコで10〜5番目の細胞と5ミリリットルの神経基底培地から始める。フラスコを摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに入れる。めっき後48時間後、7日ごとにDNAアルキル化剤テモゾロミドの濃度を倍増する。5日間の5ミリリットル培地で補充5ミクロモルTMZの追加で開始します。5日後、培地を取り除き、生き残った細胞が回復できるようにテモゾロミドを使わずに新鮮な培地に交換します。48時間後、10マイクロモル歯型テモゾロミドを加え、さらに5日間インキュベートする。少なくとも100マイクロモルの濃度に達し、細胞が薬物に耐性になるまで、倍増テモゾロミド処理を繰り返す。抵抗性の誘導後、1ミリリットルのライシス試薬を用いて細胞を嘘をつく。全RNAを抽出し、原稿に従って特定のマイクロRNAの発現を分析します。事前に定義された各マイクロRNAの予測標的化を得るために、マイクロRNA標的予測ツールを使用する。TargetScan のフロント ページから、あらかじめ入力されたドロップダウン メニューから目的のマイクロ RNA を選択します。[送信] ボタンをクリックします。ダウンロードテーブルリンクを使用して、結果のターゲットリストをスプレッドシートとしてダウンロードします。誤検出予測の可能性を減らすには、保存されたサイト列と下流分析内のターゲットのみを含めます。追加のマイクロRNA予測プログラムは、さらにストリンジェンシーを得て、すべてのアルゴリズムに共通する標的のみを含みます。その後、ToppGeneスイート20を開きます。各マイクロRNAに共通する経路の濃縮を評価するには、トレーニング遺伝子セットウィンドウで得られた標的のリストを貼り付けます。エントリタイプとしてHGNCシンボルをクリックします。[送信] をクリックして開始します。プログラムは、遺伝子の入力されたリストの最も重要なGOカテゴリを示す出力テーブルを提供します。最終的に共通の経路または細胞プロセスの調節に対する各マイクロRNAの寄与を確立するために、バイオインフォマティクスおよび進化ゲノミクスのウェブサイトで提供されるベンダイアグラム機能を開きます。[送信] をクリックします。プログラムは、各セクターの遺伝子の数と各サブセットと交差の組み合わせのためのメッセンジャーRNAの完全なリストとのベン図の視覚的な出力を提供します。選択したマイクロRNAを機能的なトランス遺伝子にグループ化するには、miR-17-92クラスター遺伝子に基づいてトランスジェニック足場を得る。アンサンブル化されたゲノムブラウザから塩基配列を取得します。軌跡の6つのコード化されたマイクロRNAヘアピンと、コア配列の上流および下流の両方の少なくとも200ヌクレオチドの横並び配列を包含する約800塩基対コア配列を選択する。任意の単語編集プログラムにシーケンスを貼り付けます。6 つのネイティブ ヘア ピンのそれぞれについて、miR ベースで取得して、それぞれのシーケンスを定義します。前に識別されたコア シーケンスの範囲内でこれらのシーケンスのそれぞれをマークします。各ヘアピン間のシーケンスは、スペーサー シーケンスを表します。次に、miR塩基からトランス遺伝子で過剰発現されるマイクロRNAのヘアピン配列を得る。マイクロプロセッサ切断部位にある特定のヌクレオチドに注意してください。新しいヘアピンのアクセプタとして機能する各ヘアピンの5つから5つの端の両方で3〜5ヌクレオチドを除いて、コア配列からネイティブのヘアピン配列を削除します。必要なマイクロ RNA のヘアピン シーケンスを貼り付けて、以前に削除したヘアピンを置き換えます。トランス遺伝子の両方の隣接領域に所望の制限配列を追加して、選択した送達ベクターへのサブクローニングを容易にする。選択した制限シーケンスがシーケンス自体に存在しないことを確認します。トランス遺伝子の2次元構造を検証するには、RNA構造予測ソフトウェアプログラムRNA Webfoldに完全なトランスジェニック配列をコピーします。標準プログラム設定を選択し、[続行] をクリックします。グラフィカル出力を分析し、特にマイクロプロセッサ切断部位に近い少なくとも11ヌクレオチドである二本鎖ステム構造の存在下で明確に定義されたヘアピンの存在について分析する。また、ヘアピン シーケンス内に分岐点がない場合も探します。この時点で、トランス遺伝子は遺伝子合成によって作製され、所望の送達ベクターにクローン化される準備が整っている。この方法は、脳腫瘍で一貫して調節されている3つのマイクロRNAのモジュールの特徴付けを可能にし、これは神経細胞分化中に特に共発現される。遺伝子毒性ストレス時のマイクロRNAモジュールの共発現パターンが確認され、これら3つのマイクロRNAの間で強い相乗活性が示唆された。設計されたトランス遺伝子は、生体外および生体内の神経膠芽腫細胞における3つのマイクロRNAの発現を同時に再現することができ、腫瘍生物学に有意な干渉を及び翻訳適用性を有望としている。さらに、トランスジェニッククラスターは乳癌モデルでも機能していた。このプロトコルの重要な要件は、トランス遺伝子におけるプロセッサ切断の元のサイズを維持することです。そして、キメラマイクロRNAヘアピンのステムループ構造が保存されていることを確認してください。この方法により、複数の生物学的に活性なマイクロRNA遺伝子を非常に短いDNA配列に濃縮することができ、文字通り遺伝子治療用の任意の送達ベクターに生体外に取り付けることができます。この方法は、異なるマイクロRNA間の機能的相互作用を研究し、それ以外の場合は複数の薬物の組み合わせを必要とする複雑な多因子細胞経路を妨害するのに理想的です。

characterization-functionally-associated-mirnas-glioblastoma-their

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ここでは、新生児マウスの心室に注入されたトランスポゾンDNAを使用して、新規神経膠芽腫(GBM)を誘導、監視、分析するための効率的で汎用性の高いプロトコルについて説明します。プラスミドを取り込む脳室内領域の細胞は、ヒトGBMの組織病理学的特性を有する腫瘍を形質転換、増殖および生成する。...

新生児マウスの脳室下帯へのプラスミドDNAのトランスポゾン媒介統合は、神経膠芽腫の新規モデルを生成する

MicroRNAは脳内で重要な役割を果たしており、神経変性をモデル化するための潜在的な標的です。しかし、miRNAの長さが短く、脳組織にアクセスできないため、miRNAのレベルを乱すことは困難です。このビデオでは、マウスの神経ペプチドを使用したアンタゴミールの設計と脳特異的送達の方法を紹介します。...

miRNAの脳特異的ノックダウンのための定位注射への単純な代替

3 D 文化として成長した神経幹細胞は神経膠腫の生物学を勉強するための強力なツールを構成します。パラフィン包埋による神経膠腫細胞の 3次元構造を維持しながら免疫を実行するプロトコルをご紹介します。このメソッドは、幹細胞性など神経分化神経膠腫 neurosphere...

パラフィン埋め込まれた 3 D 神経膠腫 Neurosphere 文化に免疫組織化学による神経膠腫におけるバイオ マーカーの評価

miRNA の治療には、癌の進行を調節する重要な可能性があります。ここに示す解析的アプローチ、組合せ miRNA...

組合せ miRNA 細胞周期の調節、血管新生治療の解析

このプロトコルは、プローブベースのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、スルフォルホダミンB(SRB)アッセイ、3'未翻訳領域(3'UTR)クローニング、および目的のmiRNAの標的遺伝子を検証し、miRNAの機能を理解するためにルシフェラーゼアッセイを使用します。...

腫瘍細胞におけるマイクロRNAレベル、機能、および関連する標的遺伝子を評価するためのインビトロプロトコル

レーザーマイクロディション(LMD)は、グリオーマの不均一性と侵入を媒介する経路を明らかにするために使用できる、敏感で再現性の高い技術です。ここでは、レーザーLMDを用いて、トランスクリプトーム解析を用いて、グリオーマ組織から離散領域を分離するための最適化されたプロトコルについて述べている。...

腫瘍性異種性、オンコストリーム、および浸潤の空間・分子特性解析のための神経膠腫部分領域のレーザー捕捉微小切除

プロテオミクス調節不全は、びまん性浸潤性神経膠腫の蔓延に重要な役割を果たしますが、いくつかの関連タンパク質は未同定のままです。デジタル空間処理(DSP)は、浸潤性神経膠腫の浸潤および遊走に寄与する可能性のある候補タンパク質の発現差を特徴付けるための効率的でハイスループットなアプローチを提供します。...

成人型びまん性浸潤神経膠腫における微小環境のキャラクタリゼーションのためのディジタル空間プロファイリング

このプロトコルは、マイクロRNAクラスターネットワーク解析のための、規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)遺伝子編集ワークフローをクラスター化したハイスループットのクラスター化を記述しており、1回の実験で35...

マイクロRNAクラスターネットワーク解析のためのCRISPR遺伝子編集ツール

血液脳関門は、治療法がない病気である膠芽腫の治療を提供する上で大きなハードルです。ここでは、サイズによってこの生理学的障壁を回避し、腫瘍に蓄積できる in vivo 画像誘導酸化鉄治療用ナノプラットフォームを報告します。...

神経膠芽腫多形動物モデルにおけるオリゴヌクレオチドペイロードのナノ粒子送達

このプロトコルは、マイクロRNAおよびマルチプレックスタンパク質を同時に検出および定量するためのホルマリン固定パラフィン包埋組織を用いたタンデム免疫蛍光ハイブリダイゼーションアッセイを記述している。...

新しい検出および定量法としてのロック核酸 in situ ハイブリダイゼーションによるマイクロRNA増幅と認識

学ぶ 複数のmiRNAを同時に調節する人工クラスター構築法。バイオインフォマティクスを活用し神経膠芽腫などの遺伝子治療応用を実現する革新的なプラットフォームです。

神経膠芽腫における機能的関連miRNAの特徴付けと遺伝子治療のための人工クラスターへの工学

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