オルガノイド培養を用いたマウス前立腺上皮細胞の分化能力の評価
November 22nd, 2019
マウス前立腺オルガノイドは、分化を調節するメカニズムを評価する有望な文脈を表す。本論文では、前立腺オルガノイドを確立するための改善されたアプローチについて述べ、(1)オルガノイドからタンパク質リサートを採取する方法、および(2)全マウント共焦点顕微鏡のためのオルガノイドを修正および染色する方法を紹介する。
3Dオルガノイドシステムは、2Dアッセイよりも生理学的に関連性が高いと考えられており、そうでなければ取得するのが難しい生物学に関する貴重な情報を提供することができます。これは、in vivoアプローチを使用するよりも、より少ない時間と大幅に低コストで薬理学的および遺伝子操作をテストできる適応可能なシステムです。マトリックストライアルは、室温に達したときに固まるので、処理するのが非常に難しいです。
それは液体であり、氷の上に維持されなければならない場合にのみ、ピペットを通して描くことができます。リングの完全性は維持するために重要である。構造が破壊された場合、それはオルガノイドの成長に悪影響を及ぼし、メディアを変更するときに材料を簡単に失う可能性があります。
この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、マウスの基底細胞および発光前立腺上皮細胞の調製から始めます。マウスオルガノイド培地500マイクロリットルで細胞ペレットを洗浄し、その後、1マイクロリットル当たり1,000細胞の細胞密度でペレットを再懸濁します。マスターミックスを調製するには、マウスオルガノイド培地に懸濁した上皮細胞をマトリックスゲルと混合し、培地中の25%の細胞と75%マトリックスゲルを含む最終混合物を生成する。
下流の用途に応じて、基底細胞は通常、80マイクロリットル当たり100〜2,000個の細胞の濃度でメッキされ、一方、ルミナルセルは80マイクロリットル当たり2,000〜10,000細胞の濃度でメッキされます。各細胞混合物について、24ウェルプレートのウェルあたり80マイクロリットルのマトリックスゲルを加える。ポリヘマコーティングとの直接接触を避けながら、ウェルの壁の下半分に液滴をピペット。
マトリックスゲルを添加した後、プレートを旋回させてマトリックスゲル細胞混合物がウェルの縁の周りにリングを形成するようにする。24ウェルプレートを37°C、5%C02インキュベーター右側に10分間置き、マトリックスゲルを部分的に硬化させます。10分間インキュベートした後、24ウェルプレートを逆さまに反転させ、さらに50分間インキュベートしてマトリックスゲルを完全に硬化させます。
次に、各ウェルの中心にドロップワイズプリ温加マウスオルガノイド培地の350マイクロリットルを追加します。培地を添加した後、24ウェルプレートをインキュベーターに戻します。マウスオルガノイドメディアを補充するには、24ウェルプレートを45度の角度で傾け、マトリックスゲルリングを避けながらP1000ピペットを使用して、各ウェルの中心から既存のメディアを静かに取り除きます。
以前のように、事前に温めたマウスオルガノイド培地の350マイクロリットルを追加します。主要な栄養素や成長因子の急速な枯渇を防ぐために、5日以上培養されたオルガノイドに大量のメディアを追加することをお勧めします。以前と同様に、各メディアからメディアを削除します。
オルガノイドを収集するために、リング全体が外れるまで、予温されたジスパーゼ含有培地の1ミリリットルをマトリックスゲルリングに直接ピペット化してマトリックスゲルを繰り返し爆破する。外れたマトリックスゲルオルガノイド混合物を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移します。テキストプロトコルに記載されているように完全な消化に続いて、オルガノイドペレットにリン酸緩衝生理食塩分を加え、穏やかにフリックして再中断する。
ペレットは、室温で5分間Gの800倍の遠心分離によりオルガノイドをペレット化し、マイクロピペットを用いて上清を除去した。オルガノイドペレットを、パックされた細胞体積の10マイクロリットルあたり100マイクロリットルのタンパク質リシスバッファーで再懸濁する。フリックして再中断します。
今、湿った氷にチューブを水没させ、穏やかにマイクロ遠心チューブの外側にソニックディスメンブラターの先端を適用することによってオルガノイドを超音波処理します。確立されたプロトコルでウェスタンブロッティングに進む前に、20キロヘルツで40秒間超音波処理します。24ウェルプレートから前立腺オルガノイドを採取するには、前と同様に各々から培地を取り除きます。
500マイクロリットルのジスパーゼ含有培地を30分間摂氏37度、5%CO2インキュベーターでインキュベートしてマトリックスゲルを消化します。微細遠心分離管に消化されたオルガノイド懸濁液を収集します。次いで、室温で3分間Gの800倍の遠心分離によりオルガノイドをペレット化し、上清を除去した。
前立腺オルガノイドの全実装免疫蛍光染色を行うために、まずPBSに4%パラホルムアルデヒドの500マイクロリットルを加える。オルガノイドを穏やかな揺れで室温で2時間インキュベートします。テキストプロトコルに記載されているようにペレットを洗浄した後、ブロッキング溶液中のDAPI染色の1ミリリットル当たり1マイクログラムを加え、室温で2時間インキュベートする。
このステップの前進からインキュベーション中に光からサンプルを保護します。以前のようにオルガノイドの遠心分離に続いて、ブロッキング溶液に一次抗体を加え、穏やかな揺れで摂氏4度で一晩インキュベートする。オルガノイドを再びペレットにし、PBSの1ミリターで1ミリターで15分間穏やかな揺れをして洗浄します。
この洗浄手順を2回繰り返します。次いで、ブロッキング溶液に二次抗体を加え、穏やかな揺れで摂氏4度で一晩インキュベートする。インキュベーションに続いて、ペレットをオルガノイドに、ペレットをさらに2回洗浄する。
ペレット化オルガノイドに1%トリトンX-100でPBSに30%スクロースの1ミリリットルを加えます。その後、穏やかな揺れで室温で2時間インキュベートします。オルガノイドを再びペレット化した後、PBSに1%トリトンX-100で45%スクロースの1ミリメートルを加え、室温で2時間軽く振ります。
次に、1%トリトンX-100でPBSに60%スクロースの1ミリリットルを加える以外の手順を繰り返す。ペレットは、室温で3分間Gの800倍の遠心分離によりオルガノイドをペレット化し、上清の95%を除去した。紫外線下のペレットを観察して、上清の除去中に失われないことを確認します。
スクロースの濃度が高くなるほどペレットが緩くなります。残りの懸濁液の10~20マイクロリットルをチャンバーカバースリップに移し、共焦点顕微鏡に進みます。基底細胞と光細胞は、異なる形態を有するオルガノイドを形成する。
ほとんどの基底由来オルガノイドは培養7日後の大きさが似ていますが、ルミナル由来のオルガノイドは有意な不均一性を示します。さらに、ほとんどの基底由来オルガノイドは多層上皮に囲まれた内腔を含み、一方、単層上皮を有する中空から、カナル化しない細胞の多層コードを有する固体まで、形態に及ぶ。ウェスタンブロット分析は、基底および発光由来のオルガノイドが基底および発光原発細胞に関連する特徴を保持することを明らかにした。
基底由来オルガノイドは、基底マーカーサイトケラチン5のより高いレベルを発現し、一方、ルミナル由来オルガノイドは、より高いレベルの発光マーカーサイトケラチンを発現する。基底マーカーと発光マーカーの両方が、おそらく分化を示唆するバルク集団の基底および発光由来オルガノイドで検出された。基底由来オルガノイドは多層上皮を含み、外側の層は高レベルの基底マーカーp63を発現し、内層は検出不能なレベルを有する。
外層はまた、中程度のレベルの発光マーカーサイトケラチン8を発現し、内層は高レベルを有する。単層のルミナル由来オルガノイド中のすべての細胞はサイトケラチン8に対して陽性染色するが、核p63を含む細胞の選択のみが含まれる。マトリックスゲルを取り扱う際には、細胞をオルガノイド培養に入れる前に固まらないように注意する必要があります。
顕微鏡検査に使用されるDAPIは、皮膚刺激を引き起こす可能性があります。UV光も有害である可能性があります。適切な個人用保護具が不可欠です。
オルガノイドからRNAを収集してRNAシーケンシングを行い、オルガノイドの形成中や操作に応答して遺伝子発現プロファイルがどのように変化するかを教えてくれます。このモデルは前立腺の分野が上皮生物学の基本的な側面を研究し、発達および分化の調節因子を特定するために再生可能なex vivoのアッセイを持つことを可能にした。
概要
この研究は、分化メカニズムを調査するための貴重なモデルとして機能するマウス前立腺オルガノイドを確立するための改良された方法を提示しています。この記事では、タンパク質ライセート収集とオルガノイドの全身コンフォカル顕微鏡法による染色の技術について詳しく説明しています。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- オルガノイド技術
背景
- 3Dオルガノイドシステムは従来の2Dアッセイよりも生理学的に関連性があります。
- これらは、他の方法では研究が難しい生物学的プロセスへの洞察を提供します。
- オルガノイドは薬理学的および遺伝学的テストに使用できます。
- マトリックスの完全性を維持することは、オルガノイドの成功した成長に重要です。
研究の目的
- 前立腺オルガノイドを作成するための信頼性の高い方法を確立すること。
- 分析のためのタンパク質ライセートの収集を容易にすること。
- 詳細なイメージングのための全身コンフォカル顕微鏡法を可能にすること。
使用された方法
- マウスの基底および腔内前立腺上皮細胞の調製。
- マトリックスゲルと細胞を混合してオルガノイドを形成すること。
- オルガノイド培養のためのインキュベーションおよび培地補充プロトコル。
- 免疫蛍光染色およびコンフォカル顕微鏡技術。
主な結果
- 異なる形態のオルガノイドの成功的な確立。
- 後続の応用のためのタンパク質ライセートの効果的な収集。
- 全身染色およびイメージングの詳細なプロトコル。
- 前立腺細胞の分化メカニズムへの洞察。
結論
- 改良された方法は前立腺生物学の研究を強化します。
- オルガノイドは様々な操作をテストするための関連モデルを提供します。
- このアプローチは他のオルガノイドシステムに適応できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Establishing reproducible ex vivo models of prostate epithelial differentiation enables mechanistic de-risking of therapeutic targets in early discovery. The organoid assay supports target validation by allowing rapid, cost-effective evaluation of genetic and pharmacological manipulations on basal and luminal cell fate decisions. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by providing quantitative, morphology- and marker-based readouts of differentiation capacity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by assessing how genetic or pharmacological perturbations alter basal-to-luminal differentiation capacity in a genetically tractable system.
- Operational Value: Enable functional target validation using primary epithelial cells from any genetic background without extensive breeding.
- Predictive Value: Support portfolio triage by identifying modulators that promote or inhibit lineage-specific epithelial maturation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepare validated biological systems for downstream screening by generating sufficient organoid material for Western blot and confocal analysis within 7-10 days.
- Operational Value: Standardize assay readiness through reproducible organoid formation and defined plating densities for basal (100-2,000 cells/80µL) and luminal (2,000-10,000 cells/80µL) progenitors.
- Screening Readiness: Facilitate reliable compound evaluation via distinct organoid morphologies and marker expression patterns (e.g., cytokeratin 5 in basal-derived, cytokeratin 8 in luminal-derived organoids).
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintain disease-relevant system fidelity by preserving basal and luminal epithelial features ex vivo, enabling biomarker-aligned progression from discovery to preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Clarify pathway regulation by linking molecular manipulations to differentiation outcomes via complementary protein and imaging readouts.
- Risk-Adjusted Advancement: Inform go/no-go decisions by quantifying differentiation capacity shifts that predict in vivo epithelial behavior.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing mechanistic insights that support preclinical continuity and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of epithelial differentiation in response to perturbations.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through standardized organoid culture and recovery protocols compatible with Western blot and imaging workflows.
- Analytics: Generates measurable readouts including organoid morphology, cytokeratin layering, and marker expression levels that allow comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining epithelial identity and differentiation capacity ex vivo, supporting biomarker-relevant model systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating multiple genetic or pharmacological variables across projects due to its adaptability and low material cost.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in epithelial lineage regulation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of organoid generation and analysis across laboratories.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency via reduced reliance on in vivo models, and decreased late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of candidates based on validated effects on prostate epithelial differentiation capacity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation, 3D culture techniques, and confocal microscopy.
- Dependent on proper matrix gel handling and temperature control to prevent premature hardening.
- Necessitates standardized media replenishment and organoid recovery protocols to ensure consistency.
- Involves adaptation considerations when extending to other epithelial systems or genetic backgrounds.
- Limited by the technical challenge of matrix manipulation and the need for careful media removal to avoid disrupting organoid rings.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Plating Sorted Prostate Epithelial Cells into Primary Mouse Organoid Culture
3:29
Extracting Protein Lysate from Prostate Organoids for Western Blot Analysis
4:50
Fixing and Staining Prostate Organoids for Immunohistochemical Analysis by Whole-Mount Confocal Microscopy
6:44
Tissue Clearing and Mounting of the Stained Prostate Organoids for Whole-mount Confocal Microscopy
7:57
Results: Analysis of Lineage Marker Expression in Prostate Organoids by Western Blot and Whole-Mount Confocal Microscopy
9:44
Conclusion
