Name: コラーゲン誘発性関節炎モデルにおける組織炎症の分子経路を評価するためのマウス足処理のためのクライオ粉砕プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: 学ぶマウス足のクライオ粉砕法によるRNA・タンパク質抽出と炎症性分子プロファイル解析。この技術は関節炎モデルにおける疾患分子シグネチャの同定に有用です。

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著者たちは、原稿とナヴィン・ラオとジェニファー・タウンの批判的なレビューに対するエディス・ヤンセンの評価を賜ります。

すべての動物実験は、ヤンセンR&Dの制度動物ケア利用委員会(IACUC)の方針に従って行われました。
1. 極低温冷凍ミルベースの粉砕法
<ol><li>CIAの研究の終了時に、1.5%のイソフルランでマウスを犠牲にし、続いて子宮頸部脱臼を行った。</li>
	<li>組織処理の日には、すべての器具(スパチュラ、粉砕バイアルなど)をドライアイスで10分間冷やし、凍結損傷を避けるためにサーマルグローブを着用してください。</li>
	<li>図 1Aに示すように、ファーラインでハサミで後足をカットします。</li>
	<li>各足を1本の1.5 mLマイクロ遠心管に移し、すぐに液体窒素で凍結し、冷凍足を-80°Cで保存します。サンプルを1週間以上凍結したままにしないでください。</li>
	<li>図1Bに示すように、冷凍庫ミルに液体窒素を充填し、少なくとも10分間平衡化させます。</li>
	<li>未処理のサンプルをドライアイスに保管し、凍結融解サイクルを避けてください。</li>
	<li>ボトムスチールプラグで予冷した大型ポリカーボネート研削バイアルに1つのヒンドプを移し、予冷したスチールインパシエータを挿入し、予冷したトップスチールプラグでポリカーボネート研削バイアルを閉じます(図1C)。</li>
	<li>サンプルと一緒に大きなポリカーボネート粉砕バイアルを液体で事前に充填された冷凍庫に移し、器具の前面にあるゴム留め金で蓋を閉じます。</li>
	<li>液体窒素中で1分間冷やします。</li>
	<li>1秒あたり10サイクルで1分のプログラムに冷凍ミルを設定し、スタートボタンを押します。冷凍工場がサイクルを完了するのを待ちます。 注:スチールインモークターが前後に移動すると、機械は太鼓の音を出します。耳栓を使用して難聴を避けてください。</li>
	<li>冷凍ミルの蓋を開き、大きなポリカーボネート粉砕バイアルを取り出し、図1Dに示すように抽出器に入れる。上部のスチールプラグを取り外し、スチールプラグがポリカーボネートチューブから滑り出すまで、黒いハンドルに下向きの圧力をかけて取り外します。</li>
	<li>開いた大きなポリカーボネート粉砕バイアルをドライアイスに移します。あらかじめ冷やした鉗子でスチールインプレッシエーターを取り外します。</li>
	<li>冷凍粉末を予冷50mL円錐管に移します。</li>
	<li>重量30〜50mgの凍結粉末を、RNA抽出用のタール状凍結1.5mLマイクロ遠心管、タンパク質抽出用の冷凍粉末100〜200mgに含む。 注:凍結された粉末は、図 1Eに示すように白または薄いピンクの細かい砂のように見える必要があります。</li>
	<li>粉砕されたサンプルを-80°Cで保存し、24時間以内にRNAおよびタンパク質分離に進みます。</li>
</ol>2. RNA抽出
<ol><li>RLT緩衝液1mLあたり10μLのβ-メルカプトエタノール(β-ME)を加えます。</li>
	<li>組織の23.3 mL/mgの比率に対応するRLTバッファーの体積を計算し、凍結粉末でチューブにβ-MEを使用したRLTバッファの適切なボリュームを追加します。この比率は、マウスの足に最適であると経験的に決定した。</li>
	<li>10sのための3,000 RPMでサンプルをボルテックス。</li>
	<li>1 mLピペットで上下を10回精力的にピペットでよく混ぜます。</li>
	<li>20sの3,000 RPMで再びサンプルをボルテックス。</li>
	<li>チューブを13,000 x gで2分間遠心分離します。</li>
	<li>上清の700μLを新鮮なチューブに移し、700°Lの700°Lのエタノールを加えます。 注:<700 μL がチューブ内にある場合は、70% エタノールの同等の体積を追加しても続行できます。</li>
	<li>サンプルの700 μLをRNA精製カラムにロードします。</li>
	<li>30 s の ≥10,000 x gでチューブを遠心分離します。</li>
	<li>フロースルーを破棄し、サンプルの残りの部分を RNeasy 列にロードします。</li>
	<li>30 s の ≥10,000 x gでチューブを遠心分離します。</li>
	<li>流れを捨て、30sの遠心分離で700 μLのRW1バッファを追加してカラムを洗浄します。オプションDNASE消化を行う場合は、DNASE治療の前に350μLのRW1が添加される。 そして、DNASE処理の後にRW1の350 μLを追加します。</li>
	<li>オプション) DNase 消化ステップを実行し、製造元の指示に従います。</li>
	<li>500 μL の RPE バッファーを追加し、その後に 30 s の ≥10,000 x gで遠心分離を加えてチューブを 2 回洗浄します。</li>
	<li>2分間≥10,000 x gで遠心分離してカラムを乾燥させます。</li>
	<li>エルテRNAは、2分間≥10,000 x gで遠心分離50μLの水を加えて、流れを回収し、新しい1.5 mLチューブに移します。</li>
	<li>さらに分析する前に、研究者の選択方法を使用してRNAの量を決定し、-80°Cで保存します。</li>
</ol>3. タンパク質抽出
<ol><li>細胞培養グレードの水を用いて1x細胞溶解原液に10x細胞溶解原液を希釈する。</li>
	<li>プロテアーゼ阻害剤カクテルセットIを1mLの水で再構成し、100xプロテアーゼ阻害剤ストックを作ります。</li>
	<li>1x細胞溶解の9.9 mLにプロテアーゼ阻害剤の100 μLを追加し、1x最終原液を作ります。</li>
	<li>4 μL の氷冷 1x 細胞リシス バッファー/mg 組織粉末 (例えば、800 μL のリシス バッファーを 200 mg の組織粉末に) を加えます。</li>
	<li>チューブに5mmステンレスビーズを1つ追加します。</li>
	<li>60sの3,000 RPMでチューブをボルテックスし、チューブを濡れた氷に移し、次のサンプルに進みます。</li>
	<li>すべてのサンプルチューブを箱に入れ、1,000 RPM、1時間4°Cでロッカーの遠心分離機ボックスを振ります。 注:研究者は、ボックスを垂直に置くことは、ビーズとのより良い混合を容易にすることができることを見つけることができます。</li>
	<li>10,000 x gと 4 °C でチューブを 15 分間遠心分離します。</li>
	<li>新鮮なチューブに上清を転送し、上部の脂肪層を避けます。</li>
	<li>総タンパク質濃度を決定します。タンパク質リサートの10~30倍の希釈は、BCA試験に最適です。</li>
	<li>試料を1.5mLマイクロ遠心管にアリコートし、-80°Cで保存してからさらに分析してください。</li>
</ol>

<ol><li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+mechanisms+in+the+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).</li>
<li>McInnes, I. B., Schett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).</li>
<li>Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+value+of+animal+models+in+predicting+genetic+susceptibility+to+complex+diseases+such+as+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Research and Therapy. 11, 226(2009).</li>
<li>David, C. S., Taneja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+major+histocompatibility+complex+genes+in+murine+collagen-induced+arthritis%3A+a+model+for+human+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+the+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis.</a> American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).</li>
<li>Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+factors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Monographs+in+Allergy%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid factors in mice.</a> Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).</li>
<li>Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-induced+arthritis+as+an+animal+model+for+rheumatoid+arthritis%3A+focus+on+interferon-gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interferon+%26+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma.</a> Journal of Interferon & Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).</li>
<li>Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticytokine+treatment+of+established+type+II+collagen-induced+arthritis+in+DBA%2F1+mice.+A+comparative+study+using+anti-TNF+alpha+anti-IL-1+alpha%2Fbeta%2C+and+IL-1Ra%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra.</a> Arthritis & Rheumatology. 39, 797-809 (1996).</li>
<li>Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Animal models of rheumatoid arthritis.</a> European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).</li>
<li>Williams, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-induced+arthritis+as+a+model+for+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis.</a> Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).</li>
<li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Blockade+of+TNF-alpha+and+IL-17A+Alleviates+Progression+of+Collagen-Induced+Arthritis+without+Causing+Serious+Infections+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice.</a> Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).</li>
</ol>

著者BJ、SH、ML、RM、ML、TOおよびFSはヤンセン・リサーチ・アンド・デベロップメント社の従業員であり、親会社であるジョンソン・エンド・ジョンソン社の株主です。

経卵組織の分子経路を評価する科学的根拠は強いが、マウスCIAモデルの免疫プロファイリングに関する多くの報告は末梢血に焦点を当て、炎症を起こした足のタンパク質およびRNA分析データはかなり限られている。このバイアスのいくつかの考えられる理由があります: マウス足首関節は〜2 cm以下です。患部は、組織グラインダー、害虫やモルタル、シリカビーズ破壊、トリチュレーションまたは酵素消化のような伝統的な方法を使用して均質化することがしばしば困難である皮膚、骨および結合組織で構成されています。これらの方法は、典型的には、不完全な均質化、低タンパク質またはRNA収率、またはタンパク質分解および核酸分解による一貫性のない品質をもたらす。本明細書に記載される堅牢な方法は、単一の均一なサンプルから疾患の分子シグネチャを確立するための下流のプロテオミクスおよび転写プロファイリングの努力を可能にするために均質な粉砕された凍結粉末を生成するための詳細な手順を提供するソース。
このメソッドを実行する場合は、いくつかの重要な手順を考慮する必要があります。まず、マウスの足は、組織の収穫中に毛皮のラインで切断する必...

関節リウマチ(RA)は、関節に持続性対称性腺炎を有し、皮膚、心臓、肺、眼1などの器官の余分な関節関与を有する慢性全身性炎症性疾患である。免疫応答の全身症状はヒト患者において明らかであるが、RA病理の特徴の1つは、静脈組織における免疫細胞の浸潤およびスイノビアル線維芽細胞の増殖である2である。
ヒトRAと同様に、マウスコラーゲン誘発関節炎(CIA)モデルは、滑膜組織および全身コンパートメントにおける活性免疫応答を有する強い組織炎症を引き起こす。CIAモデルに対する異なるマウス株の感受性は、主要組織適合性複合体(MHC)ハプロタイプおよび抗原特異的T細胞およびB細胞相互作用3、4にリンクする。さらに、自己抗体産生、免疫複合体沈着、骨髄細胞活性化、多関節状症状および眼窩免疫浸潤を伴うパンヌス形成を含むヒトRAにおける多くの病原性経路も、このモデルで明らかである。5、6.研究者は、抗炎症サイトカイン治療の効果を調査するために、この確立されたCIAモデルを採用しています7.抗TNFαおよび抗IL-6のような自己免疫または炎症性疾患に対して承認された多くの生物学的製剤は、CIAモデル8、9において有効であることが見出される。
静脈組織における免疫系の相互作用をプロファイリングすることは、RAの病因に関連する分子機構を解明するために重要である。人間の臨床環境では、超音波画像診断の指導の下で針の静脈生検を行うことが一般的です。前臨床の設定では、マウス関節の小さなアーキテクチャは、不可能でない場合、生検手順がはるかに困難になります。最近、異なる終点に影響を与える薬物の組み合わせを評価し、組み合わせアプローチ10で疾患を解決するために、マウスCIAモデルの利用を実証した。炎症を起こしたマウスの足を均質な微粉末に処理し、RNAとタンパク質を抽出する下流プロセスを確立するために、極低温冷凍ミルベースの粉砕法が採用されました。この方法は、RNAとタンパク質を酵素的および化学的な分解プロセスから保護し、単一の均質化されたサンプルソースに複数の分析方法を適用することを可能にします。

<table><tbody><tr><td>5 mmのステンレス鋼のビーズ</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>ベータ メルカプトエタノール</td><td>Σ</td><td>M6250</td><td>RNASEの酵素を禁じるサンプル還元剤</td></tr><tr><td>生物分析装置のキット</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>RNAの修飾のキット</td></tr><tr><td>b-mercaptoethanol</td><td>Σ</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養の等級水</td><td>Corning</td><td>25-055-CI</td><td>水</td></tr><tr><td>細胞溶解原液</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9803</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフチューブ</td> エ<td>ッペンドルフ</td><td>22363204</td><td>マイクロチューブ</td></tr><tr><td>エッペンドルフチューブ遠心分離ボックス</td><td>ナルゲン</td><td>5055</td><td>エッペンドルフチューブを水平チューブ配置で保持するためのボックス</td></tr><tr><td>エバーラスト 247 可変速ロッカー</td><td>ベンチマークサイエンティフィック</td><td>BR5000</td><td></td></tr><tr><td>フリーザーミル</td><td>Spex Sample Prep</td><td>6875</td><td>足を粉砕粉末に加工するための冷凍庫/ミル</td></tr><tr><td>グラインドバイアル</td><td>Spex サンプル調製</td><td>6801</td><td>足を粉砕粉末に加工するためのポリカーボネートバイアル</td></tr><tr><td>ピアスBCAキット</td><td>ピアス</td><td>23225</td><td>キット 総タンパク質定量用</td></tr><tr><td>キット プロテアーゼ阻害剤 カクテルセット 1</td><td>カルビオケム</td><td>539131</td><td>プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>プロテインBCAキット</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Quantigeneキット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>QP1013</td><td>bDNA分析キット</td></tr><tr><td>冷蔵微量遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>遠心分離</td></tr><tr><td>RLTバッファー</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>RNA抽出バッファー</td></tr><tr><td>RNeasyミニキット</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>(RNeasyカラム、RLTバッファー、RW1バッファーを含む)</td></tr><tr><td>シェーカー</td><td>ベンチマーク サイエンティフィック</td><td>BR5000</td><td>ロッカー/シェーカー</td></tr><tr><td>スパチュラ</td><td>VWR</td><td>10806-412</td><td>粉末移送用スパチュラ</td></tr><tr><td>ステンレス鋼ビーズ</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td>タンパク質抽出中の混合用ビーズ</td></tr><tr><td>チューブ抽出器</td><td>Spex サンプル調製</td><td>6884</td><td>粉砕バイアルの上部を除去するための抽出器</td></tr><tr><td>ボルテクサー</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td>サンプルミキシング</td></tr></tbody></table>

コラーゲン誘発性関節炎モデルにおける組織炎症の分子経路を評価するためのマウス足処理のためのクライオ粉砕プロトコル

A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model

局所組織における分子変化のプロファイリングは、生体内における治療候補の作用のメカニズムを理解するために重要である。関節炎の研究の分野では、多くの研究は、骨、軟骨、筋肉、間質細胞および免疫細胞の複雑な混合物で構成される炎症性関節に焦点を当てています。ここでは、炎症を起こしたマウスの足を極低温で制御された環境で均質な粉砕サンプルに破壊する信頼性と堅牢な機械的方法を確立しました。タンパク質およびRNAリサートは、局所組織におけるプロテオミクスおよび転写エンドポイントおよび関連する疾患経路の分子特性評価を可能にするために処理された。

ここで、図2AにCIAマウスの前足から抽出したRNAの代表的なゲル画像可視化を示す。28S rRNAおよび18S rRNAバンドは、すべてのサンプルが十分な量の無傷のRNAを有しっていることを示す。次に、図2Bにタンパク質BCA分析に基づく総タンパク質濃度の代表的な散乱プロットを示す。ナイーブマウス、CIAマウスまたはCIAマウスからの総タンパク質濃度は、グループ間で同等である。タンパク質抽出物中の炎症性サイトカインおよびケモカインの濃度を決定するために、ルミネックス分析を行った。図2Cに、正規化サイトカインおよびケモカイン(pg/mg総タンパク質)の濃度の代表的な散布図を示す。ナイーブマウスと比較して、CIAマウスではいくつかのサイトカインが上昇し、抗IL17A抗体による治療は、いくつかのサイ...

液体窒素冷凍庫ミルを用いてマウス足を処理する極低温粉砕法を開発し、組織から抽出されたRNAまたはタンパク質の収率と品質を向上させ、炎症に関連する分子プロファイルの解析を可能にした。応答。

Profiling molecular changes in local tissues is crucial to understand the mechanism(s) of action of therapeutic candidates in vivo. In the field of ...

局所組織における分子プロファイルの評価は、疾患関連の前臨床モデルで評価される活性医薬品の作用機序を理解するための重要なステップである。関節炎研究の分野では、関心のある局所組織環境は、骨、軟骨、筋肉、免疫細胞の複雑な混合物で構成される小さな体重負荷関節です。ここでは、極低温制御環境におけるこの複雑な組織環境の機械的破壊および/または粉砕のための信頼性の高い堅牢な方法について説明します。この方法は、下流のプロテオームおよび転写プロファイリングの取り組みを生成し、単一の均一なサンプル源から疾患の分子シグネチャを確立するために使用することができます。この方法は、他の多くの古い技術とは異なり、均質な粉末を生成します。さらに、古い温度分離手順は、高品質のRNAの分離を可能にします。この方法は、その後、対象となる関連疾患経路の分子特性を可能にする下流プロテオームおよび転写プロファイリングを生成するために使用することができる。この方法は、組織から分子シグネチャを導き出しているあらゆる研究分野に関する洞察を提供することができます。この方法は、構成成分を解化するのが密で困難な複雑な組織システムに拡張することができます。ここまでは評価されていませんが、耳や骨のような密な軟骨組織への応用が見込まれます。計量のために粉末をチューブに移す時間的に重要な性質は、練習を要するものです。時間がかかりすぎると、粉末が解凍し始め、アモルファスになります。手順に慣れるまで、サンプルの数を 10 ~ 15 に制限することが重要です。組織処理の日には、最低10分間ドライアイスに必要なすべての器具をプレチルします。極端な寒さによって被害を受けないように、熱手袋を着用してください。次に、準備した各マウス足を別々の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、すぐに液体窒素で凍結します。凍った足をマイナス80°Cで保存します。続行する準備ができたら、冷凍工場に液体窒素を充填し、少なくとも10分間平衡させます。未処理のサンプルをドライアイスの上に置き、凍結/解凍サイクルを避けるためにそこに保管してください。その後、1つの後ろ足を底のスチールプラグで冷やした大きなポリカーボネート研削バイアルに移します。事前に冷やしたスチールインコンサーを挿入し、ポリカーボネート研削バイアルを、冷蔵トップスチールプラグで閉じます。サンプルと一緒に大きなポリカーボネート研削バイアルをプレフィルドフリーザーミルに移し、器具の前面にあるゴム製留めで蓋を閉じます。液体窒素中でサンプルを1分間冷まします。次に、1秒あたり10サイクルの1分間のプログラムに冷凍工場を設定します。実行ボタンを押して、冷凍工場がサイクルを完了するのを待ちます。この後、冷凍工場の蓋を開け、大きなポリカーボネート粉砕バイアルを取り出します。粉砕バイアルを抽出器に入れ、スチールプラグがポリカーボネートチューブから滑り落ちるまで黒いハンドルに下向きの圧力をかけ、上部のスチールプラグを取り外します。開いた研削バイアルをドライアイスに移し、あらかじめ冷やされた鉗子を使用してスチールインコンプレクターを取り外します。冷凍粉末を冷やした50ミリリットルの円錐管に移します。冷凍粉末の30〜50ミリグラムをRNA抽出用に階層化された1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに、タンパク質抽出のために100〜200ミリグラムの間で計量します。粉砕したサンプルをマイナス80°Cで保存し、24時間以内にRNAとタンパク質の分離に進みます。まず、RLTバッファーのミリリットルごとにβ-メルカプトエタノールを10マイクロリットル添加する。組織のミリグラム当たり23.3ミリリットルの割合に対応するRLTバッファの体積を計算し、凍結粉末でチューブにβ-メルカプトエタノールを有するRLTバッファーの適切な量を追加します。3,000 RPMで10秒間、試料を渦出させる。1ミリリットルのピペッタを使用して10回激しく上下にピペットを作り、サンプルを3,000 RPMで20秒間再び渦巻きます。遠心分離機を13,000回gで2分間、上清の700マイクロリットルを新鮮なチューブに移す。70%エタノール700マイクロリットルをこのチューブに加え、700マイクロリットルのサンプルをRNA精製カラムに積み込みます。30秒間少なくとも10,000回gの速度でチューブを遠心分離する。フロースルーを破棄し、サンプルの残りの部分をRNeasyカラムにロードし、チューブを少なくとも10,000倍gの速度で30秒間遠心します。フロースルーを廃棄し、700マイクロリットルのRW1バッファーを加え、少なくとも10,000倍gの速度を30秒間遠心してカラムを洗浄します。オプションのDNAse消化を行う場合、350マイクロリットルのRW1が、DNAse処理の前に添加される。そして、DNAse処理後、RW1の追加350マイクロリットルが添加される。その後、500マイクロリットルのRPEバッファーと遠心分離機を少なくとも10,000回gの速度で30秒間加えて、毎回フロースルーを廃棄するようにして、カラムを2回洗浄します。この後、少なくとも10,000倍gの速度で2分間遠心してカラムを乾燥させます。50マイクロリットルの水を加え、2分間少なくとも10,000倍の速度で遠心分離機を加えてRNAを溶出する。フロースルーを収集し、新しい1.5ミリリットルチューブに転送します。研究者の選択方法を使用してRNAの量を決定し、さらに分析する前にマイナス80°Cで保存します。10X細胞溶解ストック溶液を細胞培養グレードの水で1X細胞溶解ストック溶液に希釈します。1ミリリットルの水でセットしたプロテアーゼ阻害剤を再構成し、100Xプロテアーゼ阻害剤ストックを作ります。1X細胞溶解バッファーの9.9ミリリットルにプロテアーゼ阻害剤の100ミリリットルを加え、1X最終ストック溶液を得る。ティッシュパウダーのミリグラムごとに氷冷細胞溶菌バッファーを4マイクロリットル加え、チューブに5ミリメートルのステンレスビーズを1つ加えます。3,000 RPMで60秒間、チューブを渦出させる。チューブを湿った氷に移し、次のサンプルに進みます。さらに、研究者は、ボックスを垂直に置くことで、ビーズとのより良い混合を容易にすることができることを発見するかもしれません。1時間後、チューブを10,000倍g、摂氏4度で15分間遠心分離します。上層を新鮮なチューブに移し、上部の脂肪層を避けるようにします。タンパク質の総濃度を決定します。アリコート各サンプルを1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに入れ、さらに分析を行う準備ができるまで80°Cの負の80度で保存します。本研究では、組織から抽出されたRNAまたはタンパク質の収量と品質を改善し、炎症反応に関連する分子プロファイルの分析を可能にするために、マウスの足を処理するために極低温化法が使用されます。代表的なゲル画像の可視化は、CIAマウスの前足から抽出されたRNAを示す。28S rRNAおよび18S rRNAバンドは、すべてのサンプルに十分な量の無傷RNAがあることを示している。タンパク質BCA分析に基づく全タンパク質濃度の代表的な散布図をここに示す。ナイーブマウス、CIAマウス、または様々な治療下のCIAマウスからの総タンパク質濃度は、グループ間で比較可能である。その後、ルミネックス分析を行い、タンパク質抽出物中の炎症性サイトカインおよびケモカインの濃度を決定します。正規化されたサイトカインおよびケモカインの濃度の代表的な散布図は、ナイーブマウスと比較すると、いくつかのサイトカインがCIAマウスで上昇し、抗IL17A抗体による治療がいくつかのサイトカインの産生を有意に阻害することを明らかにした。マイクロアレイ解析は、CIAの転写法変化および治療関連の効果を評価するために行われる。CIAマウスの遺伝子の代表的なヒートマッププロットは、ナイーブマウスと比較して有意に増加した。この手順を実行する場合、研究者はチューブと粉末がドライアイスから締め出される時間を最小限に抑えることが重要です。これは、分解されたRNAおよびタンパク質に対する粉末の解凍とその後の問題を防ぐのに役立ちます。この技術によって生成される分子シグネチャの高品質は、研究者が治療が与えるユニークなプロファイルを尋問することを可能にし、さらに関節炎の状態を治療するために使用できるメカニズムの分化を可能にする。この技術は、耳や骨のような多くの密な組織を抽出して、関心のあるこれらの組織の分子シグネチャをさらに評価するために使用することができます。治療が疾患の分子シグネチャをどのように調節するかを理解することで、どのような特定のシグナル経路が変調されているかをよりよく評価できます。そしておそらくさらに重要なことは、評価されている治療メカニズムでどのような経路が調節されていないか。液体窒素やドライアイスを使用する場合、適切に評価された手袋やフェイスシールドなどの個人用保護具を使用することが不可欠です。数秒以上皮膚の暴露は重度の火傷を引き起こす可能性があります。大量のドライアイスを扱う場合、ドライアイスが二酸化炭素を放出するので、換気の良い場所で作業することが重要です。

a-cryo-pulverization-protocol-for-processing-mouse-paws-to-evaluate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、マウスの自己免疫性関節炎に対する細胞ベースの治療法を紹介しています。オボアルブミン特異的受容体を発現するiPS細胞由来T制御細胞に、アジュバントで乳化したメチル化ウシ血清アルブミン(mBSA)を注入します。マウス抗原提示細胞(APC)は、mBSAを処理してT細胞に提示し、T細胞の活性化と膝関節の滑膜への移動を促進します。その後の注射では、左膝にmBSAのみを使用し、右膝にmBSAとオボアルブミンの組み合わせを投与します。左膝では、mBSAに対する免疫応答が関節炎を引き起こし、右膝では、オボアルブミンと相互作用するT制御細胞が炎症を軽減し、関節炎の症状を改善します。...

マウスモデルにおける自己免疫性関節炎の細胞ベース療法

関節炎の痛みの誘発尺度を開発し、異なる化学物質誘発関節炎モデルマウスにおける自発痛を測定するための標準化された方法と相まっています。これらの措置は敏感で、関節痛の種類ごとに再現です。...

自発および誘発単膝痛症マウスモデルでの痛み対策

ここでは、インビボとインビトロの両方で好中球の移動および浸潤を評価する3つの方法を紹介する。これらの方法は、好中球移行を標的とする有望な治療薬を発見するために使用することができる。...

マウスの好中球の遊走と浸潤の検出

本プロトコルは、内側ミニスコティビアル靭帯を切断することによってマウス膝を不安定化させた後の関節軟骨の表面における制御されたマイクロブレードの引っかき傷を記載する。この動物モデルは、骨棘形成、骨硬化症、および初期段階の痛みの研究に適した変形性関節症(OA)の加速型を提示します。...

加速変形性関節症の内側半月板および軟骨スクラッチマウスモデルの不安定化

本研究は、マウス炎症性関節炎組織から滑膜マクロファージおよび線維芽細胞を単離するための修正されたプロトコルを提供する。...

マウス関節炎組織からの初代滑膜マクロファージおよび線維芽細胞の単離と培養

石膏固定化誘発変形性膝関節症ラットに対して実行されるTuina操作のプロトコルを提示します。予備的な結果に基づいて、この方法の有効性は炎症と軟骨喪失の減少に依存していることが示唆されました。...

変形性膝関節症ラットの炎症と軟骨喪失を軽減するためのTuina操作

この研究は、皮外(EC)免疫を通じてマウスの免疫応答を調節する皮膚の役割を示しています。タンパク質抗原によるEC免疫は、接触過敏症の免疫応答を抑制したり、病原体に関連する分子パターンと組み合わせることで皮膚誘発性の抑制を逆転させることができます。EC免疫は、針を使わない効果的な免疫療法として有望視されています。...

上皮誘導免疫調節のマウスモデル

関節の生体内画像診断は、白血球の移動挙動や炎症関節内の分子動態を明らかにする貴重な技術です。ここでは、タイプIIコラーゲン誘発性関節炎(CIA)のマウスモデルを用いた関節のin...

インビボ 画像診断により関節内の白血球の移動行動が明らかになります

ここでは、SKGマウスからのCD4+...

マウスにおける関節リウマチの養子移植モデル

パイエル板を覆う特殊な濾胞関連上皮におけるM細胞は腸管関連リンパ系組織における粘膜免疫監視に重要な役割を果たす。ここでは、M細胞による細菌のトランスサイトーシスのために評価方法を説明...

M細胞による細菌の取り込みを評価するパイエル板腸管ループアッセイを連結したマウスのアプリケーション

学ぶマウス足のクライオ粉砕法によるRNA・タンパク質抽出と炎症性分子プロファイル解析。この技術は関節炎モデルにおける疾患分子シグネチャの同定に有用です。

コラーゲン誘発性関節炎モデルにおける組織炎症の分子経路を評価するためのマウス足処理のためのクライオ粉砕プロトコル

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