コラーゲン誘発性関節炎モデルにおける組織炎症の分子経路を評価するためのマウス足処理のためのクライオ粉砕プロトコル

局所組織における分子プロファイルの評価は、疾患関連の前臨床モデルで評価される活性医薬品の作用機序を理解するための重要なステップである。関節炎研究の分野では、関心のある局所組織環境は、骨、軟骨、筋肉、免疫細胞の複雑な混合物で構成される小さな体重負荷関節です。ここでは、極低温制御環境におけるこの複雑な組織環境の機械的破壊および/または粉砕のための信頼性の高い堅牢な方法について説明します。

この方法は、下流のプロテオームおよび転写プロファイリングの取り組みを生成し、単一の均一なサンプル源から疾患の分子シグネチャを確立するために使用することができます。この方法は、他の多くの古い技術とは異なり、均質な粉末を生成します。さらに、古い温度分離手順は、高品質のRNAの分離を可能にします。

この方法は、その後、対象となる関連疾患経路の分子特性を可能にする下流プロテオームおよび転写プロファイリングを生成するために使用することができる。この方法は、組織から分子シグネチャを導き出しているあらゆる研究分野に関する洞察を提供することができます。この方法は、構成成分を解化するのが密で困難な複雑な組織システムに拡張することができます。

ここまでは評価されていませんが、耳や骨のような密な軟骨組織への応用が見込まれます。計量のために粉末をチューブに移す時間的に重要な性質は、練習を要するものです。時間がかかりすぎると、粉末が解凍し始め、アモルファスになります。

手順に慣れるまで、サンプルの数を 10 ~ 15 に制限することが重要です。組織処理の日には、最低10分間ドライアイスに必要なすべての器具をプレチルします。極端な寒さによって被害を受けないように、熱手袋を着用してください。

次に、準備した各マウス足を別々の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、すぐに液体窒素で凍結します。凍った足をマイナス80°Cで保存します。続行する準備ができたら、冷凍工場に液体窒素を充填し、少なくとも10分間平衡させます。

未処理のサンプルをドライアイスの上に置き、凍結/解凍サイクルを避けるためにそこに保管してください。その後、1つの後ろ足を底のスチールプラグで冷やした大きなポリカーボネート研削バイアルに移します。事前に冷やしたスチールインコンサーを挿入し、ポリカーボネート研削バイアルを、冷蔵トップスチールプラグで閉じます。

サンプルと一緒に大きなポリカーボネート研削バイアルをプレフィルドフリーザーミルに移し、器具の前面にあるゴム製留めで蓋を閉じます。液体窒素中でサンプルを1分間冷まします。次に、1秒あたり10サイクルの1分間のプログラムに冷凍工場を設定します。

実行ボタンを押して、冷凍工場がサイクルを完了するのを待ちます。この後、冷凍工場の蓋を開け、大きなポリカーボネート粉砕バイアルを取り出します。粉砕バイアルを抽出器に入れ、スチールプラグがポリカーボネートチューブから滑り落ちるまで黒いハンドルに下向きの圧力をかけ、上部のスチールプラグを取り外します。

開いた研削バイアルをドライアイスに移し、あらかじめ冷やされた鉗子を使用してスチールインコンプレクターを取り外します。冷凍粉末を冷やした50ミリリットルの円錐管に移します。冷凍粉末の30〜50ミリグラムをRNA抽出用に階層化された1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに、タンパク質抽出のために100〜200ミリグラムの間で計量します。

粉砕したサンプルをマイナス80°Cで保存し、24時間以内にRNAとタンパク質の分離に進みます。まず、RLTバッファーのミリリットルごとにβ-メルカプトエタノールを10マイクロリットル添加する。組織のミリグラム当たり23.3ミリリットルの割合に対応するRLTバッファの体積を計算し、凍結粉末でチューブにβ-メルカプトエタノールを有するRLTバッファーの適切な量を追加します。

3,000 RPMで10秒間、試料を渦出させる。1ミリリットルのピペッタを使用して10回激しく上下にピペットを作り、サンプルを3,000 RPMで20秒間再び渦巻きます。遠心分離機を13,000回gで2分間、上清の700マイクロリットルを新鮮なチューブに移す。

70%エタノール700マイクロリットルをこのチューブに加え、700マイクロリットルのサンプルをRNA精製カラムに積み込みます。30秒間少なくとも10,000回gの速度でチューブを遠心分離する。フロースルーを破棄し、サンプルの残りの部分をRNeasyカラムにロードし、チューブを少なくとも10,000倍gの速度で30秒間遠心します。

フロースルーを廃棄し、700マイクロリットルのRW1バッファーを加え、少なくとも10,000倍gの速度を30秒間遠心してカラムを洗浄します。オプションのDNAse消化を行う場合、350マイクロリットルのRW1が、DNAse処理の前に添加される。そして、DNAse処理後、RW1の追加350マイクロリットルが添加される。

その後、500マイクロリットルのRPEバッファーと遠心分離機を少なくとも10,000回gの速度で30秒間加えて、毎回フロースルーを廃棄するようにして、カラムを2回洗浄します。この後、少なくとも10,000倍gの速度で2分間遠心してカラムを乾燥させます。50マイクロリットルの水を加え、2分間少なくとも10,000倍の速度で遠心分離機を加えてRNAを溶出する。

フロースルーを収集し、新しい1.5ミリリットルチューブに転送します。研究者の選択方法を使用してRNAの量を決定し、さらに分析する前にマイナス80°Cで保存します。10X細胞溶解ストック溶液を細胞培養グレードの水で1X細胞溶解ストック溶液に希釈します。

1ミリリットルの水でセットしたプロテアーゼ阻害剤を再構成し、100Xプロテアーゼ阻害剤ストックを作ります。1X細胞溶解バッファーの9.9ミリリットルにプロテアーゼ阻害剤の100ミリリットルを加え、1X最終ストック溶液を得る。ティッシュパウダーのミリグラムごとに氷冷細胞溶菌バッファーを4マイクロリットル加え、チューブに5ミリメートルのステンレスビーズを1つ加えます。

3,000 RPMで60秒間、チューブを渦出させる。チューブを湿った氷に移し、次のサンプルに進みます。さらに、研究者は、ボックスを垂直に置くことで、ビーズとのより良い混合を容易にすることができることを発見するかもしれません。

1時間後、チューブを10,000倍g、摂氏4度で15分間遠心分離します。上層を新鮮なチューブに移し、上部の脂肪層を避けるようにします。タンパク質の総濃度を決定します。

アリコート各サンプルを1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに入れ、さらに分析を行う準備ができるまで80°Cの負の80度で保存します。本研究では、組織から抽出されたRNAまたはタンパク質の収量と品質を改善し、炎症反応に関連する分子プロファイルの分析を可能にするために、マウスの足を処理するために極低温化法が使用されます。代表的なゲル画像の可視化は、CIAマウスの前足から抽出されたRNAを示す。

28S rRNAおよび18S rRNAバンドは、すべてのサンプルに十分な量の無傷RNAがあることを示している。タンパク質BCA分析に基づく全タンパク質濃度の代表的な散布図をここに示す。ナイーブマウス、CIAマウス、または様々な治療下のCIAマウスからの総タンパク質濃度は、グループ間で比較可能である。

その後、ルミネックス分析を行い、タンパク質抽出物中の炎症性サイトカインおよびケモカインの濃度を決定します。正規化されたサイトカインおよびケモカインの濃度の代表的な散布図は、ナイーブマウスと比較すると、いくつかのサイトカインがCIAマウスで上昇し、抗IL17A抗体による治療がいくつかのサイトカインの産生を有意に阻害することを明らかにした。マイクロアレイ解析は、CIAの転写法変化および治療関連の効果を評価するために行われる。

CIAマウスの遺伝子の代表的なヒートマッププロットは、ナイーブマウスと比較して有意に増加した。この手順を実行する場合、研究者はチューブと粉末がドライアイスから締め出される時間を最小限に抑えることが重要です。これは、分解されたRNAおよびタンパク質に対する粉末の解凍とその後の問題を防ぐのに役立ちます。

この技術によって生成される分子シグネチャの高品質は、研究者が治療が与えるユニークなプロファイルを尋問することを可能にし、さらに関節炎の状態を治療するために使用できるメカニズムの分化を可能にする。この技術は、耳や骨のような多くの密な組織を抽出して、関心のあるこれらの組織の分子シグネチャをさらに評価するために使用することができます。治療が疾患の分子シグネチャをどのように調節するかを理解することで、どのような特定のシグナル経路が変調されているかをよりよく評価できます。

そしておそらくさらに重要なことは、評価されている治療メカニズムでどのような経路が調節されていないか。液体窒素やドライアイスを使用する場合、適切に評価された手袋やフェイスシールドなどの個人用保護具を使用することが不可欠です。数秒以上皮膚の暴露は重度の火傷を引き起こす可能性があります。

大量のドライアイスを扱う場合、ドライアイスが二酸化炭素を放出するので、換気の良い場所で作業することが重要です。