Name: アストロサイトにおけるオルガネラおよび他の貨物の細胞内輸送の可視化と解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: 学ぶアストロサイトにおけるオルガネラと膜タンパク質の細胞内輸送をマウスアストロサイト培養細胞で可視化するライブイメージング法。この手法は神経変性疾患の研究や細胞応答の理解に活用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DNLは、シモンズ学者としてチャペルヒル(UNC)医学部のノースカロライナ大学によってサポートされました。TWR は UNC PREP グラント R25 GM089569 によってサポートされました。UNC神経科学センター顕微鏡コア施設を用いる研究は、NIH-NINDS神経科学センター支援助成金P30 NS045892及びNIH-NICHD知的発達障害研究センター支援助成金U54の助成を受け、一部支援を受けた。HD079124

<ol><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li>
<li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tripartite+synapses%3A+Glia%2C+the+unacknowledged+partner%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner.</a> Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).</li>
<li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+in+mammalian+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li>
<li>Allaman, I., Bélanger, M., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-neuron+metabolic+relationships%3A+for+better+and+for+worse%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse.</a> Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).</li>
<li>Chung, W. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glial+cells+in+synapse+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The role of glial cells in synapse elimination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).</li>
<li>Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Control+Synapse+Formation%2C+Function%2C+and+Elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370(2015).</li>
<li>Shin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+glutamate+transporter+GLAST+in+membranes+of+cultured+astrocytes+in+the+presence+of+glutamate+transport+substrates+and+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP.</a> Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).</li>
<li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeleton+and+vesicle+mobility+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes.</a> Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).</li>
<li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+AQP4+surface+expression+via+vesicle+mobility+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes.</a> Glia. 61 (6), 917-928 (2013).</li>
<li>Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab4+and+Rab5+GTPase+are+required+for+directional+mobility+of+endocytic+vesicles+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes.</a> Glia. 60 (4), 594-604 (2012).</li>
<li>Chiu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HYS-32-Induced+Microtubule+Catastrophes+in+Rat+Astrocytes+Involves+the+PI3K-GSK3beta+Signaling+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0126217(2015).</li>
<li>Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-assisted+altered+trafficking+of+astrocytic+gap+junction+protein+connexin+43+is+associated+with+depletion+of+connexin+47+during+mouse+hepatitis+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).</li>
<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visual Experiments. (71), e50079(2013).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li>
<li>Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+produce+interferon+that+enhances+the+expression+of+H-2+antigens+on+a+subpopulation+of+brain+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells.</a> The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).</li>
<li>Zala, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+glycolysis+provides+on-board+energy+for+fast+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport.</a> Cell. 152 (3), 479-491 (2013).</li>
<li>Cordelières, F. P. IJ KymoToolBox. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox">https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</a> (2016).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

ここでは、高純度一次マウス皮質MDアストロサイトにおけるタイムラプスビデオ顕微鏡を用いて、蛍光タグ付きオルガネラおよび目的の膜タンパク質を発現、視覚化、追跡する実験的アプローチについて説明する。また、粒子ダイナミクスを測定する方法論についても概説する。一次星状細胞におけるタンパク質および小器官ダイナミクスの直接可視化は、インビトロでこれらの細胞における細胞内輸送の調節を研究するための強力なツールを提供する。
上記のマウスMDアストロサイト培養を確立するための方法論は、他の公開プロトコル13、14、15からのステップを組み合わせたものであり、より単純な方法と高純度と品質の両方をもたらす文化。AraC15処理と振盪ベースの精製13、14の組み合わせは、98%(GFAP+細胞総細胞の比率によって評価される)と高い純度を有する星状細胞培...

アストロサイトは、成人中枢神経系で最も豊富な細胞であり、そこではユニークな発達および恒容性機能1を実行する。アストロサイトは、シナプス形成を促進する神経伝達物質受容体、トランスポーター、および細胞接着分子を含む三分詞シナプスの一部として、前および後の末端との直接接触を通じてシナプスの発達を調節するとニューロン-星状細胞通信2.さらに、アストロサイトはシナプス伝達を積極的に制御し、シナプス裂から興奮性神経伝達物質を迅速に除去し、神経伝達物質をリサイクルし、シナプス剪定に参加することにより、神経興奮毒性を防ぎます3,4,5,6.これらの非常にインタラクティブな機能を可能にするために、アストロサイトは、他のグリア細胞と、細胞接着分子、アクアポリン、イオンチャネルを含む特殊な膜タンパク質を介してニューロンと、自分自身の間で通信します。神経伝達物質トランスポーター、およびギャップ接接点分子。アストロサイトは、細胞内および細胞外環境の変動に応じて、これらのタンパク質の表面レベルを積極的に変化させる7.さらに、ミトコンドリア、脂質液滴、分解およびリサイクルオルガネラのレベルと分布の変化は、エネルギー供給、代謝物の利用可能性、および星状細胞機能に不可欠な細胞クリアリングプロセスを調節し、生存。
アストロサイトにおける膜タンパク質およびオルガネラの人身売買および位置の動的変化は、貨物運動性を促進する運動タンパク質およびアダプターの協調機能によって促進される8、9。同様に、膜タンパク質の表面レベルは、内部化およびリサイクルイベント10を通じて変調される。これらの貨物は、アクチン、微小管、およびおそらく中間フィラメントトラック8の複雑なネットワークを介して輸送されます。成長する微小管プラス末端に蓄積する末結合タンパク質1(EB1)の免疫蛍光染色に基づく研究は、微小管の鎖束が末端から放射し、そのプラス端を向いて拡張することを示唆している。周辺11.しかし、生細胞イメージングを用いて微小管やその他の細胞骨格素子の組織と極性を総合的に調べると、まだ不足している。オルガネラや膜タンパク質のダイナミクスの基礎となるメカニズムの多くは、ニューロンやその他の細胞型で広く研究されているが、アストロサイトの貨物運動性はあまりよく理解されていない。アストロサイトにおけるタンパク質およびオルガネラ分布の変化に関する我々の現在の知識のほとんどは、貨物ダイナミクス7の正確な空間的および時間的検査を妨げる固定製剤の従来の抗体ベースの標識に基づいている。 12.
ここでは、高純度の一次マウス星状細胞培養におけるライブイメージング用膜タンパク質および小器官に標識する方法について説明する。このプロトコルを使用して、ギャップ接合タンパク質コネキシン43(Cx43-GFP)および興奮性アミノ酸を含むトランスフェクト星状細胞における緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付き膜タンパク質の動的局在を追跡する例を提供します。トランスポーター1(EAAT1-GFP)。また、蛍光酸性プローブを用いて酸性小器官を可視化し、生きた星状細胞におけるその人身売買のダイナミクスに従うことも説明する。最後に、タイムラプスデータを分析して、個々の貨物の輸送パラメータを抽出して評価する方法を示します。

<table><tbody><tr><td>2.5% トリプシン (10倍)</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-203-637</td><td>Sorvall ST8 遠心分離機</td></tr><tr><td>細胞培養グレード Water</td><td>Gen Clone</td><td>25-511</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>WSN-AXIOVERT A1</td><td>Vert.A1 倒立スコープ、蛍光機能を備えた</td></tr><tr><td>倒立組織培養顕微鏡シトシンアラビノシド</td><td>シグマ</td><td>C1768-100MG(</td><td>AraC) 凍結乾燥粉末を滅菌細胞培養グレードの水に溶解して10mMのストックを作り、分注して長期保存のために凍結</td></tr>します <tr><td>DAPI</td><td>シグマ</td><td>D9542-5MG</td><td>凍結乾燥粉末を最大濃度20mg/mlまで脱イオン水に溶解し、必要に応じて加熱または超音波処理します。300 nMで対比染色に使用してください。</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Stemi 305</td></tr><tr><td>解剖ハサミ</td><td>F.S.T</td><td>14558-09</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコの改変イーグル ミディアム</td><td>ジェンクローン</td><td>25-500</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ジェミニ</td><td>100-106</td><td>熱不活性化</td></tr><tr><td>フィジー (フィジーはただのイメージです J)</td><td>NIH</td><td>バージョン 1.52i</td><td></td></tr><tr><td>ファインチップピンセット</td><td>F.S.T</td><td>11254-20</td><td>Style #5</td></tr><tr><td>Fluorescence light source</td><td>Excelitas</td><td>012-63000</td><td>X-Cite 120Q</td></tr><tr><td>GFAP antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>3670S</td><td>GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody</td></tr><tr><td>Glass Bottom Dishes</td><td>Mattek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>35 mm ディッシュ |No. 1.5 カバースリップ |ガラス径 14 mm |コーティングされていない</td></tr><tr><td>グレーフ鉗子</td><td>F.S.T</td><td>11054-10</td><td>湾曲した先端を持つグレーフアイリス鉗子</td></tr><tr><td>酸性コンパートメント(後期エンドソームおよびリソソーム)を染色する緑色蛍光染料</td> <td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>L7526</td><td>LysoTracker グリーン DND 26.DMSOSに1mMストック溶液にあらかじめ溶解しています。選択した増殖培地またはバッファーの最終使用濃度まで希釈します。</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (10x)</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td>マグネシウムおよびカルシウムフリー</td></tr><tr><td>イメージングメディア</td><td>Life Technologies</td><td>A14291DJ</td><td>ライブセルイメージングソリューション</td></tr><tr><td>倒立共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 780</td></tr><tr><td>KymoToolBox</td><td></td><td></td><td>https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</td></tr><tr><td>Lipofection Enhancer Reagent</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>11514015</td><td>プラス試薬</td></tr><tr><td>リポフェクション試薬</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 15338100</td><td>リポフェクタミン LTX 試薬</td></tr><tr><td>オービタル振とうインキュベーター</td><td>ニューブランズウィックサイエンティフィック</td><td>8261-30-1008</td><td>イノーバ 4230 、温度と速度を制御できるオービタル振とうインキュベーター</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレポマイシン溶液 (100x)</td><td>Gen Clone</td><td>25-512</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (10x)</td><td>Gen Clone</td><td>25-507x</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P7405</td> は<td>、pH 8.5 のトリス緩衝液に 1mg/mL で溶解します。長期保存のために凍結してください。凍結と解凍のサイクルを避ける</td></tr><tr><td>血清培地の減少</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>OPTI-MEM</td></tr><tr><td>組織培養フラスコ</td><td>オリンパス プラスチック</td><td>25-209</td><td>75 cm^2. 100% 角度付きネックアクセス、0.22um 疎水性ベントフィルターキャップ</td></tr><tr><td>組織培養インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>51030285</td><td>HERAcell VIOS 160i、温度、湿度、CO2制御</td></tr><tr><td>を備えた組織培養インキュベーターTris-Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>8.402 g を 1 リットルに溶解し、4.829 g の Tris HCl を水に溶かして 0.1 M Tris バッファーを作製し、pH 8.5</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td>4.829 g を 1 リットルに溶解し、8.402 g の Tris Base で 0.1 M Tris バッファー、pH 8.5</td></tr><tr><td>トリプシン EDTA (0.25%)、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum-Driven Filter Systems</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-227</td> <td>を作製500 ml、PESメンブレン、0.22 &micro;m</td></tr><tr><td>Vannasハサミストレート</td><td>ロボズ</td><td>RS-5620</td><td></td></tr></tbody></table>

アストロサイトにおけるオルガネラおよび他の貨物の細胞内輸送の可視化と解析

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

アストロサイトは、成人の脳の中で最も豊富な細胞型の一つです, 彼らは機能の多重性で重要な役割を果たしています.脳恒常性の中心的なプレーヤーとして、アストロサイトは重要な代謝産物と緩衝細胞外水、イオン、グルタミン酸をニューロンに供給します。「三分詞」シナプスの不可欠なコンポーネントは、アストロサイトもシナプスの形成、剪定、メンテナンス、および変調において重要です。これらの高度にインタラクティブな機能を可能にするために、アストロサイトは、細胞を含む多数の特殊な膜タンパク質を介して、他のグリア細胞、ニューロン、脳血管系、および細胞外環境と通信します。接着分子、アクアポリン、イオンチャネル、神経伝達物質トランスポーター、ギャップ接合分子。この動的フラックスをサポートするために、星状細胞は、ニューロンと同様に、緊密に調整され、効率的な細胞内輸送に依存しています。細胞内人身売買が広範囲に減少しているニューロンとは異なり、アストロサイトにおける微小管ベースの輸送はあまり研究されていない。それにもかかわらず、細胞膜タンパク質および細胞内オルガネラ輸送の外細胞および内嚢胞性人身売買は、アストロサイトの正常な生物学を調整し、これらのプロセスはしばしば病気または傷害に反応して影響を受ける。ここでは、高品質のマウスアストロサイトを培養し、目的の星状タンパク質および小器官を蛍光的に標識し、タイムラプス共焦点顕微鏡を用いて細胞内輸送ダイナミクスを記録するための簡単なプロトコルを提示する。また、利用可能な画像解析ソフトウェア(ImageJ/FIJI)プラグインを使用して、取得したムービーから関連するトランスポートパラメータを抽出および定量化する方法についても説明します。

上記で概説した一次マウスMDアストロサイトを確立するためのプロトコルは、再現性の高い高品質の培養物を生み出す必要があります。培養物は当初、アストロサイト、線維芽細胞、およびミクログリアおよびオリゴデンドロサイトを含む他のグリア細胞の混合物を含むが(図1Bi,Biv;赤い矢頭)、DIV5-DIV7間の混合培養物へのAraCの添加は最小化するこれらの汚染物質細胞の増殖。AraC処理と揺れベースの精製戦略を組み合わせることで、精製工程のみを含む従来のプロトコル(図1Bv;青)よりもアストロサイト培養の純度を豊かにします(図1Bv;青)。矢印)13.アラCまたは未処理で処理された精製星細胞培養物の期待形態および組成物(GFAPおよび4'、6-ジアミディーノ-2−フェニリンドール[DAPI]染色)を図1 <strong c...

ここでは、マウスアストロサイトにおけるオルガネラの細胞内輸送と血漿膜タンパク質の取引を可視化するインビトロライブイメージング法について述べる。このプロトコルはまた、貨物輸送の旅程と運動学を決定するための画像分析方法論を提示する。

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

当社のプロトコルは、細胞外の環境や軽度の疾患状態の下での天体細胞小器官またはタンパク質の運動性と局在性を調べるのに使用できます。タンパク質およびオルガネラ局在化の単一のスナップショットを提供するMHA固定製剤とは異なり、当社のライブイメージング技術は、個々の生きたアストロサイトにおける粒子ダイナミクスを分析するために使用することができます。トランスフェクションシードアストロサイトの前日は、トランスフェクション後24〜48時間でイメージングに適した密度で行う。リポフィクション試薬を適当な実験濃度に還元した血清培地で希釈する。250マイクロリットルの低血清培地で5マイクログラムの高純度DNAを希釈し、5マイクロリットルのリポフィケーションエンハンサー試薬をチューブに加えます。リポフィクション試薬を同量のDNAリポフィケーションエンハンサーミックスと混合し、室温で15分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、アストロサイト培養から上清を取り除き、細胞に滴下してトランスフェクションミックスの100マイクロリットルを加える。摂氏37度と5%の二酸化炭素で6時間後、トランスフェクション複合体を適切な量のアストロサイト培養培地に置き換え、細胞を細胞培養インキュベーターにさらに24〜72時間戻す。イメージングの30分前に、200マイクロリットルのアストロサイト培養培地で適切なリソソーム標識プローブを1マイクロモルの作業濃度に希釈し、37°Cで30分間プローブでアストロサイトに標識します。次いで、細胞を温熱アストロサイト培地で1回洗浄し、その洗浄をイメージング培地に置き換えます。プローブ標識の直後に、アストロサイト培養容器を顕微鏡ステージ上の適切なアダプターに入れ、EBI蛍光灯を用いて、蛍光タンパク質またはプローブを発現する細胞を見つける。デジタルカメラを使用して蛍光サンプルの照明を調整し、選択した細胞を視覚化し、焦点を調整して単一のセルにズームインします。次に、ズームと明確なフォーカス機能を使用して、300 ~ 500 秒の時間間隔で 2 秒ごとに 1 フレームの周波数で単一の Z スタック タイムラプス シリーズを取得します。タイムラプスイメージを AVI または TIFF スタックファイルとして保存してエクスポートします。タイムラプス画像を解析するには、ImageJ または Fiji でタイムラプス画像シーケンスを開き、スプリットチャンネルツールを使用してチャンネルを分割します。8 ビット緑のチャンネル画像では、セグメント線ツールを使用して、すべてのムービーに対して同じ方向規則を使用してパーティクルの軌跡に沿った線をトレースし、研究対象のすべてのセル内およびすべてのセル間で極性が一貫するようにします。ラインツールをダブルクリックして、線幅をトラックの太さに合わせて調整し、線幅10を使用してKymo ToolBoxプラグインの「Kymoを描く」マクロを実行します。時間と空間で画像のキャリブレーションを求めるプロンプトが表示されます。キャリブレーションが完了すると、カイモグラフが生成され、TIFFファイルとして保存できます。パーティクルの軌道を割り当てるには、[セグメント線]ツールを使用して、取得の全期間、カイモグラフ内の各パーティクルを手動で追跡し、ROI マネージャを使用して各パーティクル軌道を対象領域として記録します。さらに分析するために各タイムラプスビデオごとに関心のある領域のすべてを保存し、Kymoツールボックスプラグインの分析キモマクロを実行します。ウィンドウが開き、ドロップダウンメニューから目的のセルの核からパーティクルモーションの外側方向を定義します。制限速度は、対象となる貨物ごとにソフトウェアの感度に応じて定義する必要があり、ライン幅は各粒子軌道の厚さに合わせて調整する必要があります。[すべてのデータをログ記録] と [外挿されたデータのログ] 座標は、さまざまな貨物輸送パラメータの計算用にする必要があります。[はい] をクリックします。個々のトラックに対して計算されたデータは、キモグラフごとにプールされ、各画像に固有のテキストファイルに保存されます。シトシンアラビノシド処理と揺れベースの精製戦略を組み合わせることで、精製工程のみを含む従来のプロトコルに対するアストロサイト培養の純度が豊かになります。リポフェクションベースのトランスフェクションは、毒性を引き起こすことも、アストロサイトの生存可能性に影響を与えることなく、生細胞イメージングに最適なレベルでタンパク質の一過性発現を可能にします。同様に、蛍光プローブを使用することで、オルガネラダイナミクスやアストロサイトの追跡に対して、酸性の内皮小器官の迅速かつ効率的な標識が可能になります。画像から経過したデータを使用して、時間と空間で貨物の動きを追跡するカイモグラフを生成できます。これらのキモグラフでは、示された貨物の前向き運動は負の斜面を持つ軌道で表され、逆行運動は正の斜面を持つ軌道で表される。静止した小胞は垂直軌道として現れる。この分析では、アストロサイトの領域を通る特定の貨物のフラックスの定量化は、映画が取得されたアストロサイトの領域における通常の基線運動性を代表する可能性が高い貨物間のモーダル粒子の割合の差を明らかにした。キモグラフから得られた各粒子のフルタイムスケールに沿ったX、Y位置の正確なマッピングは、貨物速度や走行長さなどの他の運動パラメータを評価するためにも使用できます。このプロトコルは、高品質のアストロサイト培養と効率的な貨物ラベリングを必要とするため、トランスフェクション試薬のインキュベーション時間と取得タイムラインは、目的のプラスミドまたは貨物ごとに調整する必要があります。このプロトコルは、細胞の損傷、毒性、病原性突然変異、シナプス活性、または細胞内または細胞外環境における変化に応答して、アストロサイトにおける輸送事象を特徴付けるために変更することができる。

visualizing-analyzing-intracellular-transport-organelles-other-cargos

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は内部全反射し、落射蛍光顕微鏡を用いて培養アストロサイトにおける膜とグローバルな細胞内カルシウム動態の近くで測定する方法について説明します。...

アストロサイトの細胞膜とグローバル細胞内カルシウム動態の近くの測定

出典:Moye, S. L., et.al.Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (2019).

固定マウス脳スライスにおける蛍光色素イオントフォレーシスを用いたアストロサイト形態の可視化

出典: Creighton, BA, et al. アストロサイトにおける細胞小器官と他の貨物の細胞内輸送の視覚化と解析J. Vis. 経験。...

培養アストロサイトにおける貨物の細胞内輸送の可視化

ここでは、アストロサイトのGタンパク質共役受容体の可塑性の研究のためのニューロンにおいて恒常的な可塑性を誘導するために使用されるプロトコルの適合を記載している。最近、幼若マウスにおけるIのmGluRアストロサイトのグループ内の変化を調べるために使用される、この方法は、 インサイチューおよびインビボで 、成体マウスからの組織において、種々の星状細胞GPCRのスケーリングを測定し、星状細胞受容体の感受性のより良い理解を得るために適用することができる神経活動の変化に。...

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

線条体におけるアストロサイトの細胞内Ca2+シグナルの特性と機能は、まだ完全には調査されていません。血清型2/5のアデノ随伴ウイルス(AAV2/5)を使用して、線条体アストロサイトで遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターを発現する方法、および線条体アストロサイト内のCa2+シグナルをin...

イメージング細胞内Ca 2+シグナル

中枢神経系の星状細胞は、有害な刺激に反応して機能的および構造的特性を変化させます。このレポートは、疾患状態または治療介入後の三次元アストロサイトの形態を評価するためのプロトコルを示しています。...

アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析のためのプロトコル

サイズ、形状、および結合のアストロ サイトのネットワークの方向性を分析

記載されているパイプラインは、ギガバイトより大きい電子顕微鏡データセットのセグメンテーション用に設計され、細胞全体の形態を抽出します。セルを3Dで再構築すると、個々のニーズに合わせて設計されたカスタマイズされたソフトウェアを使用して、3Dで直接定性的および定量的な分析を実行し、また、仮想現実を使用してビューの閉塞を克服することができます。...

グリア細胞と神経細胞の3D再構成とバーチャルリアリティ解析の方法

アストロサイトは形態的に複雑な細胞であり、その複数のプロセスとふさふさした領域によって例示される。彼らの精巧な形態を分析するために、我々は軽く固定された組織で細胞内ルシファー黄色イオントフォレシスを行う信頼性の高いプロトコルを提示する。...

ルシファー黄イオン球形成を用いてアストロサイト形態を可視化

CLARITY法を用いたウイルスベクター形質導入と脳クリアリングを組み合わせることで、多数のニューロンとアストロサイトを同時に調べることができます。...

クリア脳におけるアストロサイトとニューロンの空間的相互作用の解明

このプロトコールは、マウス脳の自由浮遊組織切片の切片化、染色、および画像化のための方法を記載し、続いて、アストロサイト領域体積およびアストロサイト領域オーバーラップまたはタイリングの分析の詳細な説明を記載する。...

厚い自由浮遊組織切片におけるアストロサイトの領域体積とタイリングの解析

学ぶアストロサイトにおけるオルガネラと膜タンパク質の細胞内輸送をマウスアストロサイト培養細胞で可視化するライブイメージング法。この手法は神経変性疾患の研究や細胞応答の理解に活用できます。

アストロサイトにおけるオルガネラおよび他の貨物の細胞内輸送の可視化と解析

さらに動画を探す