X線特異的染色法とナノスコピックコンピュータ断層撮影法を用いた軟組織試料の3次元イメージング
October 24th, 2019
X線コンピュータ断層撮影用に設計されたX線特異的染色法を用いた顕微鏡組織構造の3D可視化のためのプロトコルを提示する。
私たちの新しいプロトコルは、実際にX線コンピュータ断層撮影を使用して3Dで細胞構造を視覚化することを可能にします。そして、私たちはエオシンで組織を染色することによってこれを行い、そのように細胞質を目に見えるようにします。医療や研究以外にも、動物学研究や発生生物学など生物学にも応用できると考えています。
この技術は比較的簡単で、非常に高速で、より大きな組織サンプルにも適しています。私たちは、X線マイクロコンピュータ断層撮影と組み合わせた私たちのアプローチは、臨床ワークフローに統合され、実際に病理学者がより良い意思決定を行うのを助けることができると考えています。まず、軟部組織サンプルを固定します。
50ミリリットルの遠心分離チューブに、4%ホルムアルデヒドの9.5ミリリットルと氷酢酸0.5ミリリットルを含む固定液を充填します。軟部組織サンプルを遠心管に加え、24~72時間冷蔵します。冷凍後、軟組織サンプルをDPBS溶液で1時間洗浄します。
その後、サンプルを2ミリリットルのエオシンY染色溶液に入れて染色し、水平揺れプレートに24時間インキュベートします。翌日、サンプル容器から柔らかい組織サンプルを慎重に取り出し、セルロースティッシュペーパーで余分な染色剤を取り除きます。エタノール蒸気相の上の円錐形の容器に入れ、貯蔵し、さらに使用してください。
原稿の指示に従って柔らかい組織のサンプルを取り付け、X線CT測定中にサンプルが動かないようにしっかりとフィットするように適切なサンプルホルダーを用意します。接着剤が硬化し、サンプルホルダーが使用する準備ができたら、マウス腎臓を無傷の遠心管に移し、下部に70%エタノールを数滴保持します。取り付けたサンプルをX線CTスキャナーに入れる。
サンプルを慎重に整列した後、最高の画質を得るための取得パラメータを選択します。提示されたマイクロCTデータの場合、360度にわたって均等に分布する1601の予測を使用して、50キロボルトのピーク電圧と3.5ワットの電流でスキャンを取得します。次に、概要スキャンのマイクロCTデータを使用して、高解像度CTスキャンの対象領域を選択します。
メスとステレオ顕微鏡を使用して、約0.5ミリメートルのエッジ長さの非常に小さな部分に切断することにより、軟部組織サンプルの関心の量を準備します。マウスの腎臓を使用する場合は、最も長い軸に沿って2つの半分にカットします。半分を取り、腎皮質や腎髄質などの異なる解剖学的領域を準備します。
脱水のために新しいペトリ皿に小片を転送します。原稿の方向に従って一連のエタノール溶液を用いてサンプルを脱水し、各脱水ステップを1時間行う。脱水したサンプルを微孔カプセルに移し、閉じます。
常に100%エタノールと接触してサンプルを保ちます。その後、重要な点は、小さな組織片を乾燥させます。組織サンプルが準備されたら、さらに使用する前にデシケータに保存された新しいペトリ皿に保管してください。
ティッシュピースを適切なサンプルホルダーに取り付け、しっかりとフィットします。マウス腎臓のスーパー接着のステレオ顕微鏡を使用してサンプルホルダーにピース。サンプルの慎重なアライメントの後、最適なイメージング品質のための取得パラメータを選択します。
提示されたナノCTデータでは、360度に均等に分布する1599の投影と約400ナノメートルのボクセルサイズを持つ60キロボルトのピーク電圧で予測を取得します。このプロトコルは、マウス腎臓の顕微鏡組織構造の3D視覚化に使用された。低分解能マイクロCT測定により、臓器全体の概要を確認でき、高解像度測定で目的の容積を特定することができました。
同じマウス腎臓を用い、高分解能マイクロCTデータを得る。皮質、外髄質、内髄質などの解剖学的構造のより詳細なビューが達成される。関心のあるレンダリングのボリュームは、容器を通して、髄領域と仮想断面を示しています。
ナノCTを用い、細胞レベルで腎臓サンプルの詳細図を得る。マウス腎臓全体から得られた小さな組織を使用して、約400ナノメートルのボクセルサイズでヘンレのループの太い上昇肢を画像化した。ナノCTが組織病理学と完全に適合していることを確認するために比較研究を行った。
マルチモーダルイメージングアプローチは、両方の方法で得られた結果を確認した。インキュベーションステップの間、サンプルが染色溶液で完全に囲まれていることが重要です。また、CT X線イメージングを行う場合、最も重要な事実は、データ取得中のサンプル安定性を確保することです。
当社のプロトコルで分析された軟部組織サンプルは、ヘマトキシリンの反染色などの標準的な組織学的手法を用いてさらに分析することができます。染色プロトコルは、3D X線の神学の発展に大きく貢献します。医学研究は、特にこの非破壊3Dイメージング技術の恩恵を受けるでしょう。
概要
この記事では、X線コンピュータ断層撮影とエオジン染色を用いた細胞構造の3D可視化のためのプロトコルを紹介します。この方法は様々な生物学分野に適用可能であり、臨床ワークフローの向上を目指しています。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物学
- 医療画像
背景
- X線コンピュータ断層撮影により組織構造の詳細な画像化が可能になります。
- エオジン染色により細胞成分の可視性が向上します。
- この技術は大きな組織サンプルに適しています。
- 動物学や発生生物学への応用可能性があります。
研究目的
- 組織構造の3D可視化のためのプロトコルを確立すること。
- この方法を臨床ワークフローに統合し、病理学の向上を目指すこと。
- X線イメージングと組織病理学の互換性を示すこと。
使用方法
- ホルムアルデヒドと酢酸で軟組織サンプルを固定します。
- 細胞の可視化のためにエオジンY溶液で染色します。
- 低解像度および高解像度のイメージングのためにマイクロCTスキャンを行います。
- 細胞レベルでの詳細なイメージングのための組織サンプルの準備を行います。
主な結果
- マウスの腎臓構造の3D可視化に成功しました。
- 高解像度スキャンの対象領域を特定しました。
- ナノCTと組織病理学的技術の互換性が確認されました。
- この方法により組織構造と病理学の理解が深まります。
結論
- このプロトコルは3D X線組織学を大幅に進歩させます。
- 医療研究に有益な非破壊的イメージング技術を提供します。
- 将来的には病理学における診断精度の向上が期待されます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-resolution 3D imaging of soft-tissue samples using X-ray-specific staining and nanoscopic computed tomography enables detailed morphological characterization critical for early discovery and translational research. This approach bridges the gap between traditional histology and advanced imaging, supporting more predictive and risk-adjusted decisions in biopharma R&D. The method's compatibility with standard histopathology ensures continuity across discovery and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables 3D visualization of cellular and subcellular structures for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by revealing tissue architecture in situ.
- Facilitates hypothesis testing through direct morphological assessment.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological samples for downstream quantitative imaging workflows.
- Improves assay reproducibility by standardizing sample preparation and imaging conditions.
- Enables identification and selection of regions of interest for high-resolution analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns 3D imaging outputs with histopathological standards for translational continuity.
- Provides nondestructive assessment of tissue morphology, supporting biomarker discovery.
- Facilitates risk-adjusted advancement by confirming structural endpoints in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates from early discovery through preclinical validation, enabling seamless transition between morphological assessment and functional studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven exploration of tissue structure and cellular organization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative 3D data for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Provides high-resolution volumetric datasets for statistical and morphological evaluation.
- Translational Research: Ensures compatibility with standard histology for biomarker and endpoint alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable imaging capability for diverse tissue types and research questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in tissue-based target validation.
- Operational Value: Streamlines sample preparation and imaging for high-throughput, reproducible workflows.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making by providing robust morphological evidence.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, staining, and advanced imaging instrumentation.
- Demands access to microCT and nanoCT platforms with precise sample alignment capabilities.
- Necessitates standardized protocols for cross-team reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various soft-tissue types with protocol optimization as needed.
- Sample stability and complete staining coverage are critical for data quality.
