X線特異的染色法とナノスコピックコンピュータ断層撮影法を用いた軟組織試料の3次元イメージング

私たちの新しいプロトコルは、実際にX線コンピュータ断層撮影を使用して3Dで細胞構造を視覚化することを可能にします。そして、私たちはエオシンで組織を染色することによってこれを行い、そのように細胞質を目に見えるようにします。医療や研究以外にも、動物学研究や発生生物学など生物学にも応用できると考えています。

この技術は比較的簡単で、非常に高速で、より大きな組織サンプルにも適しています。私たちは、X線マイクロコンピュータ断層撮影と組み合わせた私たちのアプローチは、臨床ワークフローに統合され、実際に病理学者がより良い意思決定を行うのを助けることができると考えています。まず、軟部組織サンプルを固定します。

50ミリリットルの遠心分離チューブに、4%ホルムアルデヒドの9.5ミリリットルと氷酢酸0.5ミリリットルを含む固定液を充填します。軟部組織サンプルを遠心管に加え、24~72時間冷蔵します。冷凍後、軟組織サンプルをDPBS溶液で1時間洗浄します。

その後、サンプルを2ミリリットルのエオシンY染色溶液に入れて染色し、水平揺れプレートに24時間インキュベートします。翌日、サンプル容器から柔らかい組織サンプルを慎重に取り出し、セルロースティッシュペーパーで余分な染色剤を取り除きます。エタノール蒸気相の上の円錐形の容器に入れ、貯蔵し、さらに使用してください。

原稿の指示に従って柔らかい組織のサンプルを取り付け、X線CT測定中にサンプルが動かないようにしっかりとフィットするように適切なサンプルホルダーを用意します。接着剤が硬化し、サンプルホルダーが使用する準備ができたら、マウス腎臓を無傷の遠心管に移し、下部に70%エタノールを数滴保持します。取り付けたサンプルをX線CTスキャナーに入れる。

サンプルを慎重に整列した後、最高の画質を得るための取得パラメータを選択します。提示されたマイクロCTデータの場合、360度にわたって均等に分布する1601の予測を使用して、50キロボルトのピーク電圧と3.5ワットの電流でスキャンを取得します。次に、概要スキャンのマイクロCTデータを使用して、高解像度CTスキャンの対象領域を選択します。

メスとステレオ顕微鏡を使用して、約0.5ミリメートルのエッジ長さの非常に小さな部分に切断することにより、軟部組織サンプルの関心の量を準備します。マウスの腎臓を使用する場合は、最も長い軸に沿って2つの半分にカットします。半分を取り、腎皮質や腎髄質などの異なる解剖学的領域を準備します。

脱水のために新しいペトリ皿に小片を転送します。原稿の方向に従って一連のエタノール溶液を用いてサンプルを脱水し、各脱水ステップを1時間行う。脱水したサンプルを微孔カプセルに移し、閉じます。

常に100%エタノールと接触してサンプルを保ちます。その後、重要な点は、小さな組織片を乾燥させます。組織サンプルが準備されたら、さらに使用する前にデシケータに保存された新しいペトリ皿に保管してください。

ティッシュピースを適切なサンプルホルダーに取り付け、しっかりとフィットします。マウス腎臓のスーパー接着のステレオ顕微鏡を使用してサンプルホルダーにピース。サンプルの慎重なアライメントの後、最適なイメージング品質のための取得パラメータを選択します。

提示されたナノCTデータでは、360度に均等に分布する1599の投影と約400ナノメートルのボクセルサイズを持つ60キロボルトのピーク電圧で予測を取得します。このプロトコルは、マウス腎臓の顕微鏡組織構造の3D視覚化に使用された。低分解能マイクロCT測定により、臓器全体の概要を確認でき、高解像度測定で目的の容積を特定することができました。

同じマウス腎臓を用い、高分解能マイクロCTデータを得る。皮質、外髄質、内髄質などの解剖学的構造のより詳細なビューが達成される。関心のあるレンダリングのボリュームは、容器を通して、髄領域と仮想断面を示しています。

ナノCTを用い、細胞レベルで腎臓サンプルの詳細図を得る。マウス腎臓全体から得られた小さな組織を使用して、約400ナノメートルのボクセルサイズでヘンレのループの太い上昇肢を画像化した。ナノCTが組織病理学と完全に適合していることを確認するために比較研究を行った。

マルチモーダルイメージングアプローチは、両方の方法で得られた結果を確認した。インキュベーションステップの間、サンプルが染色溶液で完全に囲まれていることが重要です。また、CT X線イメージングを行う場合、最も重要な事実は、データ取得中のサンプル安定性を確保することです。

当社のプロトコルで分析された軟部組織サンプルは、ヘマトキシリンの反染色などの標準的な組織学的手法を用いてさらに分析することができます。染色プロトコルは、3D X線の神学の発展に大きく貢献します。医学研究は、特にこの非破壊3Dイメージング技術の恩恵を受けるでしょう。