標準的な実験装置を用いてマウス精巣からパチテン精子細胞と精子を濃縮
2019年9月17日
ここでは、標準的な実験装置を用いて不連続な牛血清アルブミン密度勾配を用いて、成人マウス精巣からパチテン精子細胞、円形精子細胞、および細長い精子を濃縮するためのプロトコルを提示する。
MDRと呼ぶシンプルで安価な方法により、パキテイン精子細胞の濃縮集団、円形精子、マウス精巣から精子を細長く分離することができます。MDR法の主な利点は、そのシンプルさです。ほとんどの生物医学研究所で利用可能な標準の実験装置のみが必要です。
MDRプロトコルは、男性生殖細胞の機能研究を行う研究者に最適です。例えば、精子形成を研究しているグループ、男性の生殖能力に影響を与える要因、ならびに父方のエピジェネティック遺伝。MDR法には最小限の出発材料が必要です。
実際、私たちは日常的に1つの成人男性マウスを使用してかなりの量の細胞を得ています。まず、必要な装置と試薬をセットアップします。水浴を摂氏37度に設定し、細胞培養インキュベーターを摂氏34度、炭酸ガス5%、湿度95%に設定します。
チューブローテーターをインキュベーターの内側に置きます。顕微鏡用ガラススライドの適切な量を準備し、ラベルを付け、次にグリースペンで直径約1センチメートルのリングを描き、グリースを乾燥させます。動物を解剖する準備ができたら、マウスの腹側腹部に70%エタノールをスプレーし、はさみを使用して腹骨盤腔にV字形を開きます。
鉗子で上官ジディマル脂肪パッドを引っ張り、精巣を見つけてハサミで取り除き、チュニカアルブギネアを邪魔しないようにします。1X KREBSを含む6センチメートルのペトリ皿に精巣を置きます。精巣をカプセル化し、チュニカアルブギネアを捨て、鉗子で軽くからかうことによって半尿細管をわずかに分散させる。
作りたてのコラゲターゼ溶液を2ミリリットル含む50ミリリットルの円錐形チューブに移します。37°Cの水浴で3分間尿細管をインキュベートし、揺らすことで穏やかに攪拌します。その後、暖かい1X KREBSの少なくとも40ミリリットルを追加し、室温で堆積物に尿細管を許可します。
上清を取り除き、もう一度洗い流しを繰り返します。25ミリリットルの作りたてのトリプシン溶液を加えます。細胞培養インキュベーター内の回転子にチューブを置き、15〜20分間放置し、約15rpmで回転させた。
散発的に尿細管をチェックします。溶液が曇りになり、小さな細管だけが残ったら、チューブを氷の上に置き、次のステップに進みます。40マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して、氷の上の新しい50ミリリットルの円錐管に溶液をろ過します。
その後、600 x g で摂氏4度で5分間遠心分離し、細胞をペレットします。上清を慎重に注ぎ、細胞ペレットをタップして、1X KREBSの残りの部分の細胞を再懸濁させます。再懸濁細胞に少なくとも40ミリリットルの冷たい1X KREBSを加え、遠心分離を繰り返す。
チューブをタップしてセルを再サスペンドします。その後、ピペットチップを1ミリリットルのピペットに取り付け、開口部の直径が約3ミリメートルになるようにカットします。KREBSで0.5%BSAの3ミリリットルまで追加します。
上下にピペットを作って細胞を再中断し、泡を避けるようにします。40マイクロメートルのストレーナーを通して細胞懸濁液をフィルターし、BSAの勾配の細胞をロードするためにすぐに進みます。グラデーションにセルをロードする前に、均質な単一セル懸濁液を取得する必要があります。
塊状細胞は、より速く沈み込み、勾配を破壊し、分画を汚染します。50ミリリットルのチューブを氷の上に垂直に設置し、チューブの片側を見ることを確認します。その後、10ミリリットル血清ピペットの先端から約5〜10ミリメートルを切断し、ピペットコントローラに取り付けます。
5%BSA溶液のピペット5ミリリットルを50ミリリットルチューブの底に入れた。ピペットのカットチップで5%溶液の表面を軽く触り、5%溶液の上に4%BSA溶液の5ミリリットルをゆっくりと重ねます。他の BSA ソリューションでこの手順を繰り返して、5% から 1%BSA の勾配を得ます。
レイヤー間にクリアラインが表示されます。その後、慎重にそれを邪魔することなく、勾配の上に単一のセルサスペンションをロードします。細胞は1時間半勾配を通って沈めます。
カットピペットチップを使用して、慎重に1ミリリットルの分率を別々の1.5ミリリットルチューブに収集し、氷の上に保存し、収集された順序でチューブに番号を付けます。胚芽細胞分率を摂氏4度で10分間600×gで遠心分離する。次にペレットを乱さないよう気を付け、上清の大部分を捨て、チューブをフリックして細胞を再懸濁します。
各チューブに氷冷1X KREBSバッファーを1ミリリットル加え、遠心分離を繰り返します。上清の大部分を捨て、約100マイクロリットルを残し、細胞ペレットを慎重に再懸濁する。細胞分画を分析するには、番号付き顕微鏡スライド上の各グリースペンリング内に4%パラホルムアルデヒドの20マイクロリットルをピペット処理します。
対応する分数から再懸濁細胞の2マイクロリットルを直ちに加える。その後、最低1時間は室温でスライドを乾燥させます。PBS でスライドを 1 回リンスし、DAPI 付きの取り付け媒体を使用してスライドを取り付けます。
蛍光顕微鏡下で各スライドを分析し、各分画でどの特定の生殖細胞タイプが濃縮されているかを推定します。各分画のサンプルを顕微鏡のために採取したら、各画分に氷冷1X KREBSを1ミリリットル加え、セルを摂氏4度で10分間600~13000xgで遠心分離します。上清を削除して破棄し、推奨されるダウンストリーム解析を続行します。
このプロトコルは、ラウンド精子を豊かにするために特にうまく機能します。90%を超える濃縮は、分数2、3および4で達成された。長い精子は勾配の上にとどまる傾向があり、最初の分数で収集された。
その大きなサイズのために、パキテネ精子細胞の堆積物はより速く、最後に採取された。濃縮は、分数14と15で約75%であった。大部分の分画から得られたRNAの合計は0.5~2.5マイクログラムで、下流RNA分析には十分でした。
各画分から得られたタンパク質の量は、典型的には20〜140マイクログラムの範囲であり、これはいくつかのウェスタンブロットに十分である。このプロトコルでは、単一の画分に由来するタンパク質ライセートの10%は、標準的なウェスタンブロット上のDDX4、PIWIL1およびPIWIL2タンパク質を明確に検出するのに十分であった。1画分のタンパク質量は、PIWIL1に対する抗体を用いた免疫沈降、および共免疫沈降PIWIL2の検出にも十分であった。
初めてのタイマーでも、このプロトコルは、細胞の前処理が良好であり、堆積中に勾配を乱すものは何もないようにする限り、非常にうまく機能します。単一のマウスから、高度に濃縮された細胞を得て、RT-PCR、RNAシーケンシング、免疫沈降法、ウェスタンブロッティングなどのさまざまな下流分析に使用できます。MDRは男性の生殖細胞を豊かにする唯一の方法ではありませんが、特殊な機器や広範なトレーニングを必要としないため、非常に便利なツールです。
概要
このプロトコルは、成体のマウスの精巣からパキテン期の精細胞、円形の精細胞、および伸長中の精細胞を濃縮するための方法を説明しています。この方法は単純で、標準的な実験室機器を使用します。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 生殖生物学
- 細胞生物学
背景
- MDR法は、特定の雄性生殖細胞集団の分離を可能にします。
- 精子形成と雄の受精能力に関する研究に有益です。
- 必要な開始材料が最小限で、様々な研究環境でアクセスしやすくなっています。
- このプロトコルには標準的な実験室機器で十分です。
研究の目的
- マウスの精巣から特定の雄性生殖細胞集団を濃縮すること。
- 精子形成と受精能力に関する機能的研究を促進すること。
- 生殖生物学者のための簡単な方法を提供すること。
使用される方法
- 成体の雄マウスから精巣の解剖。
- 組織解離のためのコラーゲナーゼとトリプシンの使用。
- ウシ血清アルブミン密度勾配の調製。
- 遠心分離とろ過による生殖細胞画分の分離。
主な結果
- 特定の画分で90%以上円形の精細胞を濃縮すること。
- 最初の画分で伸長中の精細胞を収集すること。
- パキテン期の精細胞は約75%の濃縮で最後に収集されました。
- このプロトコルは、濃縮された細胞タイプのその後の分析を可能にします。
結論
- MDR法は雄性生殖細胞の濃縮に効果的です。
- 精子形成を研究するための信頼できるアプローチを提供します。
- このプロトコルは様々な下流の応用に適応できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient enrichment of specific male germ cell populations is critical for dissecting spermatogenesis mechanisms and evaluating fertility-related targets in early discovery. The MDR protocol enables reliable isolation of pachytene spermatocytes and spermatids using only standard laboratory equipment, reducing barriers to entry and supporting scalable, reproducible workflows. This capability enhances predictive confidence in functional studies and supports translational continuity across reproductive biology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of germ cell development and differentiation pathways.
- Supports mechanistic de-risking by providing purified cell populations for molecular analysis.
- Facilitates target validation in studies of male fertility and epigenetic inheritance.
- Improves predictive confidence for downstream reproductive biology research.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, enriched germ cell populations for quantitative molecular assays.
- Standardizes input material for reproducible Western blot, RT-PCR, and RNA-seq workflows.
- Enables reliable comparison of compound or genetic perturbation effects on defined cell types.
- Supports scalable assay development without specialized equipment or extensive training.
Translational & Preclinical Research
- Aligns enriched cell populations with disease-relevant models for fertility and epigenetic studies.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of reproductive targets.
- Reduces biological ambiguity in translational biomarker and mechanistic studies.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the early discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven studies of germ cell biology and facilitating downstream molecular analyses.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification in spermatogenesis research.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cell fractions for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides sufficient RNA and protein yields for robust statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Bridges basic germ cell biology with preclinical fertility and epigenetic studies.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly accessible, reusable enrichment protocol for diverse research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in germ cell studies.
- Operational Value: Standardizes enrichment with minimal training and equipment requirements.
- Strategic Value: Enables efficient go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of reproductive and epigenetic research programs.
Implementation Considerations
- Requires basic cell biology expertise and familiarity with density gradient techniques.
- Needs only standard laboratory equipment, such as centrifuges and incubators.
- Demands careful handling to maintain gradient integrity and avoid cross-contamination.
- Adaptable to different mouse models and experimental designs with minimal optimization.
- Limited to applications where high-purity germ cell populations are sufficient for downstream analysis.
