Name: 高分解能共焦点顕微鏡による3D腫瘍スフェロイド侵入に対する移動性阻害剤の効果の特徴 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学ぶ 3D腫瘍スフェロイドを用いた移動性阻害剤の効果評価法。高分解能共焦点顕微鏡で神経膠腫細胞の浸潤を可視化し、がん薬物治療研究に応用する。

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KNS42細胞株に貢献してくださったクリス・ジョーンズ教授に感謝します。この作品で使用されるAiryScanとのツァイスLSM880共焦点顕微鏡は、リーズ市地域エンタープライズパートナーシップ(LEP)成長契約を通じて資金提供されたハダースフィールドイノベーションとインキュベーションプロジェクト(HIIP)の一部です。顕微鏡画像のクレジット図3:カールツァイス顕微鏡GmbH、microscopy@zeiss.com。

1. 細胞スフェロイドの生成
1日目
<ol><li>調査中の細胞株で必要に応じて標準培養培地を調用意する。</li>
	<li>無菌処理技術を用いて組織培養フード内のすべての組織培養関連ステップを行う。</li>
	<li>がん細胞をトリプシン化し、カウントします。プレートあたり20mLのセルサスペンションを使用します。細胞懸濁液は、明確にラベル付きの滅菌ユニバーサルチューブに保管してください。</li>
	<li>各ウェルに所定の数のセルを追加します。必要な細胞の初期数と最終的なスフェロイドサイズの両方が、調査対象の細胞株の増殖速度に依存する。 注:U251およびKNS429、10、5x 103細胞/mLのような確立された神経膠腫細胞株のために、インキュベーションの4日後に顕微鏡的に見える球体(200または800 μm)を作り出す。</li>
	<li>細胞の束を避けるために穏やかな反転によって普遍的な管の細胞を再中断する。細胞懸濁液のピペット200μLを96ウェルプレートの各ウェルに入れた。すべての井戸が必要ない場合は、蒸発を避けるために、各空の井戸に1x PBSの200 μLを追加することをお勧めします。</li>
	<li>細胞を通常どおり37°Cでインキュベーターでインキュベートします。 注:グリオーマ癌細胞株などの細胞株は、24時間以内にスフェロイドを形成し、72時間のスフェロイドをインキュベートすることによって3D細胞構造を形成することを可能にする。</li>
</ol>2日目
<ol start="7"><li>24時間後の明視野顕微鏡で細胞をチェックする 細胞株によっては、細胞が井戸の底部に検出可能なスフェロイドを形成している可能性がある。 注:確立されたグリオーマ癌細胞株は24時間以内にスフェロイドを容易に形成し、患者由来のグリオーマ癌細胞株は最大1〜2週間かかることがある。</li>
</ol>2. コラーゲン侵入アッセイ
3日目
<ol><li>コラーゲン、5倍培養培地、1M NaOH、および氷の上に20mLチューブを1本置きます。</li>
	<li>冷たい培養管に冷たいコラーゲンの10.4 mLを慎重かつゆっくりと追加します。気泡を避けてください。このコラーゲンの量は、1つの96ウェルプレートのために十分です。アップスケーリングは可能ですが、プレートごとに20mLチューブを1本ずつ用意することをお勧めします。</li>
	<li>冷菌5x培養培地の1.52mLをゆっくりと加えます。気泡を避けてください。</li>
	<li>使用直前に、冷間無菌1M NaOHの72μLを静かに加えます。氷の上に溶液を保管してください。</li>
	<li>ピペッティングで優しく混ぜます。気泡を避けてください。効率的な混合は、媒体の色の変化(赤からオレンジレッド(pH 7.4))につながります。使用するまで氷の上に混合物を残します。</li>
	<li>重要なステップ:1日目に調製された96ウェルプレートから190μLの上清を取り除きます。井戸の底に形成されたスフェロイドを邪魔しないように非常に注意してください。ピペットは、井戸の中心ではなく、側面に向かって角度で使用します。</li>
	<li>各ウェルにコラーゲンミックスの100 μLをゆっくりと加えます。任意のスフェロイドの乱れを防ぐために、井戸の側面にミックスをピペット。気泡を避けてください。重合を評価するために室温で20 mLチューブに残っているコラーゲンミックスを保ちます。</li>
	<li>インキュベーター内のプレートを少なくとも10分間インキュベートし、コラーゲンが重合することを可能にする。ガイドラインとして、残りのコラーゲンが設定されている場合、半固体およびスポンジ状になり、スフェロイドは阻害剤で処理する準備ができている。</li>
	<li>培養剤に2倍濃度で薬剤または阻害剤を添加する。各ウェルに適当にミディアムを加えます(ウェルあたり100μL)。繰り返しますが、スフェロイドの乱れを避けるために、ウェルの側面に媒体をピペットします。</li>
	<li>T = 0 h、24 h、48 h、および 72 h の時間に明視野顕微鏡検査によって各スフェロイドを観察し、画像化し、薬物活性を評価します。その後、プレートをインキュベーターに戻します。 注:細胞株の侵襲的挙動に応じて、元の球状コアからの離れた移動が24時間以降に観察されてもよい。</li>
</ol>3. 共焦点顕微鏡のためのコラーゲン埋め込みスフェロイドと渡り細胞の調製
<ol><li>プレートを組織培養フードに入れ、上清(200μL)を静かに取り除きます。繰り返しますが、これはコラーゲンプラグを妨げる可能性があるため、スフェロイドを邪魔しないように注意し、コラーゲンに触れないようにしてください。</li>
	<li>上清を1x PBSの100 μLに置き換えます。この洗浄工程を3回繰り返します。</li>
	<li>最終洗浄を取り除き、1x PBS(ウェルあたり100μL)で4%ホルムアルデヒドに置き換えます。 注意:ホルムアルデヒドは発がんの可能性があります。健康と安全に関するガイドラインに従って、注意して取り扱ってください。</li>
	<li>96ウェルプレートをラボベンチに置き、ホイルで覆い、室温で24時間放置します。</li>
	<li>慎重にホルムアルデヒドを取り除き、1x PBSに置き換えます。この1x PBS洗浄3xを繰り返します。</li>
	<li>1x PBSで0.1%トリトンX-100を準備します。1x PBS洗浄を取り外し、トリトンX-100溶液の100 μLに置き換えます。室温で30分間インキュベートします。その間、1x PBSと0.05%の脱脂粉乳でブロッキング溶液を準備し、完全に混ぜます。</li>
	<li>トリトンX-100を取り外し、1x PBSで3倍を洗います。各ウェルに100μLのブロッキング溶液を加え、15分間インキュベートします。</li>
	<li>所定の濃度でブロッキングバッファーに必要な一次抗体を希釈する。ここで、抗マウスIgGアセチル化チューブリン抗体(1:100)を用いる。</li>
	<li>15,682 x gで5分間の一次抗体遮断バッファーミックスを遠心分離する。ブロッキング溶液を慎重に取り外し、各ウェルに上清(25−50 μL)を加えます。室温で1時間暗くインキュベートする。</li>
	<li>抗体溶液を取り出し、1x PBS(ウェル当たり100μL)で3xを洗浄します。</li>
	<li>任意の追加の蛍光汚れに加えて、推奨または所定の濃度でブロッキングバッファー内の二次抗体を希釈する。ここでは、1:500抗マウスフルオロフォア-488共役抗体、ファロイジン-594(1:500)をアクチン染色、およびDNA染色(DAPI)に用いる。</li>
	<li>繰り返しになりますが、13,000rpmで5分間二次抗体溶液を遠心分離します。</li>
	<li>各ウェルからブロッキング溶液を取り出し、二次抗体/ファロイジン/DAPIミックスの25~50μLを添加します。室温で1.5時間暗闇の中でインキュベートします。</li>
	<li>二次抗体染料溶液を取り出し、1x PBS(ウェル当たり100μL)で3倍を洗浄します。</li>
	<li>プラスチックピペット(200μL)を使用して、高品質のプレーンガラススライドの中心に吸引して個々のコラーゲンプラグを慎重に持ち上げます。</li>
	<li>コラーゲンプラグに適切なマウントを1滴加え、プラグが完全に覆われていることを確認します。気泡を避けてください。</li>
	<li>イメージングに使用され、一晩設定できるようにする顕微鏡目的のための最適な厚さのカバースリップを適用します。暗い所温でスライドを保管してください。</li>
</ol>4. 蛍光顕微鏡
<ol><li>適切な共焦点顕微鏡を使用して蛍光画像をキャプチャします。</li>
</ol>

<ol><li>Gandalovičová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrastatics-anti-metastatic+and+anti-invasion+drugs%3A+promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges.</a> Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).</li>
<li>Delgado-López, P. D., Corrales-García, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+in+glioblastoma%3A+a+review+on+the+impact+of+treatment+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities.</a> Clinical and Translational Oncology. 18, 1062(2016).</li>
<li>Foreman, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+virotherapy+for+the+treatment+of+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma.</a> Neurotherapeutics. 14, 333(2017).</li>
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<li>Sirenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), Mary Ann Liebert, Inc. (2015).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bionic+3D+spheroids+biosensor+chips+for+high-throughput+and+dynamic+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening.</a> Biomedical Microdevices. 20, 82(2018).</li>
<li>Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microwell-mesh%3A+a+high-throughput+3D+prostate+cancer+spheroid+and+drug-testing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform.</a> Scientific Reports. 8, 253(2018).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+way+you+slice+it-a+comparison+of+confocal+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li>
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<li>Takeshita, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+an+established+human+glioma+cell+line%2C+KNS-42%5BTitle%5D)+AND+%22Neurologica+Medico+Chirurgica%22%5BJournal%5D)">Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42.</a> Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).</li>
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<li>Jackman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+infiltration+in+paediatric+glioma+using+histone+deacetylase+inhibitors%2C+a+promising+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach.</a> Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).</li>
<li>Bhandal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+glioma+migration+with+the+histone+deacetylase+inhibitor+MI192%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192.</a> Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).</li>
<li>Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+preparation+from+hanging+drops%3A+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).</li>
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<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three+dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29(2012).</li>
<li>Härmä, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+dynamic+morphological+drug+responses+in+3D+organotypic+cell+cultures+by+automated+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis.</a> PLOS ONE. 9 (5), e96426(2014).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しない。

高解像度共焦点顕微鏡を用いて移動性薬物活性を同定するための癌細胞スフェロイドを作成する新しい方法が記載されている。ぶら下げ滴15などの他の技術に対する低付着板の使用は、コラーゲン移行および侵入アッセイで使用するための再現性と均一なスフェロイドを生成する手段を容易にした。このプロトコルの重要なポイントは、コラーゲンマトリックスに埋め込まれる細胞スフェロイドの前の96ウェルプレートからの成長培地の除去と、その後のスフェロイドを含むコラーゲンプラグの慎重な取り扱いである。デジタルマイクロ流体16などの新しい技術が利用可能になり、より高価であるが、メディアおよび流体の手動除去に代わる手段を提供する可能性がある。記載されたプロトコルの主な制限は、単一のスフェロイドを画像化し、阻害剤の薬物活性を評価するために明るい視野顕微鏡で手動で分析する場合に時間がかかることです。また、工程のすべての工程に必要な試薬は高価であり、高分解能共焦点顕微鏡という特殊な装置も必要です。播種に必要な最適な細胞数および必要なサイズの細胞スフェロイドを得るのに要する時間も、コラーゲ...

前臨床創薬と潜在的な癌薬の開発のための3次元スフェロイド技術は、従来の薬剤スクリーンよりもますます支持されています。したがって、移動性、すなわち移動と侵入防止—薬物の開発が増えている。がん治療におけるこれらの発展の背後にある根拠は明らかである:3Dスフェロイドアッセイは、細胞単層培養よりも忠実に3D腫瘍アーキテクチャを模倣する潜在的な抗癌剤をスクリーニングするためのより現実的なアプローチを表し、薬物と腫瘍の相互作用(動態)をより正確に要約し、腫瘍関連の設定における薬物活性の特徴付けを可能にする。さらに、がん細胞が遠方の腫瘍部位に移行する能力によって増強された転移による多くの癌タイプにおける化学毒性薬に対する耐性の上昇と癌患者の死亡率の高さは、化学療法剤の包含を支持する。将来の臨床癌試験におけるアジュバント治療としての癌細胞の渡り目の可能性を標的とする 1.これは特に、高品位神経膠芽腫(GBM)のような高侵襲性癌の場合に当てはまる。GBM管理には、手術、放射線療法、化学療法が含まれます。しかし、併用治療を行っても、ほとんどの患者は11〜15ヶ月2、3の中央値生存期間を有する初期診断の1年以内に再発する。3D技術の分野における大きな進歩は、ここ数年で行われてきました:腐敗システム、微細加工構造、3D足場、およびその他の個々のアッセイは、大規模な4で定期的なテストを可能にするために継続的に改善されています。 5,6,7.しかし、これらのアッセイから得られた結果は、2D画像解析システムを用いて3D生成データを解析する試みによってデータ解釈が妨げられることが多いため、有意義な方法で分析する必要があります。
画像取得速度と光毒性の低減の面で好ましいにもかかわらず、ほとんどの広視野システムは解像度8によって制限されたままです。したがって、薬物有効性に関するデータ読み出しとは別に、広視野システムを用いて画像化すれば、移動細胞の3D細胞構造に対する薬物作用の詳細な影響は必然的に失われる。逆に、共焦点レーザースキャニング顕微鏡(CLSM)は、コンピュータソフトウェアを使用して3D取得後に再構築およびレンダリングすることができる高品質の光学的に切り分けた画像をキャプチャします。したがって、CLSMは複雑な3D細胞構造のイメージングに容易に適用可能であり、それによって3D構造に対する抗移動性阻害剤の影響の調査および細胞移動機構の詳細な分析を可能にする。これは間違いなく将来の移住薬開発を導くでしょう。ここで、スフェロイド生成、薬物処理、染色プロトコル、および高解像度共焦点顕微鏡による特性評価の組み合わせワークフローについて説明する。

<table><tbody><tr><td>コラーゲンI、ラットテール、</td>神経膠腫浸潤アッセイ用の<td>100 mg Corning</td><td>354236</td><td>;これは多くの販売代理店/製造業者によって提供されており、意図するアッセイのタイプと使用する細胞株の両方について決定する必要があります。神経膠腫がん細胞株の場合、コラーゲンラットテール1型(例:コーニング)が好ましい選択です。コラーゲンは4°Cで保存する必要があります。C、暗闇の中で、必要になるまで。異なるバッチのコラーゲンを混合することは、重合したコラーゲンの一貫性に影響を与える可能性があるため、お勧めできません。&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>顕微鏡イメージング用の</td><td>さまざまな</td><td></td><td>カバースリップ</td></tr><tr><td>DMEM粉末</td><td>シグマ</td><td>D5648</td>は<td>、神経膠腫浸潤アッセイ用のコラーゲン溶液に5倍の濃度で必要です。&nbsp;これは、粉末状で購入し、二重蒸留水で構成し、成長培地の最終組成に応じて、必要な添加剤で完成させることができます。完全な5倍溶液は、シリンジフィルターシステム(0.22 &mu;m)使用前に。</td></tr><tr><td>神経膠腫細胞株の細胞培養に必要な</td><td>ウシの胎児血清</td><td>Sigma</td><td>F7524-500ML</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td></td><td>イメージングに</td><td>各種</td>スライド</tr>ガラス <tr><td>高グルコースDMEM</td><td>神経膠腫細胞株の細胞培養に必要な</td><td>Gibco</td><td>41965062</td></tr><tr><td>阻害剤</td><td>トクリス</td><td>各種</td><td>さまざまな - 実験計画による。阻害剤は、SelleckchemやTocrisなどのメーカーから購入できます。これらのメーカーは、阻害剤の特性に関する詳細な説明、関連する参考文献へのリンク、および使用濃度の提案を提供しています。すべての阻害剤と同様に、それらは潜在的に有毒である可能性があり、健康と安全のガイドラインに従って取り扱われるべきです。阻害剤は、メーカーが推奨するストック溶液として調製されます。一例として、ミグラスタット阻害剤MI-192を使用して、そのような阻害剤の使用を実証しました。この方法で、さまざまな遊走抑制剤を試験し、同等の結果が得られました。</td></tr><tr><td></td><td></td><td>顕微鏡イメージング用</td><td>各種封入剤</td></tr><tr><td>NaOH (1 M)</td><td>各種&nbsp;</td><td>さまざまな</td><td>NaOHは、必要なモル濃度で購入するか、固体の形で調製することができます。調製した溶液は、シリンジフィルターシステムを使用してフィルター滅菌する必要があります。One M NaOHは腐食性であるため、溶液調製中に注意する必要があります。</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド&nbsp;</td><td></td><td>スフェロイドや細胞を固定するための様々な種類、4%で構成し、健康被害に注意し、健康と安全の規制が侵襲アッセイのコラーゲン溶液に遵守されていることを確認します</td><td></td></tr>パス<tr><td>テット(目盛り付きピペット、3mL)</td><td>浸</td><td></td><td>潤アッセイ、溶液除去</td></tr><tr><td>PBS、組織培養用滅菌</td>シ<td>グマ</td><td>D1408-500ML&nbsp;&nbsp;</td><td>神経膠腫細胞株の細胞培養および染色用洗浄液に必要</td></tr><tr><td>神経膠腫細胞株の細胞培養に必要な</td><td>Sigma</td><td></td> <td>P4333</td></tr><tr><td>一次抗体、二次抗体、DAPI、ファロイジン</td><td>など</td><td></td>様々な<td>メーカーが多く、二次標識抗体にはAlexa Fluor(Molecular Probes)を推奨しています。ここでは一次抗体にマウス抗アセチル化チューブリン抗体 (1/100, Abcam) を用いました。二次抗体には、1/500 抗マウス Alexa Fluor 488 標識抗体 Molecular Probes を使用しました。核染色には、DAPI(多くのメーカー)とアクチン染色のファロイジン(多くのメーカー)を使用し、どちらも推奨希釈率1/500で使用しました。</td></tr><tr>5<td>倍の濃度で神経膠腫浸潤アッセイのためのコラーゲン溶液に必要な</td><td>重炭酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S5761</td> 5倍の濃度</tr>で神経<tr><td></td><td>膠腫浸潤アッセイのためのコラーゲン溶液に必要な</td><td>シグマ</td><td>P5280</td></tr><tr><td>トリプシン化のための</td><td>トリプシン</td><td>シグマ</td><td>T4049</td></tr><tr><td>超低アタッチメントプレート</td><td>シグマ/Nunc</td><td>CLS7007-24EA</td><td>神経膠腫浸潤アッセイ用;低接着性プレートが必要であり、調査中の化合物の大規模なスクリーニングを可能にするために96ウェルプレートが好まれます。市販されているいくつかの低接着プレートがあります。最適なスフェロイド生成のために、さまざまなプレートをテストすることをお勧めします。私たちの経験では、蓋付きの丸底のCostar Ultra Low Clusterは、100%のスフェロイド形成と再現性の点で、神経膠腫癌細胞からのスフェロイドの生成に最適です。これらのプレートは、当研究室では、患者由来の材料、膀胱がん、卵巣がん細胞からの神経膠腫スフェロイドの作製にも成功裏に使用されました。さらに、ステムまたは前駆ニューロスフェアをこれらのプレートで使用して、標準化されたニューロスフェロイド</td></tr><tr><td>ストライペット(血清学的ピペット、滅菌、5mLおよび10mL)</td><td>さまざまなもの、例えばCostar</td><td>CLS4488-50;組織</td><td>培養およびコラーゲン調製のための</td>CLS4487-50</tr><tr><td>さまざまなマルチチャネル(50 - 250 &mu;L)およびシングルチャンネルピペット(10 &mu;L、50 &mu;L、200 &mu;L 1 mL)</td><td>各種</td><td></td><td>細胞・スフェロイドハンドリング用</td></tr><tr><td>各種 広視野顕微鏡</td><td>各種&nbsp;</td><td>ここでは</td><td>、広視野蛍光画像はEVOS FL細胞イメージングシステム(Thermo Fisher Scientific)を使用してキャプチャされました。</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880 CLSMは、Plan Apochromat 63x 1.4 NAオイル対物レンズを装備しています</td><td>メーカーからのZeiss</td><td>の引用</td><td>共焦点画像は、Plan Apochromat 63x 1.4 NAオイル対物レンズを装備したZeiss LSM 880 CLSMを使用してキャプチャされました。Diode 405nm、458/488/514 nmのアルゴンマルチライン、およびHeNe 594nmレーザーを使用して、それぞれPhalloidin 594、Alexa Fluor 488、およびDAPIを励起しました。各画像について、1つの代表的な光学セクションがキャプチャされ、画像キャプチャ前とキャプチャ後の両方のすべての設定が比較目的で維持されました。その後、すべての画像は、関連するZenイメージングソフトウェアとAdobe Photoshopを使用して処理されました。</td></tr></tbody></table>

高分解能共焦点顕微鏡による3d腫瘍スフェロイド侵入に対する移動性阻害剤の効果の特徴

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

がん研究における創薬と開発は、3D形式の薬剤スクリーンに基づいてますます進んでいます。がん細胞の移動性および侵襲性を標的とする新規阻害剤、ひるま症などの高侵襲性癌における補完的な治療法として発見され、考えられている。したがって、薬剤の添加後の3D環境における細胞の詳細な分析を可能にするデータの生成が必要となる。ここで説明する方法論は、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)による高解像度画像キャプチャーとデータ解析とスフェロイド侵入アッセイを組み合わせることで、潜在的な抗渡走阻害剤の効果の詳細な特徴付けを可能にした。グリオーマ細胞上のMI-192.スフェロイドは、低付着性96ウェルプレートの侵入アッセイ用の細胞株から生成され、CLSM分析のために調製された。記載されたワークフローは、容易さと再現性の両方に起因する他の一般的に使用されるスフェロイド生成技術よりも好まれていました。これは、従来の広視野アプローチと比較して共焦点顕微鏡によって達成される高められた画像分解能と組み合わせることで、次の3D環境における移動細胞における明確な形態変化の同定と分析を可能にした。移動性薬物MI-192による治療。

3次元スフェロイド技術は、がん特異的な環境をより代表的に表しているため、薬物腫瘍相互作用の理解を進めています。スフェロイドの生成は、いくつかの方法で達成することができます。このプロトコルでは、低付着96ウェルプレートが使用されました。異なるメーカーからいくつかの製品をテストした後、彼らは一貫して成功したスフェロイドの生産と均一性の面で最高のパフォーマンスを発揮したので、ここで使用されるプレートが選ばれました。成長培地がコラーゲンマトリックスに置き換えられる置換工程は、プロトコルの重要なポイントです。スフェロイド自体を邪魔することなく、媒体のほとんどを取り除くために細い注意が必要です。広視野顕微鏡による薬物誘発効果の特性を特徴付ける自動イメージングは、任意のハンドラーバイアスを除去すると考えられるかもしれませんが、現在市販されている機器はイメージングアプローチよりもかなり高価なままです。ここで概説します。
広視野上蛍光顕微鏡は、細胞の移動および侵入に対す...

ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤を用いた三次元(3D)侵入アッセイにおけるグリオーマ癌細胞移動に対する移行抑制剤の効果は、高分解能共焦点顕微鏡によって特徴付けられる。

高分解能共焦点顕微鏡による3D腫瘍スフェロイド侵入に対する移動性阻害剤の効果の特徴

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

このプロトコルは、3Dがんモデルにおいてmigrastatic阻害剤の効果を詳細に決定できることを実証しています。主な利点は、この技術を実行できる容易さとオールインワンアプローチです。この技術は、3D設定での癌研究におけるmigrastatic薬の評価を可能にし、より腫瘍環境関連の環境で薬物の検査を可能にする。この方法は、癌における細胞傷害性薬物の検査に適用されるか、または、例えば、癌増殖および細胞移動に対する放射線の影響を評価するために適用され得る。培地除去ステップとコラーゲン置換を通常の96ウェルプレートで行い、自信を持たせます。また、共焦点顕微鏡でのトレーニングも不可欠です。この技術の視覚的なデモンストレーションは、研究者がスフェロイドの繊細な取り扱いと共焦点顕微鏡での使用を理解するために重要です。実験の初日に、標準的な培養培地(この場合はU251)を適当な細胞株に備えておく。組織培養フードでは、0.5ミリリットルのトリプシンを培養液中に加えて、がん細胞をトリプシン化する。がん細胞をヘモサイトメーターで数え、1ミリリットル当たり3番目の細胞に5倍の10倍の濃度に希釈する。細胞懸濁液を明確にラベル付けされた無菌ユニバーサルチューブに保管してください。細胞の凝集を避けるために、優しい反転によって細胞を再中断します。ピペットを使用して、96ウェルプレートの各ウェルに200マイクロリットルの細胞培養液を加えます。蒸発を避けるために、各空の井戸に1X PBSの200マイクロリットルを追加します。37°Cでインキュベーターで細胞をインキュベートします。24時間後、明視野顕微鏡で細胞を確認します。グリオーマ癌細胞株などの細胞株は、24時間以内にウェルの底部にスフェロイドを形成する。スフェロイドをさらに48時間インキュベートして、3Dセルラーアーキテクチャを形成できるようにします。3日目には、コラーゲン、5X培養培地、水酸化ナトリウム1モル、氷上に1本の20ミリリットルチューブを置きます。冷やされた培養管に10.4ミリリットルの冷たいコラーゲンを慎重にゆっくりと加えます。泡を避けてください。次いで、1.52ミリリットルの冷たい無菌5X培養培地を静かに加える。泡を避けてください。使用直前に、72マイクロリットルの冷たい無菌水酸化ナトリウムを静かに加え、溶液を氷の上に置きます。ピペットで泡を避けてやさしく混ぜます。効率的な混合は、媒体中の赤からオレンジレッドへの色の変化につながります。使用するまで氷の上に混合物を残します。次に、1日目に用意した96ウェルプレートから190マイクロリットルの上澄みを取り除き、ウェルの側面に向かって角度を付けてピペットを使用する。井戸の底に形成された回転楕円体を乱さないように非常に注意してください。コラーゲンミックス100マイクロリットルを各ウェルにそっと加え、井戸の側面をピペットダウンします。気泡や回転楕円体の乱れを避けてください。残りのコラーゲンミックスを室温で20ミリリットルチューブに入れず、重合を評価します。インキュベーターにプレートを少なくとも10分間インキュベートし、コラーゲンを重合させます。残ったコラーゲンが半固体とスポンジ状になると、スフェロイドは阻害剤で治療する準備ができています。培地を5ミリリットルに2倍濃度で阻害剤を添加する。ピペット100マイクロリットルの培地は、スフェロイドの乱れを避けるために各ウェルの側面を穏やかに下げる。各スフェロイドを観察し、明視野顕微鏡で、薬物活性を評価するために、0時間、24時間、48時間、72時間の時間に画像化する。その後、プレートをインキュベーターに戻します。さて、プレートを組織培養フードに入れ、上清を1X PBSの100マイクロリットルにそっと置き換えます。スフェロイドを乱さないように気を付け、コラーゲンに触れないようにしてください。この洗浄手順をさらに3回繰り返します。各ウェルで最終洗浄を取り除き、1X PBSで4%ホルムアルデヒドの100マイクロリットルに交換してください。96ウェルプレートをラボベンチに置き、ホイルで覆い、室温で24時間放置します。翌日、ホルムアルデヒドを慎重に取り出し、1X PBSに交換します。この洗浄をさらに3回繰り返します。次に、1X PBS洗浄を、作りたてのトリトンX-100溶液100マイクロリットルに交換します。室温で30分間インキュベートします。その間、50ミリリットルのPBSと05%の脱脂粉乳を50ミリリットルのチューブで50ミリリットルでブロッキング溶液を調製し、十分に混ぜます。30分後、トリトンX-100を取り出し、1X PBSで3回洗浄します。各ウェルにブロッキング溶液100マイクロリットルを加え、15分間インキュベートします。次に、ブロッキングバッファー内のIgGアセチル化チューブリン抗体を1~100の割合で希釈した。15,682回gで5分間の一次抗体遮断緩衝液の混合を遠心分離する。各ウェル内のブロッキング溶液を慎重に除去し、チューブから25〜50マイクロリットルの抗体ブロッキングバッファー上清を加えます。室温で暗闇の中で1時間インキュベートする。次いで、各ウェルから抗体溶液を取り出し、1XPBSの100マイクロリットルで3回洗浄する。任意の追加の蛍光染色に加えて、推奨濃度でブロッキングバッファー内の二次抗体を希釈します。再度、2次抗体溶液を15、682回gで5分間遠心分離する。各ウェルからブロッキング溶液を取り出し、2次抗体上清の25~50マイクロリットルを加える。暗闇の中で室温で1時間半インキュベートする。二次抗体色素溶液を取り除き、1X PBSで3回洗浄し、1ウェルあたり100マイクロリットルを洗浄します。慎重にガラススライドの中央にプラスチック200マイクロリットルピペットで吸引することにより、個々のコラーゲンプラグを持ち上げます。コラーゲンプラグを覆うために適切なマウント剤を1滴追加します。サンプルの上にカバースリップを置き、暗い温度でスライドを保管します。三次元スフェロイド技術は、がん特有の環境をより代表的にしているため、薬物と腫瘍の相互作用の理解を進めています。本研究では、潜在的な抗移動効果または遊遊覧効果が検出された。これは、コントロールまたは処理されたスフェロイドのいずれかで一見移行しないKNS42で特に顕著です。細胞死は、10マイクロモルの最も高い阻害剤濃度で観察された。核の断片化と細胞の移動は、U251細胞で明らかであった。U251細胞スフェロイドは、元のスフェロイドから放射されるスパイクを有し、阻害剤濃度の増加に伴って明らかな細胞の細胞丸めが増加した。KNS42では微小管の崩壊と核の断片化が見られた。単一セルスパイクを有するシート状突起は、KNS42の移行を示す。最も低いインヒビター濃度では、この表現型は顕著であったが、阻害剤濃度の増加とともに失われた。準備ができるまで氷の上にすべての試薬を残することが重要です。それ以外の場合、コラーゲンは、すべてスフェロイドに添加される前に重合を開始します。細胞形態に対するmigrastatic薬の効果を評価するために、共焦点顕微鏡によって生成された画像を定量化する範囲がある。初めて、ミグラスタティック阻害剤MI-192が微小管アセチル化レベルに及ぼす影響を確認し、細胞遊離の観点からさらにこれを探求することができました。固定工程でホルムアルデヒドを取り扱う際には、特別な注意が必要です。通常の安全衛生ガイドラインが適用されます。

characterization-effects-migrastatic-inhibitors-on-3d-tumor-spheroid

Research

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Cancer Research

がん研究

定量的形質転換成長因子（TGF）-β誘導性3次元コラーゲンゲル内侵入を測定するアッセイが記載されている。このアッセイでは、乳がんの開発のさまざまな段階を表現する細胞株のMCF10Aシリーズ、を活用しています。このメソッドは、他の細胞株で使用できるように採用することが可能と侵略の他の潜在的な活性化剤または阻害剤を調査するために使用される可能性があります。...

TGF -β誘発性浸潤を測定する回転楕円体アッセイ

三次元細胞外マトリックスへの腫瘍細胞の浸潤のモデルより反映...

モデリングとイメージング、3次元の集団細胞浸潤

出典:Guyon, J., et al.膠芽腫の3Dスフェロイドモデル. J. Vis. Exp.

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周囲の正常組織への浸潤は、悪性腫瘍の決定的な特徴です。ここでは、進行したヒトがんの多くのモデルで例示されている天然の3Dバイオマトリックスへの浸潤のシンプルな半自動マイクロプレートアッセイを提供します。...

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

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3Dの設定で侵略を評価するために、癌細胞スフェロイドアッセイ

このプロトコルの目的は、三次元フィブリン マトリックス内の細胞の移動に及ぼすプロおよび反 migratory...

三次元培養細胞遊走を特徴付ける傷の環境

膀胱癌の浸潤を支配するプロセスは、バイオ マーカーと治療開発のための機会を表します。腫瘍の回転楕円体、タイムラプス イメージングと共焦点顕微鏡の...

侵略を勉強し、膀胱癌の治療を評価するための 3次元細胞培養システム

腫瘍の微小環境は、がんの成長と侵攻の不可欠な部分です。癌腫の進行を模倣するためには、生物学的に関連したヒトマトリックスが必要である。このプロトコルは、ヒト平滑筋腫ベースのマトリックスを適用することによって in vitro...

三次元スフェロイド浸潤アッセイにおける完全ヒト腫瘍ベースマトリクス

このプロトコルの目的は、免疫蛍光、転写などの異なる分析システムで対処することができる腫瘍バルク状環境における癌関連線維芽細胞(CAF)の分化を研究するために、インビトロモデルで3Dを確立することです。分析および生命細胞のイメージ投射。...

がん関連線維芽細胞分化とインビトロ研究における侵入のためのより生理学的システムとしての3Dスフェロイドモデル

ここでは、神経膠芽腫に対する使いやすい侵入アッセイについて述べています。このアッセイは、神経膠芽腫幹細胞に適しています。侵略、移動、および拡散を容易に定量化するためのフィジーのマクロも説明されています。...

神経膠芽腫の3次元スフェロイドモデル

ここで提示される、スフェロイドイメージング装置の製造のためのプロトコルである。この装置は癌細胞スフェロイドの動的または縦方向の蛍光のイメージ投射を可能にする。プロトコルはまた癌細胞の浸潤の分析のための簡単な画像処理手順を提供する。...

3Dスフェロイドモデルにおける時間分解蛍光イメージングとがん細胞浸潤解析

学ぶ 3D腫瘍スフェロイドを用いた移動性阻害剤の効果評価法。高分解能共焦点顕微鏡で神経膠腫細胞の浸潤を可視化し、がん薬物治療研究に応用する。

高分解能共焦点顕微鏡による3D腫瘍スフェロイド侵入に対する移動性阻害剤の効果の特徴

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