ラット中枢神経系におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの子宮内送達

このプロトコルは、ラットの中枢神経系への治療薬の直接送達を可能にし、ラット病モデルにおける薬物動態、薬力学、および新規治療薬の有効性を評価する。この手順は安全で効果的であり、高価な機器や外科用具を必要としません。この手順を実証することは、私の研究室の研究科学者であるYi ChenとYi Luoです。

特別なガイドカニューレを準備するには、19ゲージ針の両端を切り落とす切り止めホイール付きのロータリーツールを使用して、長さ約1.5〜2センチメートルのガイドカニューレを得ます。その後、回転工具の研削ホイールを使用して両端を滑らかにします。カテーテルワイヤーアセンブリを準備するには、直径011インチの直径PE10チューブの長さ8センチメートルを1枚カットし、各動物の内部カテーテルとして機能します。

エタノール耐性マーカーペンを使用して、チューブの各端から2センチメートルのマークを作ります。動物ごとに、ポリテトラフルオロエチレンコーティングされたステンレス鋼線から11センチメートルの長いスレットワイヤーを8センチメートルのPE10カテーテルのルーメンに挿入します。配達カテーテルアセンブリを準備するために、直径023インチの直径PE50カテーテルに5〜10センチメートルの部分を切断し、カテーテルの一端に23ゲージチューブアダプターを挿入します。

その後、ハブを約0.5センチメートルのPE10チューブに切断した30ゲージの針を挿入し、PE10チューブをカテーテルのもう一方の端に接続します。ガイドカニューレニードルアセンブリを準備するには、ガイドカニューレを23ゲージ針の端に置きます。手術を開始する前に、手術台の上に加熱パッドを置き、無菌ドレープシートでパッドを覆います。

50mLの円錐形遠心分離チューブをシートに置き、麻酔付き実験ラットのつまみつまみへの応答の欠如を確認します。動物の体重を量った後、尾から尾胸椎に背中を剃り、剃ったラットを立ちやすくする位置の滅菌シートに置きます。腰部の脊椎を屈曲させ、眼科軟膏を眼に当てるのに、腹部の下に50mLチューブを置きます。

次に、皮下に徐放ブプレノルフィンのキログラム当たり1ミリグラムを注入し、シーケンシャルポビドネとアルコールスクラブで露出した皮膚をきれいにします。動物を殺菌性透明シートでドレープします。カテーテルの配置と化合物の注入のために、剃った骨盤の上の筋肉の間の2つの自然なピットを識別し、片手でピットを保持して、もう一方の手を使用して、尾長から鼻の方向に背骨を静かに押して感じ、椎骨の間の最初の主要な凹みを見つけます。

S1とL6椎骨の間の椎間スペースを特定した後、L5とL6椎骨の間の椎間スペースを識別するためにわずかにロストリーに移動する。メスを使用して、鼻から尾道の方向までの正中線に沿ってこの部位の皮膚と筋肉カプセルの長さ2センチメートル以下の長い切開を行い、注射部位が切開の中心になるようにします。解剖はさみを使用して、筋肉層が視覚化されるまで結合組織を解剖します。

L6腰椎骨の脊柱プロセスの後部に直ちに筋カプセルの1センチメートルの切開を行います。ガイドカニューレニードルアセンブリを6つ目の腰椎の前側面付近に配置し、針の端部が脊柱管に通るように、6番目の椎骨の前側面に沿って椎間空間にアセンブリを押し込みます。鈍い鉗子を使用してL6腰椎骨の背骨のプロセスを見つけ、6番目の椎骨の前側面に沿って針を無脊椎動物空間に押し込みます。

ガイドカニューレを針に沿って所定の位置に押し込み、針を取り外し、カテーテルワイヤーアセンブリをガイドカニューレに挿入します。脊柱管に約45度の角度でカテーテルを釣り、カテーテルの端部を約0.3センチメートル運河に強制する。カテーテルの先端から約2.5センチメートルのスタイスタイルワイヤーを取り外し、カテーテルの2センチメートルのマーキングが筋肉の下にちょうど見えるまで、カテーテルを脊柱管に進めます。

カテーテルが所定の位置にある場合は、ガイドカニューレを取り外してカテーテルとスタイレットワイヤーを所定の位置に残します。2センチメートルのマークが運河の入り口にあるまでカテーテルを脊柱管に進め、スタイレットワイヤーを完全に引き出します。脳脊髄液は、移植されたカテーテルに入る視覚化され得る。

次に、30ゲージ針の端を介して、埋め込まれたカテーテルの遠位端に配達カテーテルアセンブリを接続します。次に、60マイクロリットルの滅菌生理食塩水を100マイクロリットルのシリンジにロードし、試験化合物の30マイクロリットルのボーラスを第2のシリンジにロードする。サリンシリンジを配達カテーテルアセンブリの管アダプター端に接続し、20マイクロリットルの滅菌生理食塩水を室内空間にフラッシュします。

すべての生理食塩水がフラッシュされたら、生理食塩水をボーラスロードされたシリンジに交換し、30秒間にわたって試験化合物の30マイクロリットルを被検空間に注入します。すべてのボーラスが送達されたら、ボーラスロードされたシリンジを別の生理食塩水に交換し、カテーテルをさらに40マイクロリットルの生理食塩水で洗い流します。生理液剤の第2の容積が送達されたら、注入されたカテーテルから配達カテーテルアセンブリを取り外し、非常に熱い熱殺菌解剖鉗子のペアを使用して、チューブを取り締まり、無菌的に切断し、埋め込まれたカテーテルを熱シールします。

吸収性モノフィラメント縫合糸を使用して、結合組織に熱シールカテーテルを固定し、非吸収性縫合糸を使用して皮膚を閉じます。その後、ガーゼと生理食い物を使用して皮膚から血液を洗浄し、完全な補償まで監視して加熱インキュベーターにラットを入れる。本代表的実験では、実証したように単一ボーラスアンチセンスオリゴヌクレオチド送達後に採取した全ての領域において非常に良好なノックダウンが得られた。

しかし、ある程度の地域変動性は、ノックダウンの割合が最も高い脊髄で測定された。アンチセンスオリゴヌクレオチド、または他の治療薬を適切なモデルに注入した後、1つは、薬物動態、薬力学、および治療薬の有効性を評価することができる。