Name: ラット中枢神経系におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの子宮内送達 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 学ぶラットの中枢神経系へのカテーテル埋め込みによるアンチセンスオリゴヌクレオチドの子宮内送達法。安全で効果的なこの手法は、高価な機器を必要とせず、薬物動態・薬力学・治療効果の評価に活用できる。

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この記事に記載されているASOを提供してくれたIonis製薬に感謝します。

すべての生体内の手順は、実験動物のケアと使用のための米国国立衛生研究所ガイドが定めるガイドラインに従うバイオジェン制度動物使用ケア委員会(IACUC)承認プロトコルの下で行われました。
1. 材料および器具の準備
<ol><li>特別ガイドカニューレを準備します。<ol>
<li>カットオフホイール(または鋭い鋸)を備えたロータリーツールを使用して19G針の両端を切り取り、長さ1.5-2cmの長いガイドカニューレ(図1Aiii)を作成します。回転工具の研削ホイールを使用して、両端を滑らかにします。 注:または、プレメイドおよび滅菌ガイドカニューレは、商業ベンダー(材料の表)から購入することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>カテーテル/ワイヤーアセンブリを準備します。<ol>
<li>8cmの長さのPE-10チューブ(ポリエチレンチューブ、直径0.011インチ)を切り、内皮カテーテルとして機能させます。エタノール耐性マーカーペンで片端から2cmのマークを作ります。ポリテトラフルオロエチレンコーティングされたステンレス鋼線から11cmの長いスタイルワイヤーをカットします。STYLEt ワイヤ (図 1Aii)を PE-10 カテーテルのルーメンに挿入します (図 1Ai)。 メモ:動物ごとに1つのカテーテル/ワイヤアセンブリセット(図1Av)が必要です。あるいは、カテーテルとスタイルワイヤーは、商業ベンダー(材料の表)から購入することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>配達カテーテルアセンブリを準備します。<ol>
<li>PE-50カテーテル(5−10cm、ポリエチレンチューブ、直径0.023インチ)をカットします(図1Bi)。PE50カテーテルの一方の端に23 Gチューブアダプターを挿入します(図1Biv)。この端は外科の間に100°Lの注射器(材料のテーブル)に接続される。ハブを切断した修正された30 G針(図1Biii)をPE-10チューブの約0.5cmのチューブ(図1Bii)に挿入し、PE-10チューブをカテーテルのもう一方の端に接続します。</li>
		<li>送達カテーテルアセンブリの30 G針端(図1Bv)は、手術中にラットに埋め込まれたPE-10カテーテルの遠位端に接続されます。 注: または、デリバリーカテーテルアセンブリ(図1Bv)は、市販のベンダー(材料表)から購入することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ガイドカニューレアセンブリ(図1Avi)を23G針の端にガイドカニューレ(図1Aiii)を置いて準備します。</li>
	<li>12時間のエチレンオキシド殺菌装置を使用して、ガイドカニューレおよびワイヤー/カテーテルセットを含むすべての手術器具を殺菌します。 メモ:カテーテルを除くすべての外科器具はオートクレーブすることができる;カテーテルは高温で溶ける。</li>
</ol>2. 手術準備
注:この手順は、200gと400グラムの間の体重を持つ男性と女性のスプレイグ・ドーリーラットに対して日常的に行われます。2匹のラットは、食べ物と水への無料アクセスで12時間の光/暗いサイクルの下でケージごとに収容されています。
<ol><li>ラットを重量を量り、麻酔を誘発するためにイソフルランチャンチャンチャンチャン内に置く(O2では1−5%のイソフルラン、効果を発揮する)。 注:ラットは、その後、手順全体を通して鼻コーンを介して深い麻酔を維持するために、イソフルランで連続的に麻酔されます。代替麻酔法(例えば、ケタミン100mg/kgおよびキシラジン10mg/kgの投与)は、IACUCによって承認され、使用することができる。</li>
	<li>ラットがつま先のピンチに反応しない場合は、尾から尾部胸部脊椎に背中を剃り、加熱パッドの上に置かれた滅菌シートの上に剃ったネズミを置きます。</li>
	<li>50 ml 円錐円錐遠心管をラットの腹部の下に置き、腰部の脊椎を屈曲させ(図2A)、眼に眼軟膏を塗布する。</li>
	<li>持続放出ブプレノルフィンを注入する (1.0 mg/kg;材料表)ラットで皮下に。ポビドネとアルコールスクラブを交互に露出した皮膚をきれいにし、これを3回繰り返します。 注: 代替疼痛緩和は、IACUC プロトコルの承認に応じて使用できます。</li>
	<li>手術部位の上にフェンストされた無菌透明のドレープで動物をドレープ。</li>
</ol>3. 手術
<ol><li>50 mL円錐管で支持されたラットを使用して、骨盤の上の筋肉間の2つの自然なピットを特定します(図2Aの矢印)。片手でピットを握り、もう一方の手を使って背骨を大胆に押して、歯の方向に向かう方向に向かい、椎骨間の最初の大きなインデントを見つけ、これはS1とL6椎骨の間の椎間空間である(図2B)).</li>
	<li>次のインデント、L5とL6椎骨と注射部位との間の椎間空間(*図2A)を識別するために少し唇を動かす。メスを使用して、ロストラルからコードへの中間線に沿って皮膚に長さ2cm以下の切開を行い、注射部位が切開の中心になるようにする(図2Aの点線)。</li>
	<li>筋肉層を視覚化するために、解剖はさみを使用して結合組織を解剖します。その後、L6腰椎の後ろ脊椎プロセスに直ちに横に筋肉カプセルで1cmの切開を行う。 注:この時点で、L6腰椎の骨を可視化することができます。</li>
	<li>ガイドカニューレ針アセンブリを第6腰椎の前面の近くに置き、針の端が脊柱管を貫通するように第6椎骨の前方面に沿って椎間空間に押し込みます。針に沿ってガイドカニューレを所定の場所に押し、ガイドカニューレのみを残して23 G針を取り外します。 注:針を挿入する前に、L6腰椎の後ろ下のプロセスを見つけるために鈍い鉗子を使用すると便利です。一般に、CSF流体は針ハブに入るのを見ることができます(この流体は血液のヒントで刺さるかもしれませんが、これは害が行われたこと、または針が正しく置かれないことを示すものではありません)。著者らは、この処置中に大量の血液や重度の出血を見ていない。どちらかが発生した場合は、獣医に連絡して適切な治療を決定し、動物を安楽死させる必要があるかどうかを判断する必要があります。</li>
	<li>カテーテルワイヤーアセンブリをガイドカニューレに挿入します。カテーテルワイヤーアセンブリを脊柱管に対して約45°の角度で角度を下ろし、両端を約0.3cmの脊柱管に押し込みます。</li>
	<li>ガイドカニューレを取り外し、カテーテルにスタイルワイヤーを付け置いたままにします。図 1Bviに示すように、カテーテルの皮内先端から約 2.5 cm のスイレット ワイヤーを取り外し、2 cm のマークが運河の入り口 (筋肉のすぐ下に表示される) になるまでカテーテルを脊柱管に進めます。 注:挿入されたカテーテルはくも膜下腔にロスタリングを伸ばす必要があります。配置が成功すると、その空間でカテーテルを自由に動かせることができるようにする必要があります。</li>
	<li>スティットワイヤーを完全に撤回し、CSFが埋め込まれたカテーテルに入るのを見る。</li>
	<li>30 G針端を介して、移植されたカテーテルの遠位端に送達カテーテルアセンブリを接続します(図1Bv,vi)。</li>
	<li>滅菌生理食塩水を100μLシリンジ(フラッシングシリンジ)にロードします。試験化合物(例えば、ASO溶液)の30μLのボーラスを第2シリンジ(注射注射器)にロードする。</li>
	<li>フラッシュシリン(生理線をロード)をデリバリーカテーテルアセンブリのチューブアダプタ端に接続します(図1Bv)。20 μLの滅菌生理食塩水を内腔に注入する(注射前のフラッシング)。</li>
	<li>注入注射器(試験化合物を搭載)をデリバリーカテーテルアセンブリのチューブアダプター端に接続します(図1Bv)。30°Lの試験化合物を30s以上の内腔に注入する。 注:ASOの定期的な注入容積は脊髄および皮質のよいノックダウンを達成するために30°Lである。異なる注入量は試験されていないが、注入量が化合物分布12に影響を及ぼす可能性が報告されている。他の化合物または体積を使用する場合は、安全性と有効性を経験的に決定する必要があります。</li>
	<li>ステップ3.10を繰り返し、カテーテルを滅菌生理食塩水の別の40°L(注射後のフラッシング)で洗い流します。次に、移植されたカテーテルから送達カテーテルアセンブリを取り外します。 注:プレおよびポストインジェクションフラッシュは、化合物の局所的な隔離を減少させ、ロストラル構造12への分布を改善すると考えられている。</li>
	<li>無菌的に切断し、移植されたカテーテルを加熱シールする:彼らは非常に熱くなるまでビーズ滅菌器に滅菌鉗子のペアを置き、鉗子の熱い端でチューブを締め付けます。 注:このアクションは、カテーテルを溶融します。したがって、チューブ内の穴が崩壊し、すべての側面が互いに固執し、無菌の方法でチューブを密封し、その後、皮下空間に配置されます。</li>
	<li>吸収性モノフィラメント縫合糸を使用して、残りの熱密閉カテーテルを結合組織に固定します。次に、非吸収性モノフィラメント縫合糸を使用して、固定されたヒートシールカテーテルの上に皮膚を閉じます。 メモ:巻きクリップは、IACUCプロトコルの承認を得て使用することもできます。この技術は、私たちの手の中で1回の注射にのみ使用されていますが、繰り返し注射と互換性があります。繰り返し注射の実現可能性は、IACUCの承認を得て経験的に評価されるべきである。</li>
	<li>ガーゼと生理線を使用して皮膚から血液を洗浄し、動物が加熱されたインキュベーターで麻酔から回復できるようにして移動し、その時点でホームケージ(ケージあたり2匹のラット)に戻します。 注:同じ日に複数のラットに対して手術を行う場合、動物間の加熱ドライビーズ滅菌装置(少なくとも20s、冷却する時間)を使用して、水を使用して血液を除去し、再殺菌する洗浄ツール。5匹ごとに新しい楽器のセットが使用されます。</li>
	<li>手術後少なくとも3日間は毎日動物を監視し、IACUCプロトコルに従って手術から回復した後、毎週動物を監視し続けます。 注:合併症(尿貯留、切開感染、発作や麻痺などの神経疾患)が発生した場合は、獣医に連絡して適切な治療を決定し、動物を安楽死させる必要があります。持続放出ブプレノルフィンを使用しない場合は、IACUCプロトコルに従って手術後毎日痛みの軽減を与えるべきである。</li>
</ol>4. IT注入後の組織特異的ノックダウンの評価
<ol><li>ASAのITボーラス注射の2週間後に、脳の異なる領域(すなわち、大脳皮質、線条体および小脳)ならびに脊髄の異なるセグメント(すなわち、頸部、胸部、腰部)を収集する。市販のRNA抽出キットを用いて全組織RNAを抽出し、前に説明した13のようにcDNA合成反応を行う。 注:標準試薬は、ラットMalat1およびラットGAPDHのアッセイでqPCRに使用した。相対転写レベルは、2-ΔΔCT法(CT=閾値サイクル)を用いて算出した。</li>
</ol>

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</ol>

著者は、バイオジェン社またはイオンス製薬の全従業員です。著者らは、イオンス製薬から記事に記載されているアンチセンスオリゴヌクレオチドを受け取る。

本論文は、ラットCNSに直接治療薬を送り込む強力な方法を示す。理論的には、マウスでも同様の技術を行うことができますが、サイズが小さいため、この方法はより困難になる可能性があります。したがって、我々のグループは、CNS薬物送達のためのマウスにおける血管膜内血管内注射(ICV)を行い、異なる投与経路を通じて同じ目標に達する。その方法は、別の研究16に記載されている。
ここで説明する方法の利点は、高価な機器や特別なツールを必要としないということです。図 1Aに示すカテーテル/ワイヤ アセンブリを事前に準備することをお勧めします。研究ではラットと同じ数のカテーテル/ワイヤーアセンブリを準備する必要がありますが、手術中に損傷を受けたり交換する必要がある場合に備えて、カテーテル/ワイヤーアセンブリを用意することをお勧めします。
技術が習得されると、記載された手順全体がラットあたり約25分を必要とする...

中枢神経系(CNS)の血管系は、恒常性の重要な調節体として進化し、分子のトラフィックを制御し、栄養素を供給し、廃棄物を取り除いた。このシステムはまた、内皮細胞の壁に沿って密な接合部の密集した分布のおかげで、外部病原体の攻撃からの防御の最初のラインです。これらのタイトな接合部は、血液脳関門(BBB)の1つの側面を構成する。BBBは、栄養素とエネルギー要求(例えば、イオン、グルコース)を満たすために必要な分子の輸送を可能にする一方で、それはまた、有害化学物質1、2、3と同様に病原体の通過を選択的に制限する。
皮肉なことに、病原体や有毒化学物質の通過を制限するBBBの同じ保護機能も、生物2への全身投与後に治療治療を受けてCNSに容易にアクセスする能力の大きな障害である。 4、5.BBBのこの役割は、新しい薬剤流通技術の多くの開発を促し、アプローチ6.
この障害を克服する1つの方法は、脳と脊髄7、8、9、10の両方を連続的に浸透させる脳脊髄液(CSF)に薬物を直接注入することです。本稿では、カテーテルの内端をラット脊椎のカウダ平名空間に完全に配置することにより、腰部内腔に薬剤を正常に送り込む方法について説明する。この手順の説明は、以前に Mazur et al.11. .
このプロトコルは非常に有効であり、標的遺伝子ノックダウン8の定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)分析によって評価された場合、CNSへのアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)送達の90%以上の成功率を生成する。この処置は、ラットの100%が手術を生き延び、外科的創傷の周りに最小限の腫脹を示し、苦痛の兆候を示さない(例えば、多動、脱水、循環、バランスの喪失、食物摂取量の減少、および脱水)、オペ後の観察中。ここで説明する方法のもう一つの利点は、高価な機器や特別なツールを必要としないということです。

<table><tbody><tr><td>3M Steri-Drape 粘着性の開きが付いている小さいドレープ</td><td>3M</td><td></td><td>1020</td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td>Decon Laboratories, Inc</td><td></td><td>8416-160Z</td></tr><tr><td>アルコール綿棒は</td><td>Dynarex</td><td></td><td>NO 1204</td></tr><tr><td><a href="https://punchout.fishersci.com/shop/products/bd-general-use-syringes-5/22124967?crossRef=BD%20302830#?keyword=BD+302830">BD 一般用注射器を 1 mLルアーロックチップ</a></td><td>BD</td><td>1ml TB ルアーロックチップ</td><td>BD 302830</td></tr><tr><td>BD イントラメディック PE チューブ</td><td>BD</td><td>ポリエチレンチューブ PE50 直径 0.023 インチ</td><td>BD 427400 (10フィート、フィッシャー・サイエンティフィック 22-204008) または 427401 (100フィート、フィッシャー・サイエンティフィック 14-170-12P)</td></tr>BD イン<tr><td>トラメディック PE チューブ</td><td>BD</td><td>ポリエチレンチューブ PE10 直径 0.011 インチ</td><td>BD 427410 (10フィート、フィッシャー・サイエンティフィック 14-170-11B) または 4274011 (100フィート、フィッシャー・サイエンティフィック)14-170-12B)</td></tr><tr><td>BD Intramedic PEチューブアダプター</td><td>BD</td><td>23ゲージ intramedic ルアースタブアダプター</td><td>BD 427565またはフィッシャーサイエンティフィック 14-826-19E</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 使い捨て針 30G</td><td>BD</td><td></td><td>BD</td></tr> 305128 <tr><td>ブプレノルフィン徐放性ラボ</td><td>ZooPharm</td><td>処方箋が必要</td><td></td></tr><tr><td>エチレンオキシド滅菌器</td><td>アンダーセン滅菌器 INC.</td><td>AN 74i、ガス滅菌器</td><td>AN 74i</td></tr><tr><td>ガイドカニューレ</td><td>BD</td><td>19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) 針</td><td>BD</td></tr><tr><td>305186 ハミルトンシリンジ 100ul</td><td>ハミルトン社</td><td>ハミルトンシリンジ 100ul</td><td></td></tr><tr><td>ホットビーズ滅菌器</td><td>ファインサイエンスツール</td><td></td><td>滅菌器 モデルノ FST 250</td></tr><tr><td>眼科軟膏</td><td>デクラ veterranery 製品</td><td></td><td>17033-211-38</td></tr><tr><td>ポケットプロペットトリ</td><td>マーBraintreeサイエンティフィック</td><td></td><td>CLP-9931 B</td></tr><tr><td>ポビドンスクラブ</td><td>PDI</td><td></td><td>S48050</td></tr>生理<tr><td>食塩水</td><td>バクスター</td><td>塩化ナトリウム0.9%静脈内注入BP50ml</td><td></td></tr><tr><td>FE1306Gメス</td><td>フェザー</td><td>使い捨てメス</td><td>No.10</td></tr>小<tr><td>動物加熱パッド</td><td>K&H製造</td><td></td><td>モデル#1060</td></tr>スティ<tr>レット<td>ワイヤーMcMaster-Carr</td><td>1749T14</td><td>LH-36233780</td><td></td></tr>手術<tr><td>タオルは、</td><td>ダイナレックス</td><td></td><td>4410</td></tr><tr><td>外科用はさみや鉗子</td><td>FSTとフィッシャー科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>縫合糸</td><td>Ethicon</td><td></td><td>4-0または5-0</td></tr><tr><td>ガイドカニューレ</td><td>グレインジャー</td><td>回転ツール(Dremel)を作るためのツール</td><td>14H446 (Mfr: EZ456)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>EZロックカットオフ砥石</td><td>1PKX5 (Mfr: 3000-1/24)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>砥石、酸化アルミニウム</td><td>38EY44 (Mfr: EZ541GR)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>EZロックマンドレル</td><td>1PKX8 (Mfr: EZ402-01)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>ダイヤモンド砥石床タイル</td><td>3DRN4 (Mfr: EZ545)</td></tr><tr><td>この手順のための既製および滅菌材料の代替ソース </td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>カテーテルシステム</td><td>SAI輸液システム</td><td></td><td>RIDC-01</td></tr><tr><td>ガイドカニューレ</td><td>SAI輸液システム</td><td></td><td>RIDC-GCA</td></tr><tr><td>内部カテーテル</td><td>SAI輸液システム</td><td></td><td>RIDC-INC</td></tr><tr><td>スティレットワイヤー</td><td>SAI輸液システム</td><td></td><td>RIDC-STYの</td></tr></tbody></table>

ラット中枢神経系におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの子宮内送達

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

血液脳関門(BBB)は、血液から中枢神経系(CNS)への潜在的に有毒または病原性物質の入り口に対する重要な防御である。しかしながら、その存在はまた、CNSに全身的に投与された治療薬のアクセシビリティを劇的に低下する。これを克服する1つの方法は、これらの薬剤を脳脊髄液(CSF)に直接注入し、したがってBBBをバイパスすることです。これは浸透ポンプを使用して連続的な注入のためのカテーテルの注入によって、または単一のボーラスの配達のために行うことができる。本稿では、成人ラット脊椎のカウダ平ーナ空間に直接移植されたカテーテルを介してCNS標的アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)を送達するための外科的プロトコルについて説明する。代表的な結果として、ラットCNSの異なる領域で標的RNAをノックダウンするこのカテーテル法を介した単一のボーラスASO内皮(IT)注射の有効性を示す。プロシージャは安全で、有効であり、高価な装置または外科用具を要求しない。ここで説明する技術は、他のモダリティでも薬物を送出するように適合させることができる。

ここで説明する方法を用いて、リン酸緩衝生理食塩水PBSの単一ボーラスまたは長い非コーディング(linc)RNA Malat1を標的とするASOの300μgを用いて成体メスラットの2つのグループ(250−300g;n=10/グループ)を注入した。私たちの研究室では、Malat1が脳と脊髄を含むすべての組織14でユビキタスかつ高レベルで表現されているため、Malat1 ASOをツールコンパウンドとして日常的に使用しています。Malat1 ASOは、RNAを劣化させるRNaseH1媒介機構15を介して動作し、ノックダウン(KD)を導く。ここで説明した実験では、脳の異なる領域(すなわち、大脳皮質、線条体および小脳)と脊髄の腰部セグメントを、ASOの送達の2週間後に採取した。収集した各領域からのRNAを抽出し、qPCRを介して分析し、Malat1 RNAの発現レベルを評価した。
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ここでは、脊椎の腰部内腔にカテーテルを移植してラット中枢神経系に薬物を送出する方法について説明する。私たちはアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達に焦点を当てていますが、この方法は他の治療モダリティの送達にも適しています。

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...

このプロトコルは、ラットの中枢神経系への治療薬の直接送達を可能にし、ラット病モデルにおける薬物動態、薬力学、および新規治療薬の有効性を評価する。この手順は安全で効果的であり、高価な機器や外科用具を必要としません。この手順を実証することは、私の研究室の研究科学者であるYi ChenとYi Luoです。特別なガイドカニューレを準備するには、19ゲージ針の両端を切り落とす切り止めホイール付きのロータリーツールを使用して、長さ約1.5〜2センチメートルのガイドカニューレを得ます。その後、回転工具の研削ホイールを使用して両端を滑らかにします。カテーテルワイヤーアセンブリを準備するには、直径011インチの直径PE10チューブの長さ8センチメートルを1枚カットし、各動物の内部カテーテルとして機能します。エタノール耐性マーカーペンを使用して、チューブの各端から2センチメートルのマークを作ります。動物ごとに、ポリテトラフルオロエチレンコーティングされたステンレス鋼線から11センチメートルの長いスレットワイヤーを8センチメートルのPE10カテーテルのルーメンに挿入します。配達カテーテルアセンブリを準備するために、直径023インチの直径PE50カテーテルに5〜10センチメートルの部分を切断し、カテーテルの一端に23ゲージチューブアダプターを挿入します。その後、ハブを約0.5センチメートルのPE10チューブに切断した30ゲージの針を挿入し、PE10チューブをカテーテルのもう一方の端に接続します。ガイドカニューレニードルアセンブリを準備するには、ガイドカニューレを23ゲージ針の端に置きます。手術を開始する前に、手術台の上に加熱パッドを置き、無菌ドレープシートでパッドを覆います。50mLの円錐形遠心分離チューブをシートに置き、麻酔付き実験ラットのつまみつまみへの応答の欠如を確認します。動物の体重を量った後、尾から尾胸椎に背中を剃り、剃ったラットを立ちやすくする位置の滅菌シートに置きます。腰部の脊椎を屈曲させ、眼科軟膏を眼に当てるのに、腹部の下に50mLチューブを置きます。次に、皮下に徐放ブプレノルフィンのキログラム当たり1ミリグラムを注入し、シーケンシャルポビドネとアルコールスクラブで露出した皮膚をきれいにします。動物を殺菌性透明シートでドレープします。カテーテルの配置と化合物の注入のために、剃った骨盤の上の筋肉の間の2つの自然なピットを識別し、片手でピットを保持して、もう一方の手を使用して、尾長から鼻の方向に背骨を静かに押して感じ、椎骨の間の最初の主要な凹みを見つけます。S1とL6椎骨の間の椎間スペースを特定した後、L5とL6椎骨の間の椎間スペースを識別するためにわずかにロストリーに移動する。メスを使用して、鼻から尾道の方向までの正中線に沿ってこの部位の皮膚と筋肉カプセルの長さ2センチメートル以下の長い切開を行い、注射部位が切開の中心になるようにします。解剖はさみを使用して、筋肉層が視覚化されるまで結合組織を解剖します。L6腰椎骨の脊柱プロセスの後部に直ちに筋カプセルの1センチメートルの切開を行います。ガイドカニューレニードルアセンブリを6つ目の腰椎の前側面付近に配置し、針の端部が脊柱管に通るように、6番目の椎骨の前側面に沿って椎間空間にアセンブリを押し込みます。鈍い鉗子を使用してL6腰椎骨の背骨のプロセスを見つけ、6番目の椎骨の前側面に沿って針を無脊椎動物空間に押し込みます。ガイドカニューレを針に沿って所定の位置に押し込み、針を取り外し、カテーテルワイヤーアセンブリをガイドカニューレに挿入します。脊柱管に約45度の角度でカテーテルを釣り、カテーテルの端部を約0.3センチメートル運河に強制する。カテーテルの先端から約2.5センチメートルのスタイスタイルワイヤーを取り外し、カテーテルの2センチメートルのマーキングが筋肉の下にちょうど見えるまで、カテーテルを脊柱管に進めます。カテーテルが所定の位置にある場合は、ガイドカニューレを取り外してカテーテルとスタイレットワイヤーを所定の位置に残します。2センチメートルのマークが運河の入り口にあるまでカテーテルを脊柱管に進め、スタイレットワイヤーを完全に引き出します。脳脊髄液は、移植されたカテーテルに入る視覚化され得る。次に、30ゲージ針の端を介して、埋め込まれたカテーテルの遠位端に配達カテーテルアセンブリを接続します。次に、60マイクロリットルの滅菌生理食塩水を100マイクロリットルのシリンジにロードし、試験化合物の30マイクロリットルのボーラスを第2のシリンジにロードする。サリンシリンジを配達カテーテルアセンブリの管アダプター端に接続し、20マイクロリットルの滅菌生理食塩水を室内空間にフラッシュします。すべての生理食塩水がフラッシュされたら、生理食塩水をボーラスロードされたシリンジに交換し、30秒間にわたって試験化合物の30マイクロリットルを被検空間に注入します。すべてのボーラスが送達されたら、ボーラスロードされたシリンジを別の生理食塩水に交換し、カテーテルをさらに40マイクロリットルの生理食塩水で洗い流します。生理液剤の第2の容積が送達されたら、注入されたカテーテルから配達カテーテルアセンブリを取り外し、非常に熱い熱殺菌解剖鉗子のペアを使用して、チューブを取り締まり、無菌的に切断し、埋め込まれたカテーテルを熱シールします。吸収性モノフィラメント縫合糸を使用して、結合組織に熱シールカテーテルを固定し、非吸収性縫合糸を使用して皮膚を閉じます。その後、ガーゼと生理食い物を使用して皮膚から血液を洗浄し、完全な補償まで監視して加熱インキュベーターにラットを入れる。本代表的実験では、実証したように単一ボーラスアンチセンスオリゴヌクレオチド送達後に採取した全ての領域において非常に良好なノックダウンが得られた。しかし、ある程度の地域変動性は、ノックダウンの割合が最も高い脊髄で測定された。アンチセンスオリゴヌクレオチド、または他の治療薬を適切なモデルに注入した後、1つは、薬物動態、薬力学、および治療薬の有効性を評価することができる。

intrathecal-delivery-antisense-oligonucleotides-rat-central-nervous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典: Chen, Y., et al.ラット中枢神経系におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドのくも膜下腔内送達J. Vis. 経験。...

ラット中枢神経系への試験化合物のくも膜下腔内送達

出典: Li, D., et al.成体マウスにおける組換アデノ随伴ウイルスの直接髄腔内注射J. Vis. 経験。 (2019年)このビデオは、覚醒マウスの脳脊髄液(CSF)にアデノ随伴ウイルス(AAV)を髄腔内注射する手順を示し、注射器の準備、脊椎のアライメント、および正確な針の挿入をカバーしています。この方法は標的遺伝子送達を検証し、CNS...

中枢神経系疾患を治療するためのマウスモデルにおけるウイルスのくも膜下腔内送達

我々は、カテーテルを注入又はマウスにおける右側脳室へのボーラス注入を実行することにより、中枢神経系に薬物を標的化する方法について述べる。私たちは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配信に特に焦点を当てています。この技術は、他の薬剤に、ラットに容易に適用可能である。...

齧歯中枢神経系への薬物の直接脳室内デリバリー

このレポートでは、短い持続軽麻酔下マウスにおける腰椎脊髄におけるsiRNAのローカライズされたトランスフェクションのための髄腔内針穿刺の簡便かつ迅速な技術が記載されている。...

マウスにおける急速な非侵襲腰椎髄腔内注射を経由して生体内 siRNAトランスフェクションと脊髄における遺伝子ノックダウン

ラットにおける広域中枢神経系遺伝子導入法を説明します。この例では目的は脊髄全体に影響を与える疾患を模倣するためです。広範な伝達は一時、周辺の管理からして中枢神経系治療用タンパク質を提供する使用できます。...

メソッドおよびアデノ随伴ウイルス ラットの静脈内投与と中枢神経系の伝達の評価のためのヒント

小動物に効率的なアデノ随伴ウイルス配信しているし、中央に伝達効率を予測するスコアリング システムを確立するウイルス ソリューションで 1%...

成体マウスの遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスの直接髄腔内注入

ここでは、脳標的ペプチドsiRNA製剤の鼻腔内投与に対するマウスの適切な配置を可能にするマウス位置決め装置を用いて、中枢神経系における有効な遺伝子サイレンシングを可能にするプロトコルを提示する。...

中枢神経系への鼻腔内siRNA送達中におけるマウスの配置のための位置決め装置

本プロトコルは、遺伝子編集および薬物送達のために新生児マウスで髄腔内注射を行うためのステップバイステップの指示を概説する。...

ゲノム編集とドラッグデリバリーのための新生児マウスの髄腔内注射

幼若ラットの腰椎槽に注射を行うための外科的処置が記載されている。このアプローチは、遺伝子治療ベクターの髄腔内送達に使用されてきましたが、このアプローチは、細胞や薬物を含むさまざまな治療に使用できることが期待されています。...

腰椎貯水槽注射による幼若ラットの髄腔内ベクター送達

腰椎髄腔内注射は、中枢神経系に遺伝子治療を実施するための翻訳的に関連する投与経路を表しています。新生児、若年、成体のマウスおよびラットにおける腰椎髄腔内注射のためのこの包括的な標準化されたプロトコルは、研究者がこの技術を前臨床遺伝子治療研究に採用する際の指針となることを目的としています。...

マウスおよびラットにおける中枢神経系を標的とした遺伝子治療ベクターの腰椎髄腔内注射

本記事では、成マウスにおけるCNS標的治療薬の鞘内投与方法を詳述し、プロトコルの精度と繰り返し注射の可能性に焦点を当てています。この研究には、反センスオリゴヌクレオチドがSOD1-ALSモデルマウスにおける変異SOD1発現を低減させた検証研究の結果が含まれており、神経変性疾患の前臨床研究におけるこのアプローチの有用性を支持しています。...

ヒトSOD1-G93AALSマウスにおける中枢神経系の正確な標的化と予測効果のためのSOD1-ASOsの腰椎鞘内注射

学ぶラットの中枢神経系へのカテーテル埋め込みによるアンチセンスオリゴヌクレオチドの子宮内送達法。安全で効果的なこの手法は、高価な機器を必要とせず、薬物動態・薬力学・治療効果の評価に活用できる。

ラット中枢神経系におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの子宮内送達

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