Name: 光音響フローサイトメトリーを用いた卵巣癌検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学ぶ光音響フローサイトメトリーによる卵巣がん循環腫瘍細胞検出法。葉酸修飾硫化銅ナノ粒子を用いて特異的マーカーを検出し、低コストで簡便な臨床応用を実現します。

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著者たちは、合成の助けのためにマドレーヌ・ハウエル、フローシステムを設計する彼の助けのためのマシュー・チェスト、およびSolidWorksの支援のためのイーサン・マーシャールを認めたい。

1. ナノ粒子合成と機能化
注:FA-CuS SPの合成は、以前に公開されたプロトコル21から適合した1つのポット合成法を使用して達成される。 注意:すべての合成は、換気された化学ヒュームフードで発生する必要があります。
<ol><li>合成の前に、0.2μmの滅菌フィルターを用いて約300mLの脱イオン化(DI)水を濾過する。</li>
	<li>洗剤液で250mLガラスの丸底フラスコを洗浄し、DI水で洗い流します。1mMの溶液を作成するために、100 mLのDI水にCuCl2の0.0134 gを追加します。</li>
	<li>CuCl2溶液に0.015gの葉酸(FA)を加え、磁気攪拌バーを使用して約5分間撹拌します。</li>
	<li>200°Lピペットを利用した反応混合物に、Na2S・9H2O(100μL DI水で0.024g)を約10s以上添加します。 メモ:Na2S·9H2Oを追加すると、溶液は明るい黄色から濃い茶色に色を変更します。</li>
	<li>反応をキャップし、オイルバスに入れ、90°Cに設定し、磁気攪拌バーで攪拌を続けます。約15分後、またはオイルバスが85-90°Cに達したら、さらに1時間反応を進めさせる。混合物は徐々に濃い緑色に変わるはずです。 メモ:圧力の蓄積を避けるために、反応混合物を加熱しながらシステムを通るようにしてください。</li>
	<li>オイルバスから反応容器を取り出し、室温で約10~15分間冷ましてから氷浴に移します。</li>
	<li>反応混合物が20°C以下に冷却されたら、1M NaOHを利用してpHを10に調整し、残りの葉酸を溶液に溶解させる。</li>
	<li>30 kDa遠心分離カラムを使用してFA-CuS反応混合物を精製します。15 mL バッチで溶液をカラムに追加し、3,082 x g で 15 分間遠心分離します。</li>
	<li>全ての反応混合物が濃縮されたら、濃縮画分を再結合し、30kDa遠心分離カラムでpH10 NaOHの15 mLで4x洗浄する。</li>
	<li>質量測定の場合は、溶液の1/3(〜66°L)を取り、3つのガラスバイアルに分割します。真空オーブンで40°Cで~27mmHgの真空下で一晩乾燥させます。</li>
	<li>濃縮溶液の他の2/3を250°LのPBSに溶かし、さらに使用するまで4°Cで保存します。</li>
	<li>FA-CuSのNPを利用する前に、高い設定で浴ソニシエーターで30分間超音波処理します。</li>
</ol>2. NP特性評価
<ol><li>動的光散乱(DLS)を実行し、ステップ1.1.14から2 mLのDI水からPBS溶液に濃縮FA-CuS NPSを10°L追加します。DLSによる特性評価の前に、高い設定で浴ソニシエーターで30分間粒子を超音波処理し、0.2μmの滅菌フィルターを通して残留粉塵を除去します。</li>
	<li>透過型電子顕微鏡(TEM)を行う:PBS溶液に濃縮FA-CuS NPSを10μLをワックス紙に加えます。液滴の上部にあるフォームバー被覆銅グリッドを反転し、2分間座らせます。空気を乾燥させてください。80kVの加速電圧で電子顕微鏡を利用した銅グリッドを画像化する。 注: FA-CuS NPS 特性評価の一般的な結果を図 1に示します。</li>
</ol>3. 細胞培養
<ol><li></li></ol><ol><li></li><li><li></li><li></li></ol><ol><li><li></li><li><li></li><li></li><li><li><li></ol><ol><li><li></li><li><li><li> </li><li> </li><li><li><li><li><li><li></li></ol><ol><li> <ol><li> </li><li><li><li><li><li></ol></li><li> <ol><li><li><li><li> </li><li> </li><li><li><li><li><li><li></li><li></ol></li></ol><ol><li><li><img src="/files/ftp_upload/60279/60279eq1.jpg"></li><li></li></ol>

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<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+flow+cytometry+for+single+sickle+cell+detection+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Cellular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic flow cytometry for single sickle cell detection in vitro and in vivo.</a> Analytical Cellular Pathology. 2016, 11(2016).</li>
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<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+living+circulating+tumor+cells+in+patients+by+immunomagnetic+negative+enrichment+coupled+with+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry.</a> Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).</li>
<li>Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+capture+of+breast+cancer+cells+with+photoacoustic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007(2016).</li>
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<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+liquid+biopsy+using+Cytophone+platform+for+photoacoustic+detection+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma.</a> Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857(2019).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photoacoustic+flow+cytometry+for+early+malaria+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis.</a> Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).</li>
<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+magnetic+enrichment+and+multiplex+photoacoustic+detection+of+circulating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells.</a> Nature Nanotechnology. 4 (12), 855(2009).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

このプロトコルは、PAFCおよび標的CuS造影剤を利用した卵巣CTCの検出のための簡単な方法である。マイクロ流体デバイス、RT-PCR、および蛍光フローサイトメトリー23、24、25を含む卵巣CTCの検出のための多くの方法が検討されている。これらの範囲の複雑さ、コスト、および精度は、臨床現場での有効性を制限します。PAFCは、患者サンプル内のCTCを検出する機能や、生体内アプリケーションへの変換の容易さなど、CTCの検出に関するこれらの従来の方法に対していくつかの利点を導入しています。PAFCはまた、標的造影剤26、27と組み合わせた場合に、インビトロおよびインビボでCTCを正確に検出することも示されている。
本研究では、FA-CuS NP造影剤が生理学的に関連する濃度でCTC検出...

卵巣癌は最も致命的な婦人科の悪性腫瘍の一つであり、2018年に世界中で推定184,800人の死亡をもたらした。複数の研究は、卵巣癌の進行(すなわち、転移)とCTC2、3、4の存在との間の相関関係を示している。CTCの検出および単離のための最も一般的な方法は、EpCam受容体5を標的とするセルサーチシステムを利用する。しかしながら、EpCam発現は、癌転移6に関与している間葉転移に対する上皮においてダウンレギュレートされる。進歩にもかかわらず、現在の臨床技術は依然として低い精度、高コスト、複雑さに苦しんでいます。これらの欠点により、卵巣CTCの発見と列挙のための新しい技術は、研究の重要な分野となっています。
近年、PAFCは、がん細胞の非侵襲的検出、ナノ材料の分析、および細菌7、8、9の同定に有効な方法として浮上した。PAFCは、光音響を利用して流れの中の分析物を検出することにより、従来の蛍光フローサイトメトリーとは異なります。光音響効果は、熱弾性膨張を引き起こす材料によってレーザー光が吸収されると生成され、超音波トランスデューサ10、11によって検出できる音響波を生成する。従来のフローサイトメトリー法に対するPAFCの利点は、簡潔さ、臨床設定への翻訳の容易さ、および患者サンプル12、13における前例のない深さでのCTCの検出を含む。最近の研究では、内因性および気球コントラスト14、15を用いた細胞の検出にPAFCシステムを利用している。近赤外線(NIR)は、インドシアニン緑色色素などの光吸収造影剤、および金属NP(例えば、金およびCuS)を光音響イメージング16、17、18と組み合わせて細胞および組織の選択的標識に使用されている。生体組織内のNIR光の浸透深さが改善されたため、吸収剤の光音響検出は臨床応用のためのより大きな深さで行うことができる。クリニックでの使用の可能性が大きいため、標的NIR造影剤とPAFCの組み合わせにより、CTCの検出に大きな関心が生じています。
PAFCとターゲット造影剤を組み合わせることで、CTCの精度向上と標的検出を行う患者サンプルの高スループット分析に対する改善されたアプローチが提供されます。CTCの主要な検出戦略の1つは、目的の細胞上に存在する膜タンパク質の特異的ターゲティングです。卵巣CtCの顕著な特徴の1つは、外膜19に位置する葉酸受容体の過剰発現である。葉酸受容体ターゲティングは、葉酸受容体の発現が高い内因性細胞が一般的に発光しており、血流20への暴露が制限されているため、血液中の卵巣CTCの同定のための理想的な戦略である。硫化銅NP(CuS NPs)は、最近、癌細胞21に発現する葉酸受容体を標的とする能力が認められている。NIRの生体適合性、合成の容易さ、吸収と組み合わせることで、これらのNP造影剤はPAFCを利用した卵巣CtCの検出に理想的なターゲティング戦略を作ります。
本研究では、FA-CuS NPの調製と光音響流れ系における卵巣癌細胞の検出のための使用について説明する。CuSのNPは、特に卵巣CTCを標的とし、1,053 nmレーザーで刺激されたときに光音響信号を放出するために葉酸で修飾されます。この結果は、PAFCシステム内でこれらの光音響造影剤をインキュベートした卵巣癌細胞の検出に成功したことを示している。これらの結果は、1細胞/μLの濃度まで卵巣癌細胞の検出を示し、蛍光顕微鏡検査は、SKOV−3卵巣癌細胞22によるこれらの粒子の取り込みに成功したことを確認する。本研究では、FA-CuSのNS合成、蛍光顕微鏡用試料の調製、光音響流れ系の構築、卵巣癌細胞の光音響検出について詳しく説明する。提示された方法は、FA-CuS NPsを利用した流れの卵巣CTCの正常な同定を示す。

<table><tbody><tr><td>EDTAコーニング</td><td>25-053-CL</td><td></td>0.2およびmicroの<td>0.025%トリプシン</td></tr><tr><td>;m 1,000 mL 真空ろ過ユニット</td><td>VWR</td><td>10040-440</td><td>大量の単次元水のろ過用。</td></tr><tr><td>0.2 &マイクロ;m 滅菌シリンジフィルター</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr><td>3Dプリントタンク</td><td></td><td>カスタムメイド</td><td></td></tr><tr><td>のアクイジションカード</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>PXIe-5170R</td><td>250 MS/s、8チャンネル、14ビット</td></tr><tr><td>アルコノックス</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242985-1.8KG</td><td>ガラス製品の洗浄に使用される洗剤。</td></tr><tr><td>アミコンウルトラ15遠心フィルター</td><td>ミリポア</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>アミコンウルトラ4遠心フィルター</td><td>ミリポア</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>ブライトライン血球計算計</td><td>ハウサーサイエンティフィック</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>銅(II) 塩化物</td><td>アクロス有機206532500</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カップリング対物レンズ</td><td>ソーラブ</td>ス <td>LMH-10x-532</td><td>結合するパルス光を光ファイバーに送ります。</td></tr><tr><td>カップリングステージ</td><td>ニューポート</td><td>F-91-C1-T</td><td>は、パルス光を対物レンズに結合するためのステージです。FP-1AおよびLMH-10x-532</td></tr><tr><td>CPXシリーズデジタル超音波洗浄バス</td><td>Fisherbrand</td><td>Model CPX3800</td><td></td></tr><tr><td>データ収集ソフトウェア</td><td>National Instruments</td><td>NI LabVIEW 2017 (32ビット)LabVIEW</td>を保持し、<td>レーザーパルスとデータ収集を同期します。</td></tr><tr><td>データ処理ソフトウェア</td><td>Mathworks</td><td>Matlab R2016a</td><td>Matlabソフトウェアを使用して作成された再構成とグラフ。</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ファイバーチャック</td><td>ニューポート</td><td>FPH-DJ</td><td>裸のファイバーを保持するために使用されます。</td></tr><tr><td>ファイバーカプラー</td><td>ニューポート</td><td>FP-1A</td><td>3軸ステージで、ファイバーチャックと光ファイバーを対物レンズの焦点に位置決めします。</td></tr><tr><td>葉酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7876-10G</td><td></td></tr><tr><td>Formvar コーティング TEM グリッド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>FCF300-CU-SB</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex チューブ</td><td>コール パーマー</td><td>EW-96420-14</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A 中型</td><td>ATCC</td><td>30-2007</td><td></td></tr><tr><td>Norm-Ject 10 mL シリンジ</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>4100-X00V0</td><td></td></tr><tr><td>光ファイバー</td><td>Thorlabs</td><td>FG550LEC</td><td>サンプルをパルス光にさらすために使用されます。</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62036</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>パルスレーザー</td><td>RPMC Lasers Inc</td><td>Quantus-Q1D-1053</td><td>仕様 1053 nm、8 ns パルス、最大 10 Hz のパルス レーザー光源。</td></tr><tr><td>パルサー/レシーバー</td><td>オリンパス</td><td>5077PR</td><td>光音響信号を受信し、フィルタリングし、増幅します。59dBのゲインで動作。</td></tr><tr><td>クォーツ キャピラリーチューブ</td><td>サッター インストゥルメント</td><td>QF150-75-10</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Midum 1640 (1x) 葉酸フリー</td><td>Gibco</td><td>27016-021</td><td></td></tr><tr><td>Silicone</td><td>Momentive Performance Materials, Inc.</td><td>GE284</td><td></td></tr><tr><td>SKOV-3 セル</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795-500G</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウムビーズ</td><td>BDH</td><td>BDH9292-500G</td><td></td></tr><tr><td>硫化ナトリウム非水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431648-50G</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>New Era Pump Systems Inc</td><td>DUAL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X-Succinimydl エステル</td><td>Invitrogen</td><td>1949071</td><td></td></tr><tr><td>トランスデューサ</td><td>Olynmpus</td><td>V214-BB-RM</td><td>超音波検出器、中心周波数 50 MHz、-6 dB フラクショナル帯域幅 82%。</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液0.4%</td><td>アムレスコ</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン20</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>超音波ゲル</td>パー<td>カー研究所</td><td>トランスデューサーカップリング用の</td><td>Aquasonic 100</td>超音波ゲル</tr></tbody></table>

光音響フローサイトメトリーを用いた卵巣癌検出

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

多くの研究は、循環腫瘍細胞(CtC)の列挙が卵巣癌の予後ツールとしての約束を示すかもしれないことを示唆している。CTCの検出のための現在の戦略は、フローサイトメトリー、マイクロ流体デバイス、およびリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を含みます。最近の進歩にもかかわらず、早期卵巣癌転移の検出方法は、臨床翻訳に必要な感受性および特異性を依然として欠いている。ここでは、フローチャンバーやシリンジポンプを含むカスタム3次元(3D)プリントシステムを利用した光音響フローサイトメトリー(PAFC)による卵巣循環腫瘍細胞の検出に関する新しい方法を提示する。この方法は、PFCによるSKOV-3卵巣癌細胞を標的とする葉酸キャップ硫化銅ナノ粒子(FA-CuS NPs)を利用する。この研究は、卵巣癌細胞に対するこれらの造影剤の親和性を示す。その結果、蛍光顕微鏡によるNP特性評価、PAFC検出、NP取り込みが示され、生理学的に関連する濃度で卵巣CtCを検出するこの新規システムの可能性を実証した。

図1Aは、合成されたナノ粒子の典型的なTEM像を示す。典型的なナノ粒子の平均サイズは約8.6nm±2.5nmである。ナノ粒子測定はImageJで行った。閾値および流域機能は、測定のために粒子を分離するために適用された。各粒子の水平および垂直直径は互いに垂直に測定され、さらに平均した。DLS の場合、代表的な測定値を図 1Bに示します。これらの粒子の平均流体力学的直径は73.6nmである。硫化銅ナノ粒子は、図1Cに示すように、NIRに延びる特性吸光度曲線を有する。分光光度計によるレーザーの切り替えによって引き起こされた850 nmの周りのわずかなアーティファクトがあります。
蛍...

カスタムメイドの光音響流れ系と標的葉酸キャップ銅硫化銅ナノ粒子を利用した循環卵巣腫瘍細胞を検出するプロトコルが提示される。

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

現在の臨床卵巣癌検出措置は、循環腫瘍細胞の非特異的かつケアポイント検出の欠如である。当社の光音響フローシステムは、血流中の特定の卵巣癌マーカーの患者サンプルをテストすることができます。この手順では、シンプルさ、低コスト、検出の有望な限界、および広範なアプリケーションに適用される能力の点で、現在の技術よりも優れた独自のプラットフォーム技術を提供します。この研究を通じて、卵巣癌の標的ナノ粒子システムを構築し、CTCのex vivo患者サンプルをテストすることを目指しています。この非常に汎用性の高いPAFCシステムは、血液中のバイオマーカーの広い範囲の存在をテストし、臨床使用のために拡大することができます。光音響フローサイトメトリーシステム内のターゲットを検出するには、適切な光学アライメントが不可欠です。さらに、適切な音響結合を確保するために、ガラススライドとトランスデューサの間に泡がないことを確認してください。フローシステムとそのコンポーネントのカスタム特性により、この方法の視覚化は正確な再現に役立ちます。換気された化学煙のフードで、無菌0.2マイクロメートルフィルターを通して約300ミリリットルの脱イオン水をフィルター処理する。0.0134グラムの塩化銅と100ミリリットルの脱イオン水をきれいな250ミリリットルの丸底フラスコに加え、1ミリモル塩化銅溶液を作り出します。フラスコに0.015グラムの葉酸を加え、磁気攪拌棒を使用して溶液を約5分間混合します。その後、硫化ナトリウム非水和物の0.024グラムを100マイクロリットルの脱イオン水と混ぜます。200マイクロリットルピペットを使用して、約10秒間にわたって反応混合物にゆっくりとこの溶液を添加します。反応容器をキャップします。容器を90度に設定したオイルバスに入れ、かき混ぜ続けます。約15分後、またはオイルバスが摂氏85度から90度の温度範囲に達した後、反応をさらに1時間進行させます。反応が完了したら、油浴から反応容器を取り出し、室温で10〜15分間冷却してから氷浴に移します。反応が冷却されたら、1モルの水酸化ナトリウムを用いてpHを約10に調整します。混合物を15ミリリットルバッチの30キロダルトン遠心分離カラムに加え、遠心分離機を3,082回gで15分間加え、反応混合物を精製する。まず、新鮮なRPMI培地中の適切な濃度で葉酸キャップされた硫化銅ナノ粒子を混合する。このナノ粒子溶液を、SK-OV-3細胞を含む調製された24ウェルプレートの各ウェルに、1ミリリットル当たり400マイクログラムの濃度で添加します。2時間の間、5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートします。この後、0.25%トリプシンとEDTAの0.5ミリリットルで細胞をトリプシン化する。トリプシンを中和するには、葉酸を含まないRPMI 1640完全な成長培地を少なくとも1ミリリットル加え、123倍gの細胞を6分間遠心分離する。細胞を洗浄するには、上清を取り除き、PBSと遠心分離機の2ミリリットルで細胞を123倍gで6分間再懸濁する。この洗浄手順を2回繰り返して、非結合ナノ粒子を除去します。その後、PBSで2%Tween溶液の1〜2ミリリットルで細胞を再懸濁します。ヘモサイトメーターとトリパンブルーを使用して細胞を数えます。PBSで2%Tweenの溶液中の細胞を、検出のために選択した濃度に希釈します。ABS熱可塑性樹脂またはPLAプラスチックで流れタンクを3Dプリントするには、提供された3次元STLファイルを使用してください。タンクを印刷した後、洗浄し、使用するためにシステムを組み立てます。1ミリメートルのスロットに3ミリメートルのスロットと1センチメートルの穴の上にガラスカバーリップを配置し、慎重に漏れを防ぐためにシリコーンで密封します。次に、キャピラリーチューブをシリコン硬化チューブに収め。ガラスキャピラリーチューブが3ミリメートルスロットと1センチメートルの穴の真上と前になるように、フロータンクの側面を通して流れチャンバーにチューブを挿入します。チューブをシリコーンで密封します。次に、トランスデューサを超音波パルサーと受信機に接続します。59デシベルゲインで信号を増幅します。フィルタの出力を、組み込みのフィールドプログラマブルゲートアレイを備えた多目的再構成可能オシロスコープに接続します。フローチャンバから来るチューブの1つを、各枝の2つのシリンジポンプに接続されたTジャンクションに接続します。シリンジポンプの1つを空気で満たし、もう一方のポンプを分析するサンプルで満たします。空気を含むポンプを毎分40マイクロリットルの流量に設定し、サンプルを含むポンプを毎分20マイクロリットルの流量に設定します。次に、フローシステムから出る残りのチューブを10%漂白剤の容器に接続し、フローシステムを終了した後に細胞を処分します。石英キャピラリーチューブの断面を顕微鏡のフィールドビューのトランスデューサと直接一直線に配置して、サンプルの上に光ファイバーを慎重に配置して、チューブの幅全体を照らします。1,053ナノメートルの波長で動作するダイオードポンプ固体レーザーを光ファイバーで送り出してサンプルを照射します。顕微鏡カメラを使用して、流れ、レーザーの発射、およびフローシステムを通過するサンプルの通過を記録します。本研究では、光音響フローサイトメトリーおよび標的硫化銅ターゲティング剤を用いて、卵巣循環腫瘍細胞を検出する。合成されたナノ粒子の典型的なTEM画像は、典型的なナノ粒子の平均サイズが約8.6ナノメートルであることを示している。各粒子の水平および垂直直径は、互いに垂直に測定され、さらに平均化されます。これらの粒子の平均流体力学的直径は73.6ナノメートルです。硫化銅ナノ粒子は、近赤外線に伸びる特徴的な吸光度曲線を有する。分光光度計によるレーザーの切り替えによって引き起こされる850ナノメートルの周りのわずかなアーティファクトがあります。蛍光タグ付きナノ粒子でインキュベートされた細胞の蛍光顕微鏡画像は、ナノ粒子の取り込みが細胞全体の蛍光の存在によって可視化できることを示している。ナノ粒子でインキュベートされていない細胞は蛍光シグナルを示さない。この蛍光シグナルの存在は、粒子の取り込みの成功と、フローシステムで検出される能力を示しています。一般的なデータ取得信号の例を以下に示します。生データは、ナノ粒子タグ付き細胞、PBS、葉酸キャップ付き硫化銅ナノ粒子間のシグナルの違いを示しています。カスタムラボビューとMATLABソフトウェアを利用して、画像再構築は、それぞれリアルタイムで正と負のコントロールと後の取得で作られています。個々のエンベロープラーは、その後ピクセル値に変換され、独立した列として表示されます。PBSと葉酸キャップ付き硫化銅ナノ粒子との間で光音響信号の明確な違いが発生し、1ミリリットル当たり100マイクログラムの濃度で生じます。この手順の間、光音響フローサイトメトリーシステム内で超音波トランスデューサ、顕微鏡、光ファイバーを適切に整列させることが重要です。正と負のコントロールをテストして、システムのアライメントを確認します。光音響ターゲティング技術の汎用性とPAFCを使用して可能な幅広いアプリケーションにより、この技術は翻訳上重要な臨床および研究アプリケーションへの道を開きます。臨床応用を確実にするために、さらなる研究は患者サンプルの検査および手続きステップの減少に焦点を当てるべきである。ナノ粒子の合成は、適切な保護具を利用して化学発煙フードで行われるべきである。ヒト細胞株は、教育機関のガイドラインに従って処理する必要があります。レーザーの使用は放射線安全訓練および適切なPPEを要求する。レーザーの使用法と光音響試験は、高度な訓練を受けた人員によってのみ行われるべきです。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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In vitro光音響フローサイトメトリー:ナノ粒子を含む循環卵巣癌細胞を検出するための非侵襲的フロー光音響技術

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腹腔内卵巣癌転移の定量

ここでは、材料を推定し、内部全反射と組み合わせて光音響効果を用いた光学特性を表面にプロトコルを提示します。この技術エバネセント場ベースの光音響は材料「厚さを推定するために光音響計測システムを作成するために使用することができ、バルク及び薄膜の屈折率、及びそれらの光学的特性を探ります。...

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卵巣/付属器病変の経膣イメージングのための超音波および光音響イメージングプロトコルの同時登録を報告します。このプロトコルは、他のトランスレーショナル光音響イメージング研究、特に光音響信号の検出に市販の超音波アレイを使用し、イメージングに標準的な遅延和ビームフォーミングアルゴリズムを使用する研究にとって価値がある可能性があります。...

卵巣病変の経膣イメージングのための同時登録された超音波および光音響イメージングプロトコル

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学ぶ光音響フローサイトメトリーによる卵巣がん循環腫瘍細胞検出法。葉酸修飾硫化銅ナノ粒子を用いて特異的マーカーを検出し、低コストで簡便な臨床応用を実現します。

光音響フローサイトメトリーを用いた卵巣癌検出

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