光音響フローサイトメトリーを用いた卵巣癌検出

カスタムメイドの光音響流れ系と標的葉酸キャップ銅硫化銅ナノ粒子を利用した循環卵巣腫瘍細胞を検出するプロトコルが提示される。

現在の臨床卵巣癌検出措置は、循環腫瘍細胞の非特異的かつケアポイント検出の欠如である。当社の光音響フローシステムは、血流中の特定の卵巣癌マーカーの患者サンプルをテストすることができます。この手順では、シンプルさ、低コスト、検出の有望な限界、および広範なアプリケーションに適用される能力の点で、現在の技術よりも優れた独自のプラットフォーム技術を提供します。

この研究を通じて、卵巣癌の標的ナノ粒子システムを構築し、CTCのex vivo患者サンプルをテストすることを目指しています。この非常に汎用性の高いPAFCシステムは、血液中のバイオマーカーの広い範囲の存在をテストし、臨床使用のために拡大することができます。光音響フローサイトメトリーシステム内のターゲットを検出するには、適切な光学アライメントが不可欠です。

さらに、適切な音響結合を確保するために、ガラススライドとトランスデューサの間に泡がないことを確認してください。フローシステムとそのコンポーネントのカスタム特性により、この方法の視覚化は正確な再現に役立ちます。換気された化学煙のフードで、無菌0.2マイクロメートルフィルターを通して約300ミリリットルの脱イオン水をフィルター処理する。

0.0134グラムの塩化銅と100ミリリットルの脱イオン水をきれいな250ミリリットルの丸底フラスコに加え、1ミリモル塩化銅溶液を作り出します。フラスコに0.015グラムの葉酸を加え、磁気攪拌棒を使用して溶液を約5分間混合します。その後、硫化ナトリウム非水和物の0.024グラムを100マイクロリットルの脱イオン水と混ぜます。

200マイクロリットルピペットを使用して、約10秒間にわたって反応混合物にゆっくりとこの溶液を添加します。反応容器をキャップします。容器を90度に設定したオイルバスに入れ、かき混ぜ続けます。

約15分後、またはオイルバスが摂氏85度から90度の温度範囲に達した後、反応をさらに1時間進行させます。反応が完了したら、油浴から反応容器を取り出し、室温で10〜15分間冷却してから氷浴に移します。反応が冷却されたら、1モルの水酸化ナトリウムを用いてpHを約10に調整します。

混合物を15ミリリットルバッチの30キロダルトン遠心分離カラムに加え、遠心分離機を3,082回gで15分間加え、反応混合物を精製する。まず、新鮮なRPMI培地中の適切な濃度で葉酸キャップされた硫化銅ナノ粒子を混合する。このナノ粒子溶液を、SK-OV-3細胞を含む調製された24ウェルプレートの各ウェルに、1ミリリットル当たり400マイクログラムの濃度で添加します。

2時間の間、5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートします。この後、0.25%トリプシンとEDTAの0.5ミリリットルで細胞をトリプシン化する。トリプシンを中和するには、葉酸を含まないRPMI 1640完全な成長培地を少なくとも1ミリリットル加え、123倍gの細胞を6分間遠心分離する。

細胞を洗浄するには、上清を取り除き、PBSと遠心分離機の2ミリリットルで細胞を123倍gで6分間再懸濁する。この洗浄手順を2回繰り返して、非結合ナノ粒子を除去します。その後、PBSで2%Tween溶液の1〜2ミリリットルで細胞を再懸濁します。

ヘモサイトメーターとトリパンブルーを使用して細胞を数えます。PBSで2%Tweenの溶液中の細胞を、検出のために選択した濃度に希釈します。ABS熱可塑性樹脂またはPLAプラスチックで流れタンクを3Dプリントするには、提供された3次元STLファイルを使用してください。

タンクを印刷した後、洗浄し、使用するためにシステムを組み立てます。1ミリメートルのスロットに3ミリメートルのスロットと1センチメートルの穴の上にガラスカバーリップを配置し、慎重に漏れを防ぐためにシリコーンで密封します。次に、キャピラリーチューブをシリコン硬化チューブに収め。

ガラスキャピラリーチューブが3ミリメートルスロットと1センチメートルの穴の真上と前になるように、フロータンクの側面を通して流れチャンバーにチューブを挿入します。チューブをシリコーンで密封します。次に、トランスデューサを超音波パルサーと受信機に接続します。

59デシベルゲインで信号を増幅します。フィルタの出力を、組み込みのフィールドプログラマブルゲートアレイを備えた多目的再構成可能オシロスコープに接続します。フローチャンバから来るチューブの1つを、各枝の2つのシリンジポンプに接続されたTジャンクションに接続します。

シリンジポンプの1つを空気で満たし、もう一方のポンプを分析するサンプルで満たします。空気を含むポンプを毎分40マイクロリットルの流量に設定し、サンプルを含むポンプを毎分20マイクロリットルの流量に設定します。次に、フローシステムから出る残りのチューブを10%漂白剤の容器に接続し、フローシステムを終了した後に細胞を処分します。

石英キャピラリーチューブの断面を顕微鏡のフィールドビューのトランスデューサと直接一直線に配置して、サンプルの上に光ファイバーを慎重に配置して、チューブの幅全体を照らします。1,053ナノメートルの波長で動作するダイオードポンプ固体レーザーを光ファイバーで送り出してサンプルを照射します。顕微鏡カメラを使用して、流れ、レーザーの発射、およびフローシステムを通過するサンプルの通過を記録します。

本研究では、光音響フローサイトメトリーおよび標的硫化銅ターゲティング剤を用いて、卵巣循環腫瘍細胞を検出する。合成されたナノ粒子の典型的なTEM画像は、典型的なナノ粒子の平均サイズが約8.6ナノメートルであることを示している。各粒子の水平および垂直直径は、互いに垂直に測定され、さらに平均化されます。

これらの粒子の平均流体力学的直径は73.6ナノメートルです。硫化銅ナノ粒子は、近赤外線に伸びる特徴的な吸光度曲線を有する。分光光度計によるレーザーの切り替えによって引き起こされる850ナノメートルの周りのわずかなアーティファクトがあります。

蛍光タグ付きナノ粒子でインキュベートされた細胞の蛍光顕微鏡画像は、ナノ粒子の取り込みが細胞全体の蛍光の存在によって可視化できることを示している。ナノ粒子でインキュベートされていない細胞は蛍光シグナルを示さない。この蛍光シグナルの存在は、粒子の取り込みの成功と、フローシステムで検出される能力を示しています。

一般的なデータ取得信号の例を以下に示します。生データは、ナノ粒子タグ付き細胞、PBS、葉酸キャップ付き硫化銅ナノ粒子間のシグナルの違いを示しています。カスタムラボビューとMATLABソフトウェアを利用して、画像再構築は、それぞれリアルタイムで正と負のコントロールと後の取得で作られています。

個々のエンベロープラーは、その後ピクセル値に変換され、独立した列として表示されます。PBSと葉酸キャップ付き硫化銅ナノ粒子との間で光音響信号の明確な違いが発生し、1ミリリットル当たり100マイクログラムの濃度で生じます。この手順の間、光音響フローサイトメトリーシステム内で超音波トランスデューサ、顕微鏡、光ファイバーを適切に整列させることが重要です。

正と負のコントロールをテストして、システムのアライメントを確認します。光音響ターゲティング技術の汎用性とPAFCを使用して可能な幅広いアプリケーションにより、この技術は翻訳上重要な臨床および研究アプリケーションへの道を開きます。臨床応用を確実にするために、さらなる研究は患者サンプルの検査および手続きステップの減少に焦点を当てるべきである。

ナノ粒子の合成は、適切な保護具を利用して化学発煙フードで行われるべきである。ヒト細胞株は、教育機関のガイドラインに従って処理する必要があります。レーザーの使用は放射線安全訓練および適切なPPEを要求する。

レーザーの使用法と光音響試験は、高度な訓練を受けた人員によってのみ行われるべきです。