Name: マウス腱の生体力学的試験 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 学ぶマウス腱の生体力学的試験法。3Dプリント製カスタムフィクスチャを用いて、従来のグリップアーティファクトを排除し、試験時間を数時間から数分に短縮します。様々な腱タイプへの応用が可能で、再生性と効率性を向上させます。

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研究はNIH/NIAMS(R01 AR055580、R01 AR057836)によって支持された。

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<li>Sikes, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+of+hyaluronan+synthase+1%2C+but+not+3%2C+impairs+formation+of+the+retrocalcaneal+bursa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Knockout of hyaluronan synthase 1, but not 3, impairs formation of the retrocalcaneal bursa.</a> Journal of Orthopaedic Research. 36, 2622-2632 (2018).</li>
<li>Wang, V. M., Banack, T. M., Tsai, C. W., Flatow, E. L., Jepsen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+in+tendon+and+knee+joint+biomechanics+among+inbred+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Variability in tendon and knee joint biomechanics among inbred mouse strains.</a> Journal of Orthopaedic Research. 24, 1200-1207 (2006).</li>
<li>Wang, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+tendon+function+is+adversely+affected+by+aggrecan+accumulation+due+to+the+knockout+of+ADAMTS5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Murine tendon function is adversely affected by aggrecan accumulation due to the knockout of ADAMTS5.</a> Journal of Orthopaedic Research. 30, 620-626 (2011).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tendon+mineralization+is+progressive+and+associated+with+deterioration+of+tendon+biomechanical+properties%2C+and+requires+BMP-Smad+signaling+in+the+mouse+Achilles+tendon+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Tendon mineralization is progressive and associated with deterioration of tendon biomechanical properties, and requires BMP-Smad signaling in the mouse Achilles tendon injury model.</a> Matrix Biology. 52-54, 315-324 (2016).</li>
<li>Rooney, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibuprofen+differentially+affects+supraspinatus+muscle+and+tendon+adaptations+to+exercise+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ibuprofen differentially affects supraspinatus muscle and tendon adaptations to exercise in a rat model.</a> American Journal of Sports Medicine. 44, 2237-2245 (2016).</li>
<li>Galasso, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+of+Life+and+Functional+Results+of+Arthroscopic+Partial+Repair+of+Irreparable+Rotator+Cuff+Tears%5BTitle%5D)+AND+%22Arthroscopy+-+Journal+of+Arthroscopic+and+Related+Surgery%22%5BJournal%5D)">Quality of Life and Functional Results of Arthroscopic Partial Repair of Irreparable Rotator Cuff Tears.</a> Arthroscopy - Journal of Arthroscopic and Related Surgery. 33, 261-268 (2017).</li>
<li>Sarver, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+tendon+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Sex differences in tendon structure and function.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35, 2117-2126 (2017).</li>
<li>Razmjou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disability+and+satisfaction+after+Rotator+Cuff+decompression+or+repair%3A+A+sex+and+gender+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Musculoskeletal+Disorders%22%5BJournal%5D)">Disability and satisfaction after Rotator Cuff decompression or repair: A sex and gender analysis.</a> BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 66(2011).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

マウス動物モデルは、腱障害を研究するために一般的に使用されますが、その機械的特性の特徴付けは困難であり、文献では珍しいです。このプロトコルの目的は、マウス腱の引張試験のための時間効率が良く、再現可能な方法を記述することです。新しい方法では、サンプルのテストに必要な時間が数時間から数分に短縮され、以前の方法で一般的な問題であった主要なグリップアーティファクトが排除されました。
このプロトコルに記載されているいくつかのステップは、機械的にマウス上脊椎間およびアキレス腱をテストする効果的な器具を生成するために重要です。まず、ステップ 1.1.4 は、目的のボーンの 3D モデルを作成するために必要です。ただし、このスキャンに通常使用される解像度が高いため、ファイル サイズが大きすぎて、ソリッド モデリング プログラムでは使用できない場合があります。このプロトコルで使用されるソフトウェアは、ファイルのサイズ(ステップ1.1.6)と保存されたオブジェクトジオメトリを正常に縮小しましたが、他のソフトウェアもこれを達成するために有効である可能性があります。第二に、各解剖学的部位は、効果的なグリッ...

腱障害は、老化、運動、および活性集団1、2、3の間で一般的で非常に一般的である。米国では、毎年1,640万人の結合組織損傷が報告され、すべての傷害関連の医師のオフィス訪問の3、5、6、7の30%を占めています。 8.最も一般的に影響を受ける部位には、回転子カフ、アキレス腱、膝蓋腱9が含まれる。抗炎症薬、リハビリテーション、外科的修復など、様々な非手術・手術治療が検討されているが、結果は依然として乏しく、機能への回帰が限られ、故障率が高い5 6.これらの貧弱な臨床結果は、腱症を理解し、新しい治療アプローチを開発しようとする基礎的および翻訳的研究を動機づけています。
引張生体力学的特性は、腱機能を定義する主要な定量的結果である。したがって、腱症および治療有効性の実験室的特徴付けは、腱引張特性の厳密な試験を含む必要があります。ラット、ヒツジ、イヌ、ウサギ10、11、12などの動物モデルから腱の生体力学的特性を決定する方法を数多くの研究が記載されている。しかし、主に引張試験のために小さな組織をつかむのが難しいため、マウス腱の生体力学的特性をテストした研究はほとんどありません。マウスモデルは、遺伝子操作、広範な試薬の選択肢、低コストなど、機械的に腱症を研究するための多くの利点を有するので、マウス組織を生体的にテストする正確で効率的な方法の開発が必要とされています。
腱の機械的特性を適切にテストするためには、組織を効果的につかむ必要があり、グリップ界面で滑ったり、実際に引き裂いたり、成長板を破砕したりする必要があります。多くの場合、特に短い腱の場合、骨は一方の端でつかまれ、腱はもう一方の端でつかまれる。骨は、典型的には、エポキシ樹脂13およびポリメチルメタクリレート14、15などの材料にそれらを埋め込むことによって確保される。腱は、多くの場合、サンドペーパーの2つの層の間に配置され、シアノクリレートで接着され、圧縮クランプ(断面が平らな場合)または凍結媒体(断面が大きい場合)15、16、17を使用して固定されています。.これらの方法は、生体力学的にマウス腱をテストするために適用されているが、試料のサイズが小さく、成長プレートのコンプライアンスが原因で問題が生じ、18を振動させない。例えば、マウスの頭の直径はわずか数ミリメートルで、骨のつかみにくくなります。具体的には、マウス上頭腱から骨までのサンプルの引張試験は、腱や腱のエンテシスではなく成長板で失敗することがよくあります。同様に、アキレス腱の生体力学的試験は困難である。アキレス腱は他のマウス腱よりも大きいが、カルカヌエウスは小さく、この骨のつかみ取りが困難である。骨を取り除き、その後に2つの腱の端をつかみます。しかし、これは腱と骨の付着のテストを妨げる。他のグループは、カスタムメイドの器具19、20、クランプ21による固定、自己硬化プラスチックセメント22で固定または円錐形スロット22を使用して、カルカインの骨をつかむ報告します。以前の方法は、再現性が低く、高いグリップ故障率、および退屈な準備要件によって制限されたままです。
今回の研究の目的は、マウス腱の引張生体力学的検査のための正確かつ効率的な方法を開発し、例として上脊椎およびアキレス腱に焦点を当てた。ネイティブ骨解剖学、固体モデリング、添加物製造からの3D再構成を組み合わせて、骨をつかむ新しい方法を開発しました。これらの器具は骨を効果的に確保し、成長板の故障を防ぎ、検体の調製時間を減らし、テストの再現性を高めた。この新しい方法は、ラットや他の動物の腱と同様に、他のマウス腱をテストするために容易に適応可能である。

<table><tbody><tr><td>アガロー</td>ス<td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP160-100</td>超<td>純水100mlで1gを分解し、1%アガロースを作ります&nbsp;</td></tr><tr><td>ブルカーマイクロCT&nbsp;</td><td>ブルカーBioSpin Corp</td><td>Skyscan 1272&nbsp;</td><td>著者が使用</td></tr><tr><td>エレクトロフォース&nbsp;</td><td>TAインスツルメンツ</td><td>3200</td><td>試験プラットフォーム</td></tr><tr><td>エタノール 200 プルーフ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A4094</td><td>70%に希釈し、プロトコルで提案されているように使用</td></tr><tr><td>グリップを取り付けるための固定具</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>著者が使用</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>&nbsp;S-8115</td><td>プロトコルで提案されているように</td></tr>、<tr><td>MicroCT CTアナライザー(Ctan)</td><td>Bruker BioSpin Corp</td><td></td> 著者<td>がマイクロCTスキャンの視覚化と分析に使用&nbsp;</td></tr><tr><td>ミリQウォーター(超純水)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>QGARD00R1(または関連清浄機)</td><td>100ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Meshmixer</td><td>Autodesk</td><td>http://www.meshmixer.com/</td> <td>著者がメッシュを洗練するために使用する無料のエンジニアリングソフトウェア</td></tr><tr><td>Objet EDEN 260VS&nbsp;</td><td>Stratasys LTD</td><td></td><td>Precision Prototyping</td></tr><tr><td>Objet Studio</td><td>Stratasys LTD</td><td></td><td>著者が3DプリンターPBSを使用して使用</td></tr><tr><td>- リン酸緩衝生理食塩水</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010031</td><td>2.5 L of 10% PBS&nbsp;</td></tr><tr><td>S&T 鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>00108-11</td><td>著者が使用</td></tr><tr><td>メス ブレード - #11</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>10011-00</td><td>著者が使用</td></tr><tr><td>メス ハンドル - #3</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>10003-12</td><td>著者が使用</td></tr><tr><td>SkyScan 1272</td><td>Bruker BioSpin Corp</td><td></td><td>著者がマイクロ CT スキャンの視覚化と分析に使用&nbsp;</td></tr><tr><td>Skyscan CT-Vox</td><td>Bruker BioSpin Corp</td><td></td><td>著者がマイクロCTスキャンの視覚化と分析に使用&nbsp;</td></tr><tr><td>SkyScan NRecon</td><td>Bruker BioSpin Corp</td><td></td><td>著者がマイクロCTスキャンの視覚化と分析に使用&nbsp;</td></tr><tr><td>SolidWorksのCAD</td><td>のダッソーシステム&egrave;mes</td><td>SolidWorksの研究Subsription</td>固体<td>モデリングコンピュータ支援設計著者が使用する</td></tr><tr><td>SuperGlue</td><td>Loctite</td><td>234790</td>プロトコル<td>で提案されているように</td></tr><tr><td>、テストバス</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>著者が使用する</td></tr><tr><td>薄膜グリップ&nbsp;</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>著者が使用</td></tr><tr><td>VeroWhitePlus</td><td>Stratasys LTD</td><td>NA</td><td>著者が使用した3Dプリント材料</td></tr><tr><td>WinTest&nbsp;</td><td>WinTest ソフトウェア</td><td></td><td>作成者がデータを収集するために使用</td></tr></tbody></table>

マウス腱の生体力学的試験

Biomechanical Testing of Murine Tendons

腱障害は一般的であり、すべての年齢の人々に影響を与え、しばしば衰弱している。抗炎症薬、リハビリテーション、外科的修復などの標準的な治療法は、しばしば失敗します。腱機能を定義し、新しい治療法の有効性を実証するためには、動物モデルからの腱の機械的特性を正確に決定する必要があります。マウス動物モデルは現在、腱障害を研究し、腱症の新しい治療法を評価するために広く使用されています。しかし、マウス腱の機械的特性を決定することは困難でした。本研究では、それぞれ上頭症腱とアキレス腱を機械的にテストするために、ヒューマラスとカルカヌスの解剖学に正確に一致する3Dプリント器具を含む腱機械試験用に新しいシステムが開発された。これらの器具は、ネイティブ骨解剖学、固体モデリング、および添加剤製造の3D再構成を使用して開発されました。この新しいアプローチにより、実際のグリップの失敗(腱ではなく成長プレートの故障など)が排除され、全体的な試験時間が減少し、再現性が向上しました。さらに、この新しい方法は、他の動物からの他のマウス腱や腱のテストに容易に適応可能である。

3Dプリントされた器具は、8週齢のマウス上脊椎間およびアキレス腱をテストするために使用された。すべての機械的にテストされたサンプルは、引張試験後のマイクロCTスキャン、目視検査、およびビデオ分析によって特徴づけられるように、封入で失敗しました。本研究室における上脊椎腱試験の前の方法と現在の方法の1対1の比較を図3に示す。前の方法28,29,30では、ヒューマラス骨をエポキシに埋め込み、成長板の骨折を防ぐためにヒューマラスヘッドの上にペーパークリップを置いた。エポキシが完全に治癒するために4-6時間が必要でした(図3)、典型的な日に6~8個の検体のみを試験することができます。アプローチのさらなる制限は、成長板の破壊を防ぐためのペーパークリップ配置のユーザ依存的な有効性であった。これらの以前の方法を用いた試験結果は非常に可変であり、ほとん...

このプロトコルは、カスタムフィット3Dプリント器具の使用を通じて、マウス腱の効率的で再現性の高い引張生体力学的試験方法について説明します。

Tendon disorders are common, affect people of all ages, and are often debilitating. Standard treatments, such as anti-inflammatory drugs, rehabilitation, ...

このプロトコルは、再利用可能なカスタムフィット3Dプリントフィクスチャを通じて、マウス腱の生体力学的検査のための効率的で再現可能な方法を記述しています。新しい方法では、サンプルのテストに必要な時間を時間から分に短縮し、以前のメソッドで一般的な問題であった主要なグリップアーティファクトを排除します。この方法は、上スピナトゥス腱およびアキレス腱に限定されない。それはより大きい動物からの他のマウス腱および腱をテストするために容易に合わせることができる。このアプローチの再現性と効率を確保するために、ここで説明されていないフィクスチャに対して、設計のプロトタイプ作成と検証の複数のサイクルが必要になる場合があります。まず、アガロースゲル中の骨全体のマイクロコンピュータ断層撮影を行う。断面イメージへの再構築後に、[ファイルを開く] コマンドを選択してファイル データセットを開きます。ダイアログファイルの環境設定を開き、[詳細設定]タブを選択します。アダプティブ レンダリング アルゴリズムを使用して、サーフェスの詳細を滑らかにする 3D モデルを構築します。オブジェクトの境界線を見つけるために使用される隣接点までの距離をピクセル単位で定義する、地域性パラメータとして 10 を使用します。許容値を 0.1 に最小化して、ファイル サイズを小さくします。対象のボリュームを指定するには、選択した VOI 範囲の上部と下部に設定する 2 つのイメージを手動で選択し、2 番目のページの [対象地域] に移動します。単一の断面イメージ上の対象領域を手動で選択します。10 ~15 枚の断面画像ごとに ROI を繰り返します。次に、3 番目のページである [バイナリ選択] に移動します。[ヒストグラム] メニューの [データセットから] をクリックして、データセットのすべての画像から明るさのヒストグラム分布を表示します。また、[ヒストグラム] メニューの [3D モデル ファイルの作成] メニューをクリックします。ボーンの 3D モデルを STL ファイル形式で保存します。Meshmixer ソフトウェアでメッシュをインポートして[すべて]を選択して編集します。トリカウントを減らし、変更を受け入れます。STL形式で新しく縮小されたファイルを保存し直すAs.To上副脊髄腱骨を設計するを選択し、固体モデリングコンピュータ支援設計プログラムを使用して上腕骨をつかむフィクスチャのカスタムフィットモデルを作成します。ソリッドモデリングプログラムで上腕骨のSTLフォーマットファイルを開き、SLDPRT形式でパーツファイルとして保存します。次に、Part ファイルを開き、サジタル、コロナ、横など、3 つの解剖学的に関連する平面を手動で作成します。[ファイル新規作成]をクリックして、ソリッド ブロック コンポーネント パーツを作成します。[ファイル新規作成]をクリックすると、ソリッド ブロックと右または左の上腕骨の 2 つの構成部品を含むアセンブリ モデルが作成されます。ブロック内のボーンの方向を定義して、腱とボーンの間の角度を 180 度にします。ボーンボリューム全体がブロック内に収まることを確認します。[アセンブリ]ウィンドウでブロックを選択し、[アセンブリ]ツールバーの[コンポーネントを編集]をクリックします。挿入、フィーチャー、キャビティをクリックします。[均等スケーリング]を選択し、すべての方向にスケーリングする値として0%を入力します。ボーン部品を省略し、アセンブリを部品として保存します。キャビティパーツで円柱を開きます。スケッチを作成し、上腕頭の上に0.5ミリメートルだけ残すことを確認してください。[フィーチャ]から、[押し出し切り]を選択します。矢状平面に沿ってアセンブリを切断し、骨を前部および後部に収める2つの対称的なコンポーネントを作成します。矢状平面に沿ってアセンブリ部品をカットして、骨を前部および後方にフィットする 2 つの対称的なコンポーネントを作成します。成長プレートの故障を防ぐために上腕頭を確保し、テスト中に上腕骨がモデルから外れないようにする密閉的なクリアランスを定義することが重要です。原稿に記載されているとおりに進み、後部成分と前部成分を仕上げ。両方のコンポーネントを個別の部品ファイルとして保存します。今度は、[パターンを挿入]、[ミラー]を押して[ミラー]を選択し、反対側の四肢のフィクスチャの各コンポーネントに対して 3D ミラー モデルを作成します。正面を鏡面平野として選択します。ミラーするボディとしてパーツを選択します。ミラー平面を選択し、すべての材料を含むスケッチを作成します。フィーチャーから、元の部品を除去し、ミラー化された部品のみを保持するには、[押し出し切り]を選択します。部品の下部をクリックし、スケッチを作成する平面として使用します。[スケッチ文字]をクリックして L または R を追加します。3D プリントの準備として、すべてのフィクスチャパーツを STL 標準ファイル形式で保存します。上腕脊髄性筋腱、上腕骨の骨標本を解剖するために、最初に安楽死させたマウスを起こしやすい位置に位置し、前足の肘の上から肩に向かって皮膚の切開を行う。肩の筋肉が見えるように、鈍い解剖で慎重に皮膚を除去するために鉗子を使用してください。骨が露出するまで上腕骨を取り巻く組織を取り除きます。鉗子で上腕骨を保持し、慎重にコラ血科のアーチを露出するために三角筋とトラペジウス筋肉を除去します。ACジョイントを識別し、慎重にメスのブレードでアクロミオンから鎖骨を分離します。上頭蓋腱とその骨の付着を損傷しないように注意して、メスの刃を使用して肩甲骨付着から筋肉を取り除きます。グレノイドから上腕頭を取り外し、関節カプセルと眼圧下垂体と短靭腱を裂きます。肘関節を非連結して、上腕骨と尺骨と半径を分離する。上腕上腕脊髄性腱筋標本を分離し、上腕骨および上腕骨の頭部の余分な軟部組織をきれいにする。アキレス腱を解剖するために、踵骨を、安楽死させたマウスを起こしやすい位置に位置する。アキレス腱とその骨の付着を損傷しないように注意して、足首と膝関節の周りの筋肉が露出するように鈍い解剖で皮膚を取り除きます。メスの刃を使用して、アキレス腱-カルカニュースの付着から始めて、慎重にその近位の付着から胃頭筋を取り外します。様々な隣接する骨から慎重にカルカニューを除去し、アキレス腱-カルカニューサンプルを分離し、余分な軟組織をきれいにします。腱の断面積を決定するには、骨を逆さまに挿入して、アガロースゲルの骨と腱と筋肉を外側に含むアガロースゲルで満たされたクライオチューブに標本を吊り下げる。マイクロコンピュータ断層撮影を使用してスキャンした後、メスの刃を使用して腱から筋肉を静かに取り除きます。3D プリントされたフィクスチャにボーンを挿入し、テスト グリッドにアタッチします。折りたたまれた薄いティッシュペーパーの間に腱を挿入して接着し、薄膜グリップを使用して締め付けます。サンプルとグリップを37°CのPBSの試験浴場に挿入し、機械的なテストを行います。本研究では、再利用可能な3Dプリントされたフィクスチャを使用して骨を握り、検体の調製時間を数時間から数分に短縮した。現在の方法を用いた上垂脊髄腱の引張試験のための代表的な負荷変形曲線は、成長板の故障などの主要な把持アーティファクトを排除した。上スピナトゥス腱とアキレス腱の機械的特性は、P値が0.05未満の非対Tテストに基づいてセックスの有意な効果を示す。マイクロCTは、アキレス腱の長さに沿った上脊髄腱の長さに沿った断面積の測定に成功した。各解剖学的部位には、効果的なグリップに必要な特定の設計基準があることを覚えておくことが重要です。したがって、各器具の設計は、それに応じて適合する必要があります。故障までの引張試験に加えて、腱疲労および粘性特性に関する情報を提供する周期的な負荷試験に使用することができる。マウス腱の機械的特性を特徴付けるのは、これらの小さな組織をつかむのが難しいこと、退屈で時間のかかる標本調製方法、および成長プレート骨折を含む多くの理由から、文献では珍しい。このプロトコルは、実際のグリップの失敗を排除し、1日にテストできる標本の数を3倍にしたマウス腱をテストするための時間効率と再現性の高い方法を提示します。

Research

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Bioengineering

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マウス腱の生体力学的試験

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