Name: ショウジョウバエニューロンの開発における高速樹状分岐ダイナミクスのタイムラプスライブイメージングと定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学ぶショウジョウバエ幼虫脳の樹状分岐ダイナミクス定量化法。タイムラプス3Dイメージングと画像解析ソフトウェアを用いて、発達ニューロンの樹状突起フィロポディア動態をリアルタイムで追跡・測定する技術です。

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この研究は、国立神経障害・脳卒中研究所の内壁研究プログラム(国立衛生研究所)によって支援されています。プロジェクト番号 1ZIANS003137.

注意:このプロトコルは、クラスIVレーザーの使用を含み、従うべき適切な訓練と安全ガイドラインを必要とします。直接的または散乱したレーザー光への眼や皮膚への露出を避けてください。 注:プロトコルには 6 つの手順が含まれています。ワークフローを図 1Aに示します。
1. フリップアウト技術を用いて個々のニューロンを標識する
注:LNvsの単一ラベリングは、フリップパーゼ媒介確率ラベリングを使用して単一LNvsでmCD8::GFPを表現することによって達成される。フライラインの遺伝子型は次のとおりです。 Pdf-Gal4;UAS-FRT-CD2ストップ-FRT-mCD8::GFP11、12、13.単一の標識LNvを得る頻度は約10%である。フライストックは、概日および湿度制御された25°Cインキュベーターの標準媒体で維持されます。
<ol><li>酵母サプリメントとブドウジュースプレート上の2時間の窓ポスト受精内に100-200卵を収集します。胚を25°Cで24時間インキュベートし、次のステップのために新たに孵化した最初の幼虫を採取する。</li>
	<li>ヒートショックは、新たに孵化した最初の幼虫を37.5°Cで40分間2回、その間に40分の回復期間を持つ。</li>
	<li>幼虫を25°Cで培養し、概日および湿度制御を所望の発達段階に制御する。</li>
</ol>2. 幼虫脳移植の解剖と取り付け
<ol><li>生理的外食生食液(120mM NaCl、4 mM MgCl2、3mM KCl、10mM NaHCO 3、10mMスクロース、5mM TES、10mM HEPES、2 mM Ca 2+、PH 7.2)を解剖下で解剖する(4mM Ca2+、PH7.2)#5の標準的な先端の解剖の鉗子(11 cm)の2つのペアが付いている力)。一対の鉗子を使って幼虫の体を所定の位置に保持し、もう一方を脳を慎重に解剖する。眼球、脳葉、心室神経コードを保存します。取り付けられた筋肉を取り除き、イメージング中のサンプルの動きを最小限に抑えます。</li>
	<li>ガラススライド(25 x 75 x 1.0 mm3)を準備し、真空グリースで正方形のチャンバーを描画するために注射器を使用します。</li>
	<li>グリースバリア付きの正方形チャンバーに20μLの外部生理塩分溶液を追加します。</li>
	<li>解剖された幼虫の脳を鉗子を使用してガラススライドの部屋に移す。解剖スコープの下で脳の位置を調整し、後部側が上を向いていることを確認します。</li>
	<li>ガラスカバースリップ(22 x 22 x 0.15 mm 3)でチャンバをカバーします。幼虫の脳は、外部生理食液で満たされたチャンバー内のスライドに取り付けられるようになりました(図1B)。 注:カバースリップを軽く押すと脳が閉じ込められ、その後のイメージングセッションでサンプルの漂流が減少します。</li>
</ol>3. タイムラプスライブイメージング
注:マルチフォトンレーザーを搭載した共焦点顕微鏡を用いたタイムラプスイメージング実験を行います。取得パラメータは、他のイメージング設定用に調整する必要があります。
<ol><li>40X水浸漬目的(NA1.3)とエピ蛍光光光源を用いて、個別に標識されたニューロンを含む脳の移植を同定する。画像収集には、920 nm にチューニングされた 2 光子レーザーと、非デスキャン (NDD) 検出器を使用します。</li>
	<li>10分間で512 x 512ピクセル、Zスタックあたり1分で画像を収集し、10分間の光学ズームとデジタルズームを調整し、十分なx-y-z解像度を達成しながら、1分以内に樹樹木アーバー全体のカバレッジを確保します(図2、補足ビデオ)1)設定は、0.11 x 0.11 x 0.25 μm3の一般的な x-y-z 解像度の画像を生成します。</li>
	<li>脳解剖の30分以内にタイムラプス画像シリーズを収集します。過度のドリフトまたは明らかな形態的劣化を伴うデータは、後処理および定量から除外する必要があります。</li>
</ol>4. ドリフト補正とデコンボリューション
注:画質に応じて、どちらの手順もオプションですが、強くお勧めします。
<ol><li>取得したイメージ ファイルをドリフト補正ソフトウェアで開きます。実験に使用したパラメータと一致するように顕微鏡パラメータを編集します。ソフトウェアについては(「材料の表」を参照)、[編集] |顕微鏡パラメータを編集します。2 フォトン オプションがない場合は、顕微鏡タイプを 2 フォトン 画像のワイドフィールドとして設定し、ソフトウェアで定義されたワークフローに従います。たとえば、タブのデコンボリューションを開く |オブジェクトスタビライザーを選択し、時間枠を安定化します。</li>
	<li>デコンボリューション ソフトウェアでドリフト補正画像を開き、そのワークフローに従います。ソフトウェア(「材料の表」を参照)では、安定した画像を選択し、[デコンボリューション]をクリックします。デコンボリューションエクスプレス.より良い結果を得るには、デコンボリューション ウィザードを使用してパラメータを微調整します。</li>
	<li>デコンボルブされたイメージは、4D データを分析し、イメージ内の定義済みスポットの空間座標を報告できる後続のイメージ アテーション ソフトウェアでサポートされているファイルタイプに保存します (材料の表を参照)。</li>
</ol>5. 画像アニテーション
<ol><li>イメージ アニテーション ソフトウェアでデコンボルブされたイメージを開きます。3D のすべての時点で分岐のヒントを調べてマークします。イメージ アテーション ソフトウェアは、マークされた分岐のヒントの空間座標と時間座標をレポートして格納します。後続の計算のために座標情報を .csv ファイルとしてエクスポートします。 注:次の 2 つの手順は、使用した注釈ソフトウェアに固有です (材料の表を参照)。ワークフローは、他のソフトウェアとは異なる場合があります。</li>
	<li>[スポット] モジュールで、[自動作成をスキップし、手動で編集する] をクリックし、下部の [選択したスポットに自動接続する] チェックボックスをオンにします (図 3A)。時系列のフレームを移動し、アテーション用の分岐を選択します。Shift キーを押したまま、分岐端子の先端をクリックしてスポットを追加します。すべての時間ポイントをクリックします。 注:画像アタテーションソフトウェアは、フレーム間のスポットを接続し、自動的に軌道を生成します。分岐のヒントの空間情報と時間情報が、マークされたスポットに関連付けられつになりました。すべての分岐チップにアヌ記が表示されるまで、これらの手順を繰り返します (図 3B)。</li>
	<li>[スポット] モジュールで [統計]タブをクリックし、[詳細]を選択し、[特定の値]を選択します |位置:記録された空間座標と時間座標情報が表示されます。下部の保存をクリックして、その情報を .csv ファイルとしてエクスポートします (図 3C)。</li>
</ol>6. 樹状分岐ダイナミクスの計算
注:座標情報を使用して、3D での分岐先端の変位を簡単に計算できます。我々の研究では、すべての樹状枝の動きは延長または引き込みとして分類される。次の手順では、カスタム記述された R スクリプト (補足ファイル)を使用して .csv ファイルを処理する方法と、手動編集を通じて方向情報を追加する方法について説明します。
<ol><li>.csv ファイルをスプレッドシートとして開きます。[トラック ID]列を選択し、[最小から最大に並べ替え]オプションをクリックし、選択範囲の展開を受け入れます。並べ替え後、トラック ID は各固有の樹状ブランチを識別し、同じブランチのスポットが同じトラック ID を共有します。Time列には、異なる時間枠の情報が格納されます。</li>
	<li>スプレッドシートで、[距離]列を追加します。座標を使用して 2 つの時間的に隣接するスポットの距離を計算し、[距離]列に値を配置します (図 4A)。</li>
	<li>単一のボクセルレベルでのマイナーな動き。イメージング設定に基づいて、0.3 μmは通常、未修正のドリフトまたは不完全な画像アノーテーションからのアーティファクトです。0.3 μm から 0 より小さいすべての距離値をリセットして、これらの動きをフィルタリングします。複数の .csv ファイルを手動で処理するか、R スクリプトバッチ列フィルタリングを使用します。R (補足ファイル)。</li>
	<li>スプレッドシートにディスプレイスメントという名前の新しい列を手動で生成します。[距離]列から[移動]列に値をコピーします。各分岐チップの拡張イベントと取り消しイベントを手動で割り当てます。拡張子の場合は、[変位]の値は変更しないままにします。取り消しの場合は、対応する変位値を負の値に変更します (例: 0.35 から -0.35) (図 4B)。</li>
	<li>Eventという名前の新しい列を生成します。この列では、個々の拡張イベントとリトラクション イベントの変位値を手動で合計します (図 4B)。</li>
	<li>変更されたスプレッドシートを処理し、R スクリプト バッチ列合計を使用して、その変位値に基づいて拡張イベントとリトラクション イベントを定量化します。R (補足ファイル)。出力パラメータには、拡張イベントの数、リトラクション イベントの数、累積長伸長、累積長引き込み、正味長の変更、および移動時間の合計が含まれます。.</li>
</ol>

<ol><li>Wong, W. T., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+specificity+of+neurotransmitter+regulation+of+rapid+dendritic+remodeling+during+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis.</a> Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).</li>
<li>Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Dynamics+In+Vivo+Change+during+Neuronal+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).</li>
<li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+out%3A+mechanisms+of+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 316(2010).</li>
<li>Cline, H., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+dendritic+arbor+development+and+plasticity+by+glutamatergic+synaptic+input%3A+a+review+of+the+synaptotrophic+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis.</a> The Journal of Physiology. 586 (6), 1509-1517 (2008).</li>
<li>Helfrich-Forster, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+morphology+of+the+clock-gene-expressing+lateral+neurons+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Development and morphology of the clock-gene-expressing lateral neurons of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Comparative Neurology. 500 (1), 47-70 (2007).</li>
<li>Sprecher, S. G., Cardona, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+larval+visual+system%3A+High-resolution+analysis+of+a+simple+visual+neuropil%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila larval visual system: High-resolution analysis of a simple visual neuropil.</a> Developmental Biology. 358 (1), 33-43 (2011).</li>
<li>Yuan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Induced+Structural+and+Functional+Plasticity+in+Drosophila+Larval+Visual+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Light-Induced Structural and Functional Plasticity in Drosophila Larval Visual System.</a> Science. 333 (6048), 1458-1462 (2011).</li>
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<li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the drosophila genome.</a> Cell. 59 (3), 499-509 (1989).</li>
<li>Harrison, D. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+generation+of+marked+clones+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient generation of marked clones in Drosophila.</a> Current Biology. 3 (7), 424-433 (1993).</li>
<li>del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nature Methods. 9, 47(2011).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions%3A+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li>
<li>Niell, C. M., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+optical+imaging+of+nervous+system+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Live optical imaging of nervous system development.</a> Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).</li>
<li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration%2C+protrusions%2C+and+fluorescence+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).</li>
<li>Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-dynamics%3A+Automated+quantification+of+dendrite+filopodia+dynamics+in+living+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).</li>
<li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FiloQuant+reveals+increased+filopodia+density+during+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387(2017).</li>
<li>Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FiloDetect%3A+automatic+detection+of+filopodia+from+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images.</a> BMC Systems Biology. 7 (1), 66(2013).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Urbančič, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodyan%3A+An+open-source+pipeline+for+the+analysis+of+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

ここでは、ショウジョウバエ幼虫脳における個別に標識されたニューロンにおける樹状枝の動的挙動を記録し定量するために開発したプロトコルについて述べた。特に、私たちのライブイメージングプロトコルは、幼虫LNvの樹状樹木全体をキャプチャし、そのデンドライト分岐の動的状態のグローバルビューを提供することを可能にする特定のパラメータが含まれています。しかし、我々の定量法は分岐末端のアノテーションに大きく依存しているため、複雑な樹状構造と凝縮樹木細化を有するニューロンは、この分析には適さない。
サンプルの調製、画像の取得、および後処理は、このプロトコルの重要な手順です。単一LNvsの高品質の生画像は、デンドライトダイナミクスの正確な定量化に不可欠です。我々のデータは、LNvデンドライト形態とその生理学的応答が解剖の30分以内に慎重に準備された幼虫の脳の駆除でよく保存されていることを示している。観察可能な脳組織の劣化、細長い樹状樹木や枝の破損を持つサンプルは、画像化および定量に使用しないでください。背景が低く、動きが見えないデータセットにはオプションですが、ブランチターミナルや自...

デンドライトは、感覚入力とシナプス入力を受け取り、処理する特殊なニューロンコンパートメントです。樹状樹木の複雑でステレオタイプ化された構造は、発見以来、厳しい調査を受けています。脱視管系におけるキセノプス光学系ニューロン、ひよこ甲状腺細胞、樹状樹盤形成(da)ニューロンを含む多くのモデルシステムが、その発達、改造、可塑性を研究するために確立されている。神経デンドライト1,2,3,4.ショウジョウバエ腹部横ニューロン(LNvs)は、ハエ行動の概日調節における重要な機能について最初に同定された視覚投影ニューロンのグループである5。研究はまた、幼虫光受容体(PR)6、7の直接ポストナプティックターゲットとしての幼虫LNvsの役割を明らかにした。重要なことに、異なる光系で幼虫を発達させる培養は、LNvsの樹状樹木の樹木の大きさに強く影響を与え、樹状可塑性7を研究するための新しいモデルとしてLNvsの適合性を実証する。我々のグループからの最近の研究は、LNvデンドライトのサイズと樹状枝の動的挙動の両方が経験に依存する可塑性8、9を示すことをさらに示している。この研究の一環として、我々は新しいライブイメージングおよび定量プロトコルを開発し、2番目または3番目の幼虫からLNvsのデンドライトダイナミクスに関する分析を行った。
ショウジョウバエ幼虫脳の透明な性質は、ライブイメージングに最適です。しかし、LNvsの樹状樹木は、幼虫脳葉6の中心にある密に内来性の幼虫視神経ピル(LON)に位置している。無傷の脳組織内の微細なデンドライトの枝とフィロポディアの画像をキャプチャするために、我々は光の浸透の深さを増加させ、ライブイメージング実験10の間に光毒性を減少させる2光子顕微鏡を利用する。このセットアップを用いて、ニューロンの明らかな形態学的劣化を観察することなく、30分以上のLNvsでライブイメージング実験を行いました。さらに、フリップアウト技術を用いた遺伝子操作により、個々のLNvsにGFPというタグが付けられた膜でラベルを付け、個々の枝の動きを監視するためにも重要です11,12,13.
最適な光学分解能を持つLNv樹状樹木の全ての枝の動的挙動を捉えるために、新たに解剖された幼虫脳移植所でタイムラプス3Dイメージングを行い、フレームあたり1分間1分の高い空間分解能を10~30分間行いました。デンドライトは非常に動的であり、ブランチの大部分は10分のウィンドウ内で観察可能な変化を表示します。これは、4D画像データセットに基づいて分岐動作を定量化するデンドライトダイナミクスを研究する際の主な技術的課題の1つにつながります。以前に確立された方法には、精度の欠如や過剰な時間要件など、さまざまな制限があります。そこで、画像後処理、分岐端子の手動マーキング、画像アニテーションソフトを用いて自動4Dスポットトレースを組み合わせた半自動方式を開発しました。スポットの3D座標に基づいて、異なる時点での分岐端子の動きを計算します。その後、データがエクスポートおよび分析され、分岐ダイナミクスの定量的測定値が生成されます。この方法は、既存の分岐の延長および引き込みイベントの持続時間と範囲、および新しい分岐の形成を正確に評価し、多数のニューロンでデンドライトダイナミクスを監視することを可能にします。

<table><tbody><tr><td>カメレオンビジョンII多光子レーザー</td><td>コヒーレント</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高真空グリース</td><td>ダウコーニング</td><td>79751-30</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780 2光子レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td></td><td>直立型</td></tr><tr><td>顕微鏡カバー ガラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-544-E</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロストプラス 顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーScientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>マイクロソフト</td><td></td><td>.csvファイルの処理</td></tr><tr><td>Huygens Professional</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td></td><td></td></tr>< <tr><td>3D視覚化と画像注釈のための</td><td></td> <td>Oxford Instruments</td><td></td></tr><tr><td>ストロング>試薬</ストロング>グル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コース</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl<サブ>2</サブ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO<サブ>3</サブ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエニューロンの開発における高速樹状分岐ダイナミクスのタイムラプスライブイメージングと定量化

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

高運動性樹状フィロポディアは、発達初期のニューロンに広く存在する。これらの探索的動的ブランチは、周囲の環境をサンプリングし、潜在的なシナプスパートナーとの接触を開始します。樹状分岐ダイナミクスとシナプトジェネシスとの関係は十分に確立されているが、発達過程と活性依存的なプロセスが樹状分岐ダイナミクスをどのように調節するかはよく理解されていない。これは、インビボシステムを使用してこれらの微細構造のライブイメージングおよび定量分析に関連する技術的な困難が原因の一部です。我々は、遺伝的アプローチを用いて個別に標識することができ、ライブイメージングのためにアクセス可能であるショウジョウバエ幼虫の心室腹部横ニューロン(LNvs)を用いてデンドライトダイナミクスを研究する方法を確立した。このシステムを利用して、タイムラプスライブイメージングを通じて、単一のラベル付きLNvの樹状樹木全体の分岐ダイナミクスを捕捉するプロトコルを開発しました。その後、ドリフト補正やデコンボリューションによる画質向上を目的とした後処理を行い、その後、全ての分岐端子の空間位置にアニズを付け、単一分岐レベルで分岐ダイナミクスを解析しました。最後に、端末トレースによって生成された座標情報を使用して分岐ダイナミクスを定量化するためのRスクリプト(補足ファイル)と特定のパラメータを開発しました。まとめると、このプロトコルは、高い時間的および空間分解能を有する神経樹状樹木樹の分岐ダイナミクスの詳細な定量的記述を達成することを可能にする。我々が開発した方法は、一般的にインビトロとインビボ条件の両方でまばらに標識されたニューロンに適用可能である。

上記のライブイメージングプロトコルを使用して、その後の解析と定量化のための高解像度画像スタックをキャプチャします。補足ビデオ1は、LNv.図2Bの代表から収集された最大強度投影(MIP)画像シリーズを示し、画像シリーズの8フレームの対応するモンタージュを示す。どちらのパネルでも、矢印はリトラクション イベントをマークし、矢印は拡張イベントをマークします。
次に、画像アニテーションソフトウェア(材料の表)を使用して分岐端子の半自動4Dトラッキングを行います。図 3Bは、LNvというラベルの代表者からの動的分岐端子のアポイントを示し、このソフトウェアを使用して、3Dで画像スタックを視覚化し、手動ですべての...

ここでは、ショウジョウバエ幼虫脳の生体調における高刺激性樹状フィロポディアの画像化に用いた方法と、デンドライトの定量的評価のためのタイムラプス3Dイメージングデータセットを定量化するために開発したプロトコルについて説明します。ニューロンの発達におけるダイナミクス。

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

このプロトコルは、樹状樹状アーバーの分岐ダイナミクスを定量化し、ライブタイムラプスイメージングと3D画像注釈ソフトウェアを使用してニューロンを開発するための新しいアプローチを提供します。この技術は、樹状フィロポディアの動的挙動を測定するための迅速かつ効率的な方法を提供する分岐端子を画像および追跡します。この方法を用いた研究は、開発と活動がデンドライト形態素形成を調節する方法を理解する洞察を提供する。我々の方法は、インビトロおよびインビボ設定の両方でまばらな標識ニューロンに適用可能である。この手順を実行する場合は、十分な時間的および空間的解像度を達成するために、イメージング パラメータを慎重に調整する必要があることに注意してください。幼虫ショウジョウバエから脳を収穫するために、解剖顕微鏡の下で、第5種の標準的な先端解剖鉗子の1組を使用して幼虫標本を所定の位置に保持し、もう1つを使用して慎重に脳を解剖し、眼球盤、脳LOB、および腹側神経コードを維持する。次に、取り付けられた筋肉を取り除き、イメージング中のサンプルの動きを最小限に抑えます。すべての脳が収穫されたら、真空グリースを使用して正方形の部屋をガラススライドに引き出し、20マイクロリットルの外部生理食塩水をチャンバーに加えます。鉗子を使用して脳をチャンバーに移し、後側を上に向けて顕微鏡下の脳の位置を調整します。ガラスカバースリップでチャンバーを覆い、カバースリップを軽く押して、イメージング手順中のサンプルの漂流を減らします。個別に標識されたニューロンを含む脳外植を同定するために、解剖の30分以内に40X水浸漬目的および発蛍光光源を選択する。920ナノメートルと非Dscan検出器に調整された2つの光子レーザーを選択し、画像をフレームあたり512 x 512ピクセル、Zスタックあたり1分で10分間収集するイメージングパラメータを設定します。次に、光ズームとデジタルズームを調整して十分なX、Y、Z解像度を達成し、樹状樹状の樹状アーバー全体のカバレッジを1分以内に確保します。この設定では、0.11 x 0.11 x 0.25 マイクロメートルの標準 X、Y、Z 解像度のイメージが生成されます。ドリフト補正の場合は、適切なドリフト補正ソフトウェアプログラムで目的のファイルを開き、[微視的パラメータを編集および編集]をクリックします。2 つのフォトン オプションがある場合は、2 つのフォトン 画像の顕微鏡の種類を [広視野] に設定し、ソフトウェアで定義されたワークフローに従います。デコンボリューションの場合は、デコンボリューションソフトウェアでドリフト補正画像を開き、ワークフローに従います。次に、4Dデータを解析し、画像内の定義されたスポットの空間座標を報告することができる後続の画像注釈ソフトウェアでサポートされているファイルタイプでデコンボルブ画像を保存します。イメージ注釈の場合、イメージ注釈ソフトウェアでデコンボルブされたイメージを開き、3D のすべての時点で分岐のヒントを確認してマークします。イメージ注釈ソフトウェアは、マークされたブランチ ヒントの空間座標と時間座標をレポートし、保存します。後続の計算のために座標情報を CSV ファイルとしてエクスポートします。スポット モジュールで、[自動作成をスキップして手動で編集する] をクリックし、[選択したスポットに自動接続] チェックボックスをオンにします。時系列のフレームを確認し、注釈の分岐を選択します。Shift キーを押したまま、分岐端子の先端をクリックしてスポットを追加します。次に、[統計] タブをクリックし、[詳細]、[特定の値]、[位置] を選択します。記録された空間座標と時間座標情報が表示されます。[保存] をクリックして、データを CSV ファイルとしてエクスポートします。3D で分岐チップの配置を計算するには、CSV ファイルをスプレッドシートとして開き、[トラック ID] 列を選択します。[最小から最大に並べ替え] をクリックし、[選択を展開] を受け入れます。並べ替え後、トラック ID は一意の樹状分岐を識別し、同じ分岐のスポットが同じトラック ID を共有します。スプレッドシートで[距離]列を追加し、座標を使用して、一時的に隣接する 2 つのスポットの距離を計算します。単一ボクセル レベルでの小さな動きを測定するには、0.3 マイクロメートル未満のすべての距離値をリセットして、補正されていないドリフトまたは不完全な画像注釈をフィルター処理します。次に、変位列を作成し、距離列から変位列に値をコピーします。各ブランチ ヒントに対して、拡張機能と取り消しイベントを手動で割り当てます。延長の場合は、正の変位値をそのままにします。引き込みである場合は、対応する変位値を負の値に変更します。次に、新しい Event 列で、個々の延長イベントと退位イベントの変位値を合計します。本ビデオでは、個別に標識された腹側ニューロンの代表から収集された最大強度投影画像系列が観察できる。単一フレームイメージは、取り消しイベントと拡張イベントの評価を可能にします。分岐端子の半自動4Dトラッキングにより、個別に標識された腹側神経細胞の動的分岐端子のアノテーションを示す。各時点における分岐の動きの方向と距離の計算により、異なる発達段階で個別に標識された腹側ニューロンの樹状枝ダイナミクスを比較することができます。最も重要なステップは、解剖および取り付け中に脳組織および樹状突起形態の完全性を維持することである。生の画像シリーズの品質は、追跡と定量化を成功させるためにも重要です。この技術を用いて、ショウジョウバエ中枢神経細胞の開発においてデンドライトフィロポディアの定量分析を行い、デンドライト成熟とシナプト発生に関連する分子機械を探索する能力を得た。

time-lapse-live-imaging-quantification-fast-dendritic-branch-dynamics

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルではのライブ解剖について説明...

ショウジョウバエ幼虫分節軸索内ではシナプス小胞の in vivo可視化で

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のためのシンプルなマイクロ流体デバイス<em生体内で&gt;</emの&gt;イメージング<em&gt; Cエレガンス</em&gt;<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;とゼブラフィッシュ

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マウス網膜外植片における神経細胞樹状細胞ダイナミクスのタイムラプス共焦点イメージング

出典: Winkle, C. C., et al. 軸索分岐と神経細胞形態形成中の原形質膜送達の役割を定義するための複合方法論の利用。J. Vis. 経験。(2016年)このビデオでは、示差干渉コントラスト (DIC) 顕微鏡を使用して、皮質ニューロンの軸索分岐をリアルタイムで観察するライブ...

マウス皮質ニューロンにおける軸索分岐のリアルタイム in vitro イメージング

ショウジョウバエの幼虫は、その半透明のキューティクルと強力な遺伝学へのライブイメージングのための魅力的なモデル系である。このプロトコルは、単層のPDMSデバイスを活用する方法について説明し、 第3齢ショウジョウバエの幼虫の神経細胞内で細胞過程のライブイメージングのための「幼虫チップ」と呼ばれる。...

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

このプロトコルは、無傷の幼虫の脳のコンテキストで生細胞イメージングを行うために使用合理化された方法を説明します。ライブセルイメージングのアプローチは、一貫して、以前に見落とされたメカニズムを暴く、非対称神経幹細胞分裂の研究だけでなく、他の神経と発達過程のための非常に貴重である。...

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経芽細胞

光学顕微鏡技術と生化学的アッセイを組み合わせることで、ネトリン依存性軸索分岐におけるSNARE媒介性エキソサイトーシスの関与を解明します。この技術の組み合わせにより、軸索の分岐と細胞形状の変化を制御する分子メカニズムの同定が可能になります。...

軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

このプロトコルの目標は、前のヴィヴォ ショウジョウバエ幼虫の脳文化が長期的な蛍光タイムラプス...

単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

この方法は、生きているマウスの海馬への光学的アクセスを可能にする慢性的な調製を記述する。この調製は、数週間の期間にわたって神経構造可塑性および活性誘発細胞可塑性の縦方向光学イメージングを行うために使用することができる。...

生きたマウスにおける後部海馬CA1の縦方向2光子イメージング

ここでは、出生後のマウス網膜外植体における神経突起形態形成をタイムラプス共焦点顕微鏡により調べる方法を提示する。我々は、膜標的蛍光タンパク質を Cre依存的に発現する組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いた網膜細胞型の疎標識および取得およびそれらの微細プロセスのためのアプローチを説明する。...

遺伝子標的網膜細胞集団のスパースアデノ随伴ウイルス標識を用いた神経樹木化のタイムラプスイメージング

学ぶショウジョウバエ幼虫脳の樹状分岐ダイナミクス定量化法。タイムラプス3Dイメージングと画像解析ソフトウェアを用いて、発達ニューロンの樹状突起フィロポディア動態をリアルタイムで追跡・測定する技術です。

ショウジョウバエニューロンの開発における高速樹状分岐ダイナミクスのタイムラプスライブイメージングと定量化

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