Name: 5つの脊椎動物群にわたる中枢神経系微小血管の信頼性の高い絶縁 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 学ぶ 中枢神経系微小血管の絶縁法。脳・脊髄から微小血管を効率的に分離し、複数の脊椎動物種で比較解析が可能。超遠心分離不要で1日で完了する信頼性の高い手法です。

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クルーズ・オレンゴ博士は、カリフォルニア大学デービス獣医学部スタートアップファンドの支援を受けました。

<ol><li>Bundgaard, M., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+vertebrates+started+out+with+a+glial+blood-brain+barrier+4-500+million+years+ago%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago.</a> Glia. 56, 699-708 (2008).</li>
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<li>Sohet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSR%2Fangulin-1+is+a+tricellular+tight+junction+protein+involved+in+blood-brain+barrier+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation.</a> Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).</li>
<li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sphingosine-1-phosphate+receptor+2+expression+underlies+female+CNS+autoimmunity+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).</li>
<li>Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Straightforward+method+for+singularized+and+region-specific+CNS+microvessels+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).</li>
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<li>Granberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+cortical+and+white+matter+neuroaxonal+pathology+in+early+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2912-2926 (2017).</li>
<li>Datta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+and+its+relationship+to+changes+in+brain+volume+and+white+matter+lesions+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2927-2938 (2017).</li>
<li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimaging+Techniques+to+Assess+Inflammation+in+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. 403, 4-16 (2019).</li>
<li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).</li>
<li>Cornford, E., Hyman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+brain+endothelial+luminal+and+abluminal+transporters+with+immunogold+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy.</a> NeuroRx. 2, 27-43 (2005).</li>
<li>Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Mouse+Brain+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> Journal of Visualized Experiments. , 53208(2015).</li>
<li>Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+3D+analysis+of+Claudin-5+reveals+significant+endothelial+heterogeneity+among+CNS+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels.</a> Microvascular Research. , (2012).</li>
<li>Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+digestion+improves+the+purity+of+harvested+cerebral+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels.</a> Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).</li>
<li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Research. 1134, 1-11 (2007).</li>
<li>Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-amyloid+pathology+in+human+brain+microvessel+extracts+from+the+parietal+cortex%3A+relation+with+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).</li>
<li>Porte, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+transcriptomic+study+of+brain+microvessels+in+neonatal+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice.</a> PLoS One. 12, e0171048(2017).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

BBBは、緊密な、付着物、"ペグソケット"-接合、およびCNS恒常性2、3、19に不可欠な接着プラークの洗練されたアーキテクチャによって結合された脳微小血管系内皮細胞のユニークな特性を含む。内皮細胞特性は、ペリサイトおよび周囲のアストログリア末脚注プロセス2、3、19によって誘導および維持される。BBB微小血管系は、極性(すなわち、発光またはアブルミナル内皮細胞表面に局在するタンパク質の非対称発現パターン)20を表示する。これは一時的にBBBを定義するかもしれませんが、実際には神経科学の中で最も謎めいた概念の一つです。例えば、NVU内の地域的、性別、年齢差は、CNSの地域的な脆弱性を外傷、毒性、感染、炎症に対して説明する...

私たちの脳は、私たちの体の中で最も重要な器官です。このため、正常からの逸脱を引き起こす可能性のある外的要因にもかかわらず、脳恒常性を維持することが優先事項である。一部の学者によると、約4億〜5億年前の1、脊椎動物は、私たちが今血液脳関門(BBB)2、3として知っているものを開発しました。この保護「フェンス」は、血液とCNSパレンチマ間のイオン、分子、細胞の輸送を厳密に調節することにより、中枢神経系(CNS)恒常性および機能に最も大きな影響を及ぼします。BBBが破壊されると、脳は毒性暴露、感染、炎症を受けやすくなります。したがって、BBB機能障害は、すべてではないにしても、神経学的および神経発達障害4、5、6に関連している。
BBBの高度な機能は、神経血管ユニット(NVU)2、3によって適合されたユニークなCNS微小血管系に起因する。高度に専門化された内皮細胞、ペリサイト、および星値状端足は、NVU2、3の細胞成分である。これらの細胞によって生成される細胞外マトリックスは、NVUおよびBBB生理学2、3にも不可欠である。NVUの必須細胞成分および分子成分は脊椎動物の間で保存されるが、異質性は、秩序および種7、8の間で報告される。しかし、技術的な制限は、神経生物学、生物医学、または翻訳研究におけるこれらの違いを十分に考慮する能力を妨げる。
このため、CNS領域特異的なマイクロ血管分離法を拡充し、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類の5つの脊椎動物群から多数の種に適用できるようにしました。このプロトコルは、小リッセンセファリックおよび大ギレンセファリック脊椎動物に使用するために記載されており、翻訳関連性9を有する種を含む。さらに、我々は、この文脈内で以前に調査されていないCNSの他の領域が含まれていますが、神経生理学に関連し、驚異的な臨床的意味を持つ:視床下部、下垂体、および白色物質。最後に、NVUおよび/またはBBB9、10、11に沿ったタンパク質発現の変化を同定するための信頼できるツールとして、この単離方法の容量を試験した。概念実証として、EAE中のVCAM-1およびJAM-B発現の変化を、免疫蛍光に続いて単離法を用いて決定する方法を示した。

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>BP39920</td><td>ブロッキングおよび抗体希釈剤に使用されます。</td></tr><tr><td>20% PFA</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15713-S</td><td>固定剤として使用 (4% PFA)</td></tr><tr><td>70,000 MW デキストラン</td><td>ミリポア シグマ</td><td>9004-54-0</td><td>MV-2 溶液に使用</td></tr><tr><td>アドソン鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール (FST)</td> <td>11006-12</td><td>筋肉と皮膚の除去に使用</td></tr><tr><td>アドソン鉗子、学生品質</td><td>FST</td><td>91106-12</td><td>上記と同じだが、より安価な</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>A7906-100G</td><td>MV-3溶液、ブロッキングおよび抗体希釈剤に使用</td></tr><tr><td>コーニング100 &mu;m セルストレーナー</td><td>ミリポアシグマ</td><td>CLS431752-50EA</td><td></td></tr><tr><td>コーニング 70 &mu;m セルストレーナー</td><td>ミリポアシグマ</td><td>CLS431751-50EA</td><td></td></tr><tr><td>コーニング デスクワーク 低結合チップ</td><td>ミリポアシグマ</td><td>CLS4151</td><td>以下と同じですが、安価です。</td></tr><tr><td>カルトレックスポリ-D-リジン</td><td>R&D</td><td>3439-100-01</td><td>スライドコーティングに使用</td></tr><tr><td>ロバ抗ヤギ IgG-ALEXA 555</td><td>サーモ</td><td>A21432</td><td>二次抗体として使用。1:200の推奨希釈。</td></tr><tr><td>ロバ抗マウスIgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21202</td><td>二次抗体として使用します。1:200の推奨希釈。</td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギIgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21206</td><td>二次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。</td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギIgG-ALEXA 647</td><td>Thermo</td><td>A31573</td><td>二次抗体として使用します。1:200の推奨希釈。</td></tr><tr><td>ロバ抗ラットIgG-DyLight 650</td>サー<td>モ</td><td>SA5-10029</td><td>二次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。</td></tr><tr><td>二重突きティッシュピック</td><td>FST</td><td>18067-11</td><td>髄膜および脈絡叢の除去に使用</td></tr><tr><td>デュモン #3c 鉗子</td><td>FST</td><td>11231-20</td><td>より繊細で、および/または小さな CNS 組織の取り扱いに使用 (下垂体など)</td></tr><tr><td>デュモン #7 鉗子</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td>CNS tisssue 解剖および取り扱いに使用</td></tr><tr><td>デュモン #7 鉗子、学生</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td>上記と同じ安い</td></tr><tr><td>ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips</td><td>Eppendorf</td><td>22493008</td><td>上記のヒントよりも品質が良い(より高価)。</td></tr><tr><td>極細グレーフ鉗子、鋸歯状</td><td>FST</td><td>11151-10</td><td>骨の除去に使用</td></tr><tr><td>細かいはさみ、鋭い</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td>豚とマカクの硬膜嚢</td></tr><tr><td>ガラス乳棒の除去に使用 1.5mLマイクロ遠心チューブティッシュグラインダーホモジナイザー、10チャン</td><td>バイオサイエンス株式会社(eBay)</td>のパック<td>GP1.5_10</td><td>小さな獣医の視床下部と下垂体に使用されます。</td></tr><tr><td>ヤギ抗CXCL12、ビオチン化</td><td>PeproTech</td><td>500-P87BGBT</td><td>すべての検体からCNS微小血管に対する一次抗体として使用されます。推奨希釈:1:20。</td></tr><tr><td>ヤギ反JAM-B</td><td>R&D</td><td>AF1074</td><td>神経炎症を評価するための一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 &mu;g/mLです。</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A11001</td><td>二次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21424</td><td>二次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。</td></tr><tr><td>ヤギの抗PDGFR&β;</td><td>R&D</td><td>AF1042</td><td>すべての検体からCNS微小血管の一次抗体として使用。推奨濃度:5 &mu;g/mLです。</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21249</td><td>二次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG-DyLight 488</td><td>Thermo</td><td>35552</td><td>二次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。</td></tr><tr><td>ヤギ抗ラットIgG-DyLight 650</td><td>Thermo</td><td>SA5-10021</td><td>二次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。</td></tr><tr><td>Graefeの鉗子、曲げられた先端、1X2歯</td><td>FST</td><td>11054-10</td><td>HBSSのナイロン フィルター網の保持および振とうのための使用</td></tr>、<tr><td>カルシウムおよびマグネシウムが付いている1X緩衝液</td><td>コーニング</td><td>21-022-CM</td><td>MV-1解決</td></tr><tr><td>HEPESの使用、1M液体緩衝器</td><td>コーニング</td><td>25-060-CI</td><td>MV-1解決</td></tr>イ<tr><td>ソレクチンGS-IB4-Biotin-XX</td><td>のために使用される サーモフィッシャーサイエンティフィック(熱)</td><td>I21414</td><td>マメ科植物Griffonia simplicifoliaから単離された糖タンパク質は、内皮細胞glycocalysxのD-ガラクトシル残基に結合します。鳥類およびブタの中枢神経系微小血管に使用されます。推奨濃度:5 &mu;g/mLです。</td></tr><tr><td>LaGrange はさみ、鋸歯状</td><td>FST</td><td>14173-12</td><td>頭蓋骨解剖および椎弓切除術に使用されます(ブタとマカクを除く)</td></tr><tr><td>Millicell EZ スライド 8 ウェルユニット</td><td>ミリポアシグマ</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗 CLDN5</td><td>サーモ</td><td>35-2500</td><td>すべての検体から中枢神経系微小血管の一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 &mu;g/mLです。</td></tr><tr><td>マウス抗GGT1</td><td>Abcam</td><td>ab55138</td><td>すべての検体からCNS微小血管の一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 &mu;g/mLです。</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD31</td><td>R&D</td><td>BBA7</td><td>霊長類中枢神経系微小血管の一次抗体として使用されます。推奨濃度:16.5 &mu;g/mLです。</td></tr><tr><td>マウス抗NFM</td><td>Thermo</td><td>RMO-270</td><td>すべての検体からCNS微小血管の一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 &mu;g/mLです。</td></tr><tr><td>マウス抗抗体 - SMA</td><td>Thermo</td><td>MA5-11547</td><td>すべての検体からCNS微小血管に対する一次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。</td></tr><tr><td>ナイロンフィルターネット、ロール</td><td>ミリポアシグマ</td><td>NY6000010</td><td>レーザーカットされた直径13mmのフィルターネットディスク。小さな獣児の視床下部と下垂体に使用されます。</td></tr><tr><td>ナイロンフィルターネット、25mm</td><td>ミリポアシグマ</td><td>NY2002500</td><td>視床下部と下垂体を除くほとんどの小さな脊椎動物のCNS組織に使用されます。マカクザルやブタの視床下部や下垂体に使用されます。</td></tr><tr><td>ナイロンフィルターネット、47 mm</td><td>ミリポアシグマ</td><td>NY2004700</td><td>視床下部と下垂体を除く、マカクとブタの中枢神経系組織に使用されます。</td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止試薬 DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>P36935</td><td>スライドのカバースリップに使用します。</td></tr><tr><td>Rabbit anti-AQP4</td><td>Millipore Sigma</td><td>A5971</td><td>すべての検体からCNS微小血管に対する一次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。</td></tr><tr><td>ウサギ抗LSR</td><td>ミリポアシグマ</td><td>SAB2107967</td><td>すべての検体からCNS微小血管に対する一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 &mu;g/mLです。</td></tr><tr><td>Rabbit anti-NG2</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB5320</td><td>すべての検体からCNS微小血管に対する一次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。</td></tr><tr><td>ウサギ抗OSP</td><td>Abcam</td><td>ab53041</td><td>すべての検体からCNS微小血管の一次抗体として使用されます。推奨濃度:1 &mu;g/mLです。</td></tr><tr><td>ウサギ抗VE-Cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>すべての検体からCNS微小血管に対する一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 &mu;g/mLです。</td></tr><tr><td>Rabbit anti-ZO-1</td><td>Thermo</td><td>61-7300</td><td>すべての検体から中枢神経系微小血管に対する一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 &mu;g/mLです。</td></tr><tr><td>ラット抗CD31</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 550274</td><td>マウス中枢神経系微小血管の一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 &mu;g/mLです。</td></tr><tr><td>ラット抗GFAP</td><td>Thermo</td><td>13-0300</td><td>すべての検体からCNS微小血管に対する一次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。</td></tr><tr><td>ラット抗VCAM-1</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 553329</td><td>神経炎症を評価するための一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 &mu;g/mLです。</td></tr><tr><td>滅菌リンガー液、フロッグ</td><td>アルドンコーポレーション</td><td>IS5066</td><td>アンフィビア麻酔に使用</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン-ALEXA 555</td><td>サーモ</td><td>S32355</td><td>ビオチン化一次抗体を標識するための二次抗体として使用されます。1:500の推奨希釈。</td></tr><tr><td>Streptavidin-ALEXA 647</td><td>Thermo</td><td>S32357</td><td>ビオチン化一次抗体を標識するための二次抗体として使用されます。1:500の推奨希釈。</td></tr><tr><td>外科用ハサミ、シャープ</td><td>なFST</td><td>14002-12</td><td>筋肉や皮膚の除去に使用</td></tr><tr><td>外科用ハサミ、シャープな鈍い</td><td>FST</td><td>14001-16</td><td>斬首に使用(ブタとマカクを除く)</td></tr><tr><td>Swinnex フィルターホルダー、13mm</td><td>ミリポアシグマ</td><td>SX0001300</td><td>レーザーカットで修正。小さな獣児の視床下部と下垂体に使用されます。</td></tr><tr><td>Swinnexフィルターホルダー、25mm</td><td>ミリポアシグマ</td><td>SX0002500</td><td>レーザーカットで変更。視床下部と下垂体を除くほとんどの小さな脊椎動物のCNS組織に使用されます。マカクザルやブタの視床下部や下垂体に使用されます。</td></tr><tr><td>Swinnexフィルターホルダー、47mm</td><td>ミリポアシグマ</td><td>SX0004700</td><td>レーザーカットで変更。視床下部と下垂体を除く、マカクとブタの中枢神経系組織に使用されます。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher</td><td>50-165-7277</td><td>ブロッキングおよび抗体希釈剤に使用されます。</td></tr><tr><td>Wheaton 120 Vac オーバーヘッドスターラー</td><td>VWR (サプライヤー DWK Life Sciences)</td> <td>62400-904 (DWK #903475)</td> <td>視床下部と下垂体を除く 55 mL の組織グラインダーを備えたマカクとブタの CNS 組織に使用されます。</td></tr><tr><td>PTFE乳棒、10 mL</td><td>VWR(サプライヤーDWKライフサイエンス)</td><td>14231-384(DWK#357979)</td><td>視床下部と下垂体を除くほとんどの小さな脊椎動物CNS組織で使用されるウィートンポッター-エルヴェイェムティッシュグラインダー。マカクザルやブタの視床下部や下垂体に使用されます。</td></tr><tr><td>PTFE乳棒、55 mL</td><td>VWR(サプライヤーDWKライフサイエンス)</td><td>14231-372(DWK #357994)</td>視<td>床下部と下垂体を除くマカクとブタのCNS組織に使用されます。</td></tr></tbody></table>

5つの脊椎動物群にわたる中枢神経系微小血管の信頼性の高い絶縁

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

中枢神経系(CNS)からの微小血管の単離は、一般的に、複数の動物、最も頻繁にげっ歯類からの皮質組織を組み合わせることによって行われる。このアプローチは、血液脳関門(BBB)特性の尋問を皮質に制限し、個々の比較を可能にしません。このプロジェクトは、皮質、小脳、視床下部、下垂体、脳幹、脊髄など、複数のCNS領域からの神経血管ユニット(NVU)の比較を可能にする単離方法の開発に焦点を当てています。さらに、もともとマウスサンプル用に開発されたこのプロトコルは、脳半球白物から微小血管を分離することができる小さな大きな脊椎動物種のCNS組織での使用に適応することに成功しました。この方法は、免疫標識と組み合わせると、タンパク質発現の定量と個体、組織型、または治療間の統計的比較を可能にする。神経炎症性疾患、多発性硬化症のマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)におけるタンパク質発現の変化を評価することで、この応用性を証明した。さらに、この方法で隔離されたマイクロ容器は、qPCR、RNA-seq、ウェスタンブロットなどの下流アプリケーションに使用できます。これは、超遠心分離または酵素解離を使用せずにCNSマイクロ容器を分離する最初の試みではありませんが、単一の個人と複数のCNS領域の比較に対するその熟達性においてユニークです。したがって、CNS部分(皮質、小脳、視葉、脳幹、視床下部、下垂体、脊髄)、CNS組織型(灰色または白色物質)、個体、実験的治療群、および種。

マウスCNSから単離された微小血管は、神経血管ユニット2、3のすべての固有の細胞成分を示した。血小板内皮細胞接着分子-1(PECAM、CD31とも呼ばれる)またはアイソレクチンIB4(内皮細胞グリコカリックスと結合する糖タンパク質)のいずれかを内皮細胞に使用し、 血小板由来増殖因子β(PDGFRβ)またはニューロングリア抗原2(NG2)は、天体細胞のペリサイトおよびアクアポリン-4(AQP4)に対して、これらの固有成分が単離された微小血管に存在することを示す。表示されるCNS領域には、皮質微小血管(図3B)、小脳(図3C)、下垂体(図</...

このプロトコルの目的は、リッセンセファリックおよびギレンセファリック脊椎動物の中枢神経系の複数の領域から微小血管を分離することです。

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

このプロトコルは、異なる中枢神経系領域間、ならびに異なる個体間の微小血管系の比較を可能にするため、重要である。このマイクロ容器の分離技術は1日で完了することができ、超遠心分離および酵素解離の必要性を排除する。髄膜および脈絡膜叢を除去することは困難であり得る。各組織の完全な除去を確実にするためにゆっくりと慎重に動作するようにしてください。小さなリセンサイル脊椎動物標本からのCNS組織解剖の場合、採取した脳を氷上のMV-1溶液を含む15ミリリットルの円錐管に入れ、鉗子を使用して頭蓋骨のセラ・ターシカから下垂体を取り出す。下垂体をMV-1溶液の1.7ミリリットルマイクロ遠心分離管に氷の上に置き、皮膚と筋肉を取り除いて椎骨柱を露出させる。手足、胸部および内臓を取り除いた後、18ゲージ針を装備した10ミリリットルの注射器を使用して、椎骨柱を新鮮なMV-1溶液で洗い流し、腰椎骨の前部を通して尾骨からrostral方向に洗い流す。次に、新鮮なMV-1溶液を含む5ミリリットルのチューブに脊髄を入れる。次に、脳を解剖顕微鏡の下のペトリ皿に入れ、二重突起のプリックで髄を取り除きます。髄の破片が残っていないかどうかを確認するために、脊髄を確認してください。視床下部、小脳、脳幹、皮質を分離するために鉗子を使用してください。必要に応じて、鉗子と虹彩とバネはさみを使用して嗅球や視床を切除し、二重突っ張りのプリックを使用してすべての脳室から脈絡叢のすべてを取り除きます。大きな変頭筋脊椎動物標本からのCNS組織解剖には、解剖顕微鏡と二重突起プリック、鉗子、虹彩、スプリングハサミを使用して各CNS組織から髄膜を取り除き、脳室から脈絡叢の断片を取り除くように注意してください。収穫されたCNS組織の均質化のために、各CNS領域を個々のペトリ皿内の1〜2ミリメートルの部分にミンチする。小さな脊椎動物の標本からCNS組織を均質化するには、トランスファーピペットを使用して、1ミリリットルのMV-1溶液を添加して、ひき肉組織を懸濁させる。その後、同じトランスファーピペットを使用して、皮質、小脳、脳幹、眼用ローブ、脊髄片を個々の10ミリリットルガラス組織グラインダーに分配し、PTFE害虫と5ミリリットルのMV-1溶液を使用して各組織を約10ストローク粉砕します。各組織スラリーを氷上の個々の15ミリリットルの円錐管に移し、鉗子を使用して視床下部と下垂体を100マイクロリットルのMV-1溶液に入れ、個々の1.7ミリリットルのチューブに入れる。次に、各組織をガラスマイクロペステスルで慎重に均質化する。大きな脊椎動物の標本を均質化するには、斜め切り移管ピペットを使用して、55ミリリットルのガラス組織グラインダーに切り身組織を移し、グラインダーをオーバーヘッドスターラーに取り付けます。表に示すように均質化されている特定のCNS部分に従ってMV-1溶液の推奨量の半分を追加し、オーバーヘッドスターラーを毎分約150回転にします。ガラス管を慎重に上下に約30秒間動かしてから、オーバーヘッドスターラーをオフにして、均質化のためにMV-1溶液を追加し、均質なスラリーが得られるまで追加します。次に、均質化した組織を氷上の50ミリリットルの円錐管に移す。マイクロ容器精製のために、ペレットは、遠心分離によってCNS組織を均質化し、上清を廃棄する。小さな脊椎動物標本のマイクロ血管分離のために、ピペット皮質、小脳、脳幹、光学ローブおよび脊髄コードペレットは、サンプル当たり新鮮な氷冷MV-2溶液の5ミリリットルで、約10回、各チューブにさらに5ミリリットルの氷冷MV-2溶液を加える。慎重に混合するためにチューブを反転し、MV-2溶液の1ミリリットルで視床下部および下垂体ペレットを再中断します。大きな脊椎動物標本のマイクロ血管分離のために、皮質、小脳、脳幹および脊髄のマイクロ容器のペレットに20ミリリットルの氷冷MV-2溶液を加え、約5分間毎分40回転でチューブリボルバーのペレットを再中断する。再懸濁の終わりには、CNS組織のリカチを遠心分離で分離し、各チューブをゆっくりと回転させて上澄みを壁に沿って通過させ、液体界面の厚くて緻密なミエリン層をチューブ壁から慎重に取り外します。ミエリンと液体のインターフェースを捨て、低糸状紙のワイプで包まれたヘラで各チューブの内側の壁をしみまきます。次に、ねじった低糸状紙ワイプを使用して余分な液体を吸収し、低結合チップを使用して各ペレットを1ミリリットルのMV-3溶液中で再懸濁させます。マイクロ容器溶出およびろ過の場合、新鮮なMV-3溶液を各CNS組織マイクロ容器スラリーに数ミリリットル混合し、凝集体を避けるために混合しながら、プルイットストレーナーを通して各懸濁液を個々の50ミリリットル円錐形チューブにひずむ。CNS領域ごとに1つの変更されたフィルターホルダーに1つの20マイクロメートルナイロンネットフィルターを置きます。フィルターホルダーを50ミリリットルの円錐状チューブに移し、5ミリリットルの氷冷MV-3溶液でフィルターを濡らし、バッファーがフィルターホルダーを下に注ぎ、円錐形のチューブに入れます。溶出したマイクロ容器を各20マイクロメートルのナイロンネットフィルターに移し、5~10ミリリットルの氷冷MV-3溶液でマイクロ容器をすすきます。鉗子を使用して、各フィルターを氷冷MV-3溶液を含む個々のビーカーに移し、各フィルターを約30秒間静かに振ってマイクロ容器を取り外します。15ミリリットル円錐形チューブに移管した後、遠心分離によってマイクロ容器を回収し、低結合ピペットを使用して、1ミリリットルの氷冷MV-3溶液中の各ペレットを再懸濁させます。次いで、小さな脊椎動物の標本からマイクロ容器の懸濁液を1.7ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移し、20,000倍Gで5分間、摂氏4度で遠心分離を行う。大型脊椎動物標本の場合は、懸濁液を個々の5ミリリットル遠心管に移し、4度で2,000倍Gで5分間遠心分離するためのMV-3溶液を4ミリリットル加えます。神経血管ユニットの固有成分は、示されているように、CD31、PDGFR-β、および皮質、小脳、下垂体、視床下部、脳幹、および脊髄マイクロ血管を含む4つのアクアポリンの免疫標識によって、示されるように単離されたマイクロ血管内で検出することができる。同様に、被着体結合タンパク質VE-カドヘリンの発現は、CLDN5及びゾヌラ・オクルデンス−1の緊密な接合タンパク質、三細胞結合タンパク質アングリン-1、及び基底マル・ケモカイン・リガンドCXCLモチーフ12、およびガンマグルタミルトランスビ転移酵素-1の発現を可視化することができる。さらに、マイクロ血管の大部分はアルファ平滑筋アクチンの発現を欠いており、この分離プロトコルが選択的に小口径マイクロ血管を標的とすることを示している。鳥、うそつき、カエル、魚などの他の小さなリセンサイル脊椎動物から得られたマイクロ血管は、いくつかの形態学的特徴を共有し、この方法は、種間の神経血管単位の違いのさらなる特徴付けに有用であることを示唆している。タンパク質発現の変化を定量化すると、実験的自己免疫性脳脊髄炎のピーク時に、脊髄マイクロ血管に沿った血管細胞接着分子1および結合接着分子Bの増加が明らかになる。しかしながら、血管細胞接着分子1は下垂体の微細血管においても有意に増加し、視床下部および脳幹マイクロ血管において減少した。また、全てのCNS組織において慢性実験的自己免疫性脳脊髄炎の際に血管細胞接着分子1発現、視床下部および下垂体マイクロ血管におけるB発現の接合接着分子に変化が見られる。ウェスタンブロット、PCR、免疫体化学などの定量分析を行い、この手順に従って血液脳関門内の遺伝子およびタンパク質発現パターンに関する洞察を明らかにすることができます。パラホルムアルデヒドは、急性毒性試薬であり、適切なPPEを身に着けている間、常に煙のフードの下で処理する必要があります。

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神経科学

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学ぶ 中枢神経系微小血管の絶縁法。脳・脊髄から微小血管を効率的に分離し、複数の脊椎動物種で比較解析が可能。超遠心分離不要で1日で完了する信頼性の高い手法です。

5つの脊椎動物群にわたる中枢神経系微小血管の信頼性の高い絶縁

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