Name: ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 学ぶヒト幹細胞由来内皮細胞とGABAergicニューロンの相互作用を評価する3種類のin vitroアッセイ。長距離移動、共培養、化学誘引アッセイにより、神経発達と精神疾患の病態解明に貢献する簡便で低コストな手法を確立する。

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この研究は、国立精神衛生研究所(R01MH110438)と国立神経障害・脳卒中研究所(R01NS100808)からAVへの賞によって支えられた。

1. ヒト心室外皮細胞の培養と保存
<ol><li>基下膜マトリックスコーティングされたヒト心室内皮細胞を維持する(材料表参照) 心室内皮細胞培地(50 ng/mL VEGF-A、100 ng/mL FGF2および5 μM GABAを含むE6培地)の6ウェルプレートを37°Cおよび5%CO2で行う。代替日ごとにメディアを変更します。</li>
	<li>4°Cで基調膜マトリックスを解凍し、冷たいDMEM /F12培地でそれを希釈することによって1:100溶液を作ります。マトリックス溶液の1 mLで6ウェルプレートの各ウェルをコーティングします。使用前に少なくとも1時間、37°Cでプレートをインキュベートする。</li>
	<li>ヒトの心室内皮細胞が80%〜90%の合流に達することを許可する。井戸から吸引媒体。ウェルごとに1 mLの無菌1x PBSでウェルを1回洗います。</li>
	<li>ウェルごとに 1 mL のセル解離溶液 (材料表を参照) を加えて細胞を切り離します。37 °Cで5分間インキュベートします。5分後、心室内皮細胞培地の1 mLを加える。細胞溶液を15mL円錐形チューブに移します。 注: セクション 3 と 4 の TrypLE とは対照的に、ここではセルの解離にアキュクターゼを使用します。</li>
	<li>遠心分離細胞は、室温で5分間500xgで、上清を吸引し、細胞ペレットを1mLの心室内皮細胞培地中に再懸濁する。</li>
	<li>トリパンブルーの除外方法を使用して、生細胞をカウントします。1.2 x 105セル/cm2の密度で新鮮なマトリックスコーティングされたプレートの種子細胞。37 °Cおよび5%のCO2でインキュベートする。</li>
	<li>凍結培地(90%心室内皮細胞培地および10%DMSO)で凍結保存することによりヒト心室内皮細胞を貯蔵する。<ol>
<li>上記の手順 1.3 と 1.4 に従って、細胞の関連付け解除と収集を行います。トリパンブルー除外法で溶液中の細胞をカウントします。</li>
		<li>500 x gで遠心分離細胞を 5 分間室温で 5 分間.上清を吸引し、凍結培地の5 x 106細胞/mLで細胞ペレットを再懸濁する。</li>
		<li>凍結培地と細胞の1 mLを凍結ごとに分配する。バイアルをイソプロパノールで満たされたチャンバーに入れ、1°C/分で-80°Cで一晩冷やします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. アッセイのためのヒト心室内皮細胞の調製
<ol><li>ヒトの心室内皮細胞が70%〜80%の合流性に達することを許可する。</li>
	<li>上記のように、手順1.3~1.5に従って細胞を解き分けさせる。トリパン ブルーの除外方法を使用してセルをカウントします。</li>
</ol>3. アッセイのためのヒトGABAergicインターニューロンの調製
注:ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来GABAergicインターニューロンおよびニューロン培地を商業的に購入しました(資料表参照)。ニューロンは、製造業者によって開発されたプロトコルに従ってヒト線維芽細胞由来iPSCラインを区別することによって生成される。細胞を解凍し、製造業者のプロトコルに従って培養した。
<ol><li>ヒトGABAergicインターニューロンを解凍し、70%-80%の合所性に2週間12ウェルプレートでそれらを培養します。</li>
	<li>アッセイ当日、温細胞解離液(材料表参照)と、使用前に37°Cでの神経培地のアリコートを10分間行った。</li>
	<li>細胞を含む各ウェルからの吸引培地。ウェル当たり1 mLの無菌1x PBSで細胞を洗浄する。</li>
	<li>ウェルあたり0.5 mLの予め温めた解離液を加えて細胞を切り離し、37°Cで5分間インキュベートします。細胞溶液を15mL円錐形チューブに移します。細胞の塊を解きそそります。</li>
	<li>380 x gで細胞を室温で5分間遠心分離し、上清を吸引し、細胞ペレットをニューロン培地の1 mLに再懸濁する。トリパンブルーの除外方法を使用して、生細胞をカウントします。</li>
</ol>4. アッセイのためのコントロールヒト内皮細胞の調製
注:コントロールヒトiPSC由来内皮細胞および内皮細胞培地を商業的に購入した(材料表)。これらの内皮細胞は、製造業者が開発したプロトコルに従ってヒト線維芽細胞由来iPSCラインを内皮の運命に分化することによって生成される。細胞を解凍し、製造業者のプロトコルに従ってフィブロネクチン基質で培養した。フィブロネクチンコートプレートは、製造業者のプロトコルに従って調製された。
<ol><li>解凍は、ヒト内皮細胞をコントロールし、それらを6ウェルプレートで80%〜90%の合流性に培養する。</li>
	<li>アッセイ当日、温細胞解離液(材料表参照)と、使用前に37°Cで内皮培地のアリコートを10分間使用した。</li>
	<li>細胞を含む各ウェルから培地を吸引する。ウェル当たり1 mLの無菌1x PBSで細胞を洗浄する。</li>
	<li>ウェルごとに0.5 mLの予め温めた解離液を加えて細胞を切り離す。室温で5分間インキュベートし、溶離液を中和するために1mLの内皮細胞培地を1ウェルに加えます。細胞溶液を15mL円錐形チューブに移します。</li>
	<li>200 x gでの遠心分離細胞を室温で 5 分間。吸引上皮を、内皮細胞培地の1mL中に細胞ペレットを再懸濁する。トリパンブルーの除外方法を使用して、生細胞をカウントします。</li>
</ol>5. ワンウェルカルチャーインサートの調製
<ol><li>室温または4°Cで一晩で1mg/mLラミニン溶液を解凍する。</li>
	<li>0.01%のポリL-オルニチン溶液(1皿あたり1 mL)で35ミリメートルの適切な数の料理をコーティングします。少なくとも1時間室温で料理をインキュベートします。</li>
	<li>使用前に、滅菌水で1mg/mLラミニン溶液1:300を最終濃度3.3μg/mLに希釈します。</li>
	<li>各皿からポリL-オルニチンを完全に吸引します。各皿を無菌水で3倍に十分に洗い流し、ポリL-オルニチン誘発細胞毒性を避けるために完全に吸引します。</li>
	<li>各皿に3.3μg/mLラミニン溶液の1 mLを加え、37°Cで一晩または少なくとも1時間インキュベートします。 注:または、ラミニン含有食器を4°Cに保存してください。使用前に37°Cの細胞培養インキュベーターで食器を平衡化する。</li>
	<li>無菌刃を用いて2ウェルシリコーン培養インサートの1ウェルの3つの側面を切り取り(図1A)、ワンウェルインサートを生成します(図1B)。 注:切断しながら元の包装の表面にしっかりと取り付けられた2ウェルインサートを保ち、滑らかなカットを確保し、インサートの接着性を保護します。</li>
	<li>皿からラミニン溶液を吸引する。 注意:ラミニンインキュベーション後に、滅菌PBSや水で食器を洗わないで下さい。湿った表面は、培養インサートの密着性を防ぎます。</li>
	<li>無菌ピンセットでワンウェルインサートを取り出し、ポリL-オルニチン/ラミニンコーティングされた皿の中央に置きます。チップの端に沿って押して、皿の表面に固定します。</li>
	<li>慎重に皿をひっくり返して、挿入物がしっかりと付着していることを確認します。</li>
	<li>皿を上下逆さまに保ち、超細かい先端を持つ永久的な黒いマーカーを使用して、挿入コンパートメントの境界をマークします(図1C)。</li>
</ol>6. 長距離移行アッセイ
<ol><li>ヒト GABAergic インターニューロンを 3 x 104細胞/70 μL のニューロン培地の濃度で中断する。各1ウェル培養インサート内の70μLの細胞溶液を播種した。 注: インターニューロンのシード密度は、製造元の推奨事項に従ってです。</li>
	<li>ヒト心室外皮細胞を3 x104細胞/70μLの心室内皮細胞培地の濃度で中断する。各1ウェル培養インサート内の70μLの細胞溶液を播種した。 注: 播種ニューロンの数と1:1の比率で播種されたヒトの心室内皮細胞の数。</li>
	<li>ニューロン皿にニューロン培地1 mLを加えて、挿入物の周囲を埋め、コーティングの乾燥を防ぎます。同様に、心室内皮細胞皿に1mLの心室内皮細胞培地を添加する。 注:挿入が妨げられないように、皿の端に沿ってゆっくりと媒体を追加します。</li>
	<li>顕微鏡で、細胞がインサートコンパートメントから漏れていないことを確認します。</li>
	<li>37 °Cおよび5%のCO2で24時間の細胞をインキュベートする。24時間インキュベーションした後、顕微鏡で細胞が適切に結合し、一晩漏れがないことを確認してください。</li>
	<li>48時間の播種後、無菌のツイーザーを使用して挿入物を軽く取り除きます。顕微鏡下で、細胞層が乱れなき状態のままであることを確認します(0日目)。</li>
	<li>ニューロン皿から培地を取り出し、新鮮なニューロン培地を1 mL加えます。同様に、心室内皮細胞皿から培地を取り出し、新鮮な心室内皮細胞培地の1 mLを加える。 注:必要な数の料理を確保し、0日目の画像の4%PFAで固定してください。</li>
	<li>37 °Cおよび5%のCO2で5日間細胞をインキュベートする。5日後、培地を取り出し、4%PFAで10分間PFAを固定し、1x PBSで3x洗浄します。</li>
	<li>染色ニューロンは、抗ヒトβ-チューブリンまたは抗ヒトMAP2抗体を有する、および抗ヒトCD31抗体を有する内皮細胞を有する。免疫染色の終了時に、各ディッシュに1mLの抗フェード取付け培地を加えます。</li>
</ol>7. 共文化移行アッセイ
<ol><li>共懸濁3 x 10 4 GABAergicインターニューロンおよび3 x 104ヒト経膣内皮細胞70 μLの共培養培地(GABAと50%神経培地を含まない50%の心室維持培地)。このセル溶液をワンウェルインサートコンパートメント内にシードします。そのようなアッセイ料理の適切な数を準備します。 注:GABAは、移行に対する外因性GABAの影響を排除するために共培養培地に添加されなかった。</li>
	<li>顕微鏡で、細胞がインサートコンパートメントから漏れていないことを確認します。</li>
	<li>コーティングが乾燥するのを防ぐために、皿の側面に沿って1 mLの共培養培地をゆっくりと加えます。 注:挿入が妨げられないように、皿の端に沿ってゆっくりと媒体を追加します。</li>
	<li>第1の対照として、種子3 x104ヒトGABAgicインターニューロンは、1ウェルインサート当たり70μLの共培養培地のみである。そのような料理の適切な数を準備します。</li>
	<li>第2の対照として、3 x104 GABAergicヒトインターニューロンを共種に3 x104コントロールヒト内皮細胞を1ウェルインサート当たり70μLの共培養培地で制御する。適切な数の料理を準備します。</li>
	<li>37 °Cおよび5%のCO2で24時間の料理をインキュベートする。24時間インキュベーションした後、顕微鏡で細胞が適切に結合し、漏れがないことを確認してください。</li>
	<li>48時間の播種後、無菌のツイーザーを使用して挿入物を軽く取り除きます。顕微鏡下で細胞層が乱れていないことを確認します(0日目)。</li>
	<li>培地を取り出し、1 mLの新鮮な共培養培地を加えます。 注:0日目の画像を取得するための適切な数の料理を確保してください。</li>
	<li>37 °Cおよび5%のCO2で5日間細胞をインキュベートする。</li>
	<li>5日後、培地を取り出し、4%PFAで10分間PFAを固定し、1x PBSで3x洗浄します。</li>
	<li>ニューロンを標識する抗ヒトβ-チューブリンまたは抗ヒトMAP2抗体を有する染色。免疫染色の終了時に、各ディッシュに1mLの抗フェード取付け培地を加えます。</li>
</ol>8. ケモアトラクションアッセイ
<ol><li>滅菌ピンセットを使用して、ポリL-オルニチン/ラミニンコーティングされた35mm皿の中央に3ウェル培養インサートを置きます。</li>
	<li>皿をひっくり返します。超細かい先端を持つ永久的な黒のマーカーを使用して、挿入物の中央のコンパートメントの周りの境界をマークします。</li>
	<li>70μLのニューロン培地中の中間区画における種子3 x 104ヒトGABAergicインターニューロン(図3A)。</li>
	<li>播種104ヒト心室内皮細胞は、それぞれ2つの外側区画内の70μLの心室内皮細胞培地の70μLおよび104コントロール内皮細胞の70μL中にそれぞれ2つの外側区画内の内皮細胞培地を制御する(図3A)。</li>
	<li>皿の上のコーティングが乾燥するのを防ぐために、皿の側面に沿って1 mLの共培養培地(GABAを含まない50%の心室維持培地および50%の神経培地)を加える。</li>
	<li>顕微鏡で、細胞がインサートコンパートメントから漏れていないことを確認してください。</li>
	<li>37 °Cおよび5%のCO2で24時間の細胞をインキュベートする。24時間インキュベーションした後、顕微鏡で細胞が適切に結合し、漏れがないことを確認してください。</li>
	<li>48時間の播種後、無菌のツイーザーを使用して挿入物を軽く取り除きます。顕微鏡下で細胞層が乱れていないことを確認します(0日目)。</li>
	<li>培地を取り出し、1 mLの新鮮な共培養培地を加えます。 注:0日目の画像に必要な数の料理を確保してください。</li>
	<li>37 °Cおよび5%のCO2で36時間の細胞をインキュベートする。36時間後、吸引培地、4%PFAで10分間固定し、1x PBSで3倍洗浄する。</li>
	<li>ヒトGABAergic染色体ニューロンを抗ヒトβ-チューブリンまたは抗ヒトMAP2抗体と共に染色する。染色手順の最後に、各皿に1 mLのアンチフェード取り付け媒体を加えます。</li>
</ol>9. イメージングとデータ分析
<ol><li>免疫染色アッセイ皿を顕微鏡の下に4倍の倍率で置きます。</li>
	<li>長方形の境界の 1 つの長いエッジ(上記の手順 5.10 で作成)を視野に保持します。その境界に隣接するセルフリースペース内のセルの画像を撮ります。長方形の境界の右長エッジと左の長辺に沿って画像を取得します(図2B)。 注: 長方形に対して斜めに配置されたセルは、開始マークとして短辺または長エッジを選択する際のあいまいさのため考慮されません。また、短辺を越えて移動するセルの数は、多くの場合、(おそらく短辺に沿った開始セルの数が少ないことが原因で) かなり少なく、考慮されません。</li>
	<li>イメージをイメージ J で開きます。ImageJ を使用して、各セルと境界マーク (図 2D)との間の距離を計算します。</li>
	<li>セル数に基して移行を評価するには、取得した画像の境界から特定の距離を ImageJ に設定します。この距離内に存在するセルの数をカウントします。適切なソフトウェアを使用して、平均数、標準偏差、および統計的有意性を計算します。</li>
</ol>

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</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

ここでは、ヒト心室内皮細胞特異的特性の定量的評価を提供する3つのインビトロアッセイについて説明した。これらのアッセイは、ヒト心室内皮細胞とヒトインターニューロンとの相互作用に関する機械論的洞察を得る上で貴重である。リガンド、インヒビター、または遺伝子特異的ノックダウンまたは過剰発現を有する細胞を用いた実験は、内皮細胞誘導ニューロン移動または遠心内皮細胞の長距離回遊性特性を媒介する分子作用器を同定または検証する。これらのアッセイは、生細胞タイムラプス移行試験を行うように改変することもできる。さらに、内皮細胞とインターニューロン以外の細胞との相互作用の証拠がある。我々のグループおよび他の人々からの研究は、投影ニューロンのパターン形成および神経前駆細胞の増殖に対する心室内皮細胞の影響をほのめかしている5,14,15.アッセイの設定を使用してこれらの可能な相互作用をテストすることは興味深いでしょう。最後に、これらのアッセイは、病気の心室内皮細胞の評価のためのプ...

内皮細胞は血管の内層を形成し、血管壁透過性の維持、血流の調節、血小板凝集、新しい血管の形成を含む重要な機能を仲介する。脳では、内皮細胞は脳と血流との間の物質交換を緊密に制御する重要な血液脳関門の一部を形成する1.過去10年間の我々の研究は、脳の発達と行動に重要な意味を持つ脳内皮細胞の新しい神経原性の役割を同定しました2,3,4,5.我々は、マウス胚前脳が、解剖学、起源、および発達プロファイルにおいて異なる2つの異なる血管、第二の血管、心血管および心室血管によって血管化されることを示した。これらの2つの血管サブタイプを裏打ちする内皮細胞は、それらの遺伝子発現プロファイルに明確な違いを示す。ピアリン内皮細胞は主に炎症や免疫応答に関連する遺伝子を発現するが、心室内皮細胞は神経新生、神経細胞移動、化学療法、および軸索誘導体に一般的に関連する遺伝子の発現において一意に富化される。心室外皮細胞はまた、従来の神経神経神経GABAシグナル経路5とは異なる新規GABAシグナル伝達経路を収容する。その遺伝子発現と共に、脳室内皮細胞は、発達中の新皮質におけるGABAergicインターニューロンの移動および分布を調節することが判明した。胚発生中、心室内皮細胞は腹側側側心筋勾配に沿って長距離移動を行い、心室血管ネットワーク2,3を確立する。この回遊経路は、インターニューロンによって1日後にミラーリングされます。移動インターニューロンは、事前に形成された心室血管ネットワークと物理的に相互作用し、新皮質の最終目的地に到達するためのガイドレールとしてそれを使用する。物理的な基質として作用することに加えて、心室内皮細胞は、ニューロンを移動するためのナビゲーションキューの源として機能する。心室内皮細胞分泌GABAガイドインターニューロン移動をガイドし、その最終的な分布パターンを調節する4.ニューロン間移動および分布の欠陥は、自閉症、てんかん、統合失調症およびうつ病6、7、8、9、10などの神経精神障害に関連付けられている。従って、人間の文脈における神経間移動に対する心室内皮細胞機能およびそれらの影響の研究は、これらの疾患の病態に対処するために重要となる。
我々は、人工多能性幹細胞(iPSC)技術12,13を用いて、ヒト胚性幹細胞からヒトの心室様内皮細胞を生成した。ヒト心室外皮細胞がマウスの心室内皮細胞を忠実に模倣しているかどうかを検証し、ニューロン間移動への影響を定量的に評価するために、遠隔移動アッセイ、共培養移行アッセイ、化学誘致アッセイの3つのインビトロアッセイを開発しました。ここでは、これらのアッセイのプロトコルについて詳しく説明します。3つのアッセイはすべて、シリコーン培養インサートの使用に基づいて、セルフリースペースで囲まれたセルの小さな長方形パッチ(固定寸法)を作成します。移動距離は、0日目に輪郭が描かれた矩形パッチの境界から細胞の最終的な位置間の距離を測定することによって評価される。長距離移動アッセイでは、ヒト心室内皮細胞を35mm皿の中心にパッチとして播種し、長い時間にわたって細胞が移動した距離を計算する。共培養移動アッセイでは、ヒト心室内皮細胞を35mm皿に1つのパッチとしてヒトインターニューロンと共播する。このセットアップは、インターニューロンの移動速度に対するこれら2つの細胞型の直接的な物理的相互作用の影響の検査を可能にする。ケモアチーバレンスアッセイは、ヒト心室内皮細胞によって分泌されるケモ魅力的な手がかりに応答して、ニューロン間の移動を測定する。インターニューロンは、ヒトの心室内皮細胞を有する長方形パッチとして播種され、両側に同様のサイズのパッチとして播種された非心室内皮細胞を制御する。各細胞パッチは、500μmの無細胞ギャップによって分離される。インターニューロンの応答は、非心室内皮細胞を制御することと比較して、心室内皮細胞に向かって移動した細胞の数を定量することによって評価される。
これらのアッセイは、ヒトの心室内皮細胞機能およびそれらのニューロン間移動への影響について、強固な評価を提供する。長距離アッセイと共培養移行アッセイの新しいセットアップは、長距離移動の検出を可能にするセンチメートル(約1〜1.5cm)の範囲で無細胞スペースを提供します。他の一般的なアッセイと比較したアッセイの特徴の要約を表1に示します。ここで説明するアッセイは、統合失調症、自閉症、てんかんなどの脳障害のiPSPsCから発生する「病気」の心室内皮細胞およびインターニューロンを評価するためのプラットフォームとして機能する。これらのアッセイは、異なる条件(例えば阻害剤、リガンド、RNAi)が細胞の遊入にどのように影響するかを決定するためにも使用することができる。最後に、これらのアッセイは、長距離移動、化学吸引、または細胞媒介性移動を測定するために、他の細胞タイプに最適化することができます。

<table><tbody><tr><td>アキュターゼ解離液</td><td>ミリポアシグマ</td><td>SCR005</td><td>細胞解離液(脳室周囲内皮細胞用、ステップ1.4)</td></tr><tr><td>抗ヒト&β-チューブリン抗体</td><td>バイオレジェン</td><td>ド802001</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCD31抗体</td><td>ミリポアシグマ</td><td>CBL468</td><td></td></tr><tr><td>抗MAP2抗体</td><td>ニューロミクス</td><td>CH22103</td><td></td></tr><tr><td>抗活性カスパーゼ3抗体</td><td>ミリポアシグマ</td><td>AB3623</td><td></td></tr><tr><td>ヒト内皮細胞の制御</td><td>細胞ダイナミクス</td><td>R1022</td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞の制御 培地サプリメント</td><td>細胞ダイナミクス</td><td>M1019</td><td></td></tr><tr><td>極低温バイアル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>03-337-7Y</td><td></td></tr><tr><td>DMEMF/12 培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>E6 中型</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>33016-015</td><td></td></tr><tr><td>冷凍容器</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>5100</td><td></td></tr><tr><td>GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Human GABA作動性ニューロン</td><td>細胞ダイナミクス</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>ヒト GABA作動性ニューロン ベース</td><td>中 Cellular Dynamics</td><td>M1010</td><td></td></tr><tr><td>ヒト GABA作動性ニューロン 神経サプリメント</td><td>Cellular Dynamics</td><td>M1032</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>コーニング</td><td>356230</td><td>基底膜マトリックス</td></tr><tr><td>取り付け媒体</td><td>ベクトル研究所</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ポリL-オルニチン</td><td>シグマ</td><td>p4957PBS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14190</td><td></td></tr>トリ<tr><td>パンブルー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>トライプル</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>12563011</td><td>細胞解離溶液(GABA作動性介在ニューロンおよび内皮細胞、セクション3および4用)</td></tr><tr><td>VEGF-A</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>VascuLife VEGFミディアムコンプリートキット</td><td>ライフラインセル</td><td>テクノロジーLL-0003</td><td>コントロールヒト内皮細胞培地</td></tr><tr><td>のコンポーネント 2ウェルシリコーン培養-インサート</td><td>同上</td><td>80209</td><td></td></tr><tr><td>3ウェルシリコーン培養インサート</td><td>同上</td><td>80369</td><td></td></tr><tr><td>35 mm ディッシュ</td><td>コーニング</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 円錐管</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>07-200-886</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA 溶液</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル組織培養プレート</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>14-832-11</td><td></td></tr><tr><td>反転位相コントラスト顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>ツァイスAxiovert 40C</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FSX-100</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト幹細胞由来内皮細胞およびgabaergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

神経系の発達と脳障害の病因における脳血管系の役割はますます注目を集めています。我々の最近の研究では、胚発生中の前脳GABAergicインターニューロンの移動と分布に重要な役割を果たす血管細胞、心室内皮細胞の特別な集団を同定しました。これは、細胞自律機能と相まって、統合失調症、てんかん、自閉症などの神経精神疾患の病理における心室内皮細胞の新しい役割を暗示している。ここでは、脳室外皮細胞の機能とGABAergicインターニューロンとの相互作用を一括して評価する3つの異なるインビトロアッセイについて説明した。これらのアッセイの使用は、特にヒトの文脈において、心室内皮細胞と脳疾患との間の関連を同定することを可能にする。これらのアッセイは、シンプルで低コストで再現性があり、あらゆる付着細胞タイプに容易に適合できます。

35 mm 皿の内部にワンウェル カルチャ インサートを設定する手順を図 1に示します。長距離移行アッセイと共培養移行アッセイは、ワンウェルインサートを使用して、ポリL-オルニチン/ラミニンコーティングされた35mm皿の中央に所望の数の細胞を播種した。日目0に、細胞は矩形パッチとして存在していた(図2A、C)。0 日目の画像では、0 日目の線はセル層の鋭いエッジ (図 2Cの白い点線) で簡単に識別できます。48時間までに、細胞は無細胞領域に移行していた(図2B、D)。日後の0画像では、挿入物の周りに描かれた黒い境界線(皿の後ろ)は、黒いギャップとしてはっきりと見える可能性があります。ギャップの端は、0 日目の線 (<strong cl...

我々は、3つの単純なインビトロアッセイ-長距離移動アッセイ、共培養移行アッセイ、および化学誘引アッセイ-それは、ヒト幹細胞由来の心室内皮細胞とその機能を一括して評価するGABAergic インターニューロンとの相互作用.

ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

本プロトコルは、ヒトの脳室内皮細胞の機能とヒトGABAergicインターニューロンとの相互作用をまとめて評価する3つのインビトロアッセイについて説明する。これらのアッセイの結果は、脳内皮細胞と脳障害との間のリンクに重要な洞察を提供します。これらのアッセイは、簡単で低コストで、他の既存のアッセイでは達成できないセンチメートルの範囲で細胞移動の測定を可能にする。GABAergic インターニューロンの移動および分布の欠陥は、自閉症などの精神疾患に関連付けられている, てんかん, 統合失調症とうつ病.したがって、これらの疾患の病因に対処するためには、ヒトの文脈におけるGABAergicインターニューロンとの心室内皮細胞の相互作用を研究することが重要である。まず、アッセイ用のヒト細胞を準備します。ヒト室膜内皮細胞が70〜80%の合流性に達することを許可し、原稿の指示に従ってそれらを解約し、トリパンブルー排除法を使用してそれらを数える。ヒトGABAergicインターニューロンを調製するために、温かい細胞解離液および37°Cのニューロン培地のアリコートを10分間調製する。その後、細胞を含む各ウェルから培地を吸引し、1ウェルあたり1ミリメートルのPBSで洗浄します。ウェルあたり0.5ミリリットルのプリウォーム解離溶液を加え、摂氏37度で5分間インキュベートして細胞を取り外します。インキュベーションの後、ウェルごとに1ミリリットルの神経培地を加え、細胞溶液を15ミリリットルの円錐管に移し、細胞塊を解化するように穏やかに三分化する。細胞を室温で5分間Gの380倍に遠心し、上清を吸引し、1ミリリットルの神経培地で細胞ペレットを再懸濁する。次に、トリパンブルーの除外を使用してライブセルをカウントします。細胞解離液と内皮培地のアリコートを摂氏37度、使用の10分前に温めることで、ヒト内皮細胞をコントロールする準備を行う。各ウェルから培地を吸引し、井戸あたり1ミリリットルのPBSで洗浄します。各ウェルにプリウォーム解離液の0.5ミリリットルを加え、室温でプレートを5分間インキュベートして細胞を取り外します。次いで、解離液を中和するためにウェルあたり1ミリリットルの内皮細胞培地を加え、細胞を15ミリリットルの円錐管に移した。細胞をGの200倍の5分間遠心分離し、上清を吸引し、1ミリリットルの内皮細胞培地で再懸濁する。次に、trypan 除外メソッドを使用してセルをカウントします。滅菌ブレードで2つの井戸シリコーン培養インサートの1つのウェルの3つの側面を切断することによって1つのウェル培養インサートを準備します。無菌ピンセットで挿入物を取り外し、ポリL-オルニチンとラミニンコーティングされた皿の中央に置き、挿入物の端に沿って押して表面に固定します。慎重にチップがしっかりと付着していることを確認するために皿を逆さまにし、超微細な先端を持つ永久的な闇市場を使用して挿入コンパートメントの境界をマークします。神経細胞培地およびヒト脳室内皮細胞および内皮細胞培地中のヒトGABAergicインターニューロンを、70マイクロリットル当たり30,000個の濃度で中断し、その後、各ウェル培養挿入物の中に70マイクロリットルの細胞溶液を播種する。ニューロン皿に1ミリリットルの神経培地を加えて、挿入物の周りの領域を満たし、コーティングが乾燥するのを防ぎます。同様に、心室内皮細胞皿に1ミリリットルの内皮細胞培地を加える。顕微鏡下で細胞をチェックして、挿入コンパートメントから漏れていないことを確認し、摂氏37度と24時間5%の二酸化炭素でインキュベートします。インキュベーション後、顕微鏡下で細胞をもう一度確認し、適切に取り付けられていることを確認します。播種後48時間後、無菌ピンセットで挿入物を静かに取り除き、顕微鏡下の細胞をチェックして、細胞層が乱れなくままであることを確認します。ニューロンと心室内皮細胞皿の両方から培地を取り除き、各皿に新鮮な培地を1ミリリットル加えます。5日間、摂氏37度、炭酸ガス5%で細胞をインキュベートします。その後、培地を取り出し、4%PFAで細胞を10分間固定し、PBSで3回洗浄します。共培養アッセイを行うには、30,000個のGABAERG性インターニューロンおよび30,000個のヒト心膜内皮細胞を70マイクロリットルの共培養培地で中断し、この細胞溶液を1つのウェルインサートコンパートメント内に播種する。48時間後、挿入物を取り外します。共培養を摂氏37度、炭酸ガス5%5%で5日間インキュベートします。インキュベーション後、培地を取り出し、細胞を4%PFAで固定し、PBSで3回洗浄します。化学引力アッセイを実行するには、ポリL-オルニチンとラミニンコーティングされた35ミリメートル皿の中央に3つのウェルカルチャーインサートを配置し、皿を逆さまにし、超微細な先端を持つ永久的なマーカーを使用してインサートの中央コンパートメントの周りの境界をマークします。種子30,000GABAERGICインターニューロンは、中間コンパートメント内の神経培地の70マイクロリットルで、次いで、2つの外側のコンパートメント内の各培地の10、000個の心膜内皮細胞および10,000の制御内皮細胞および70マイクロリットルを制御する。皿の側面に沿って1ミリリットルの共培養培地を加えて、皿のコーティングが乾燥するのを防ぎます。48時間後、インサートを取り出し、37°Cで細胞をインキュベートし、36時間二酸化炭素を5%でインキュベートします。インキュベーション後、培地を取り出し、細胞を固定し、PBSで3回洗浄します。遠距離および共培養移行アッセイは、心室内皮細胞とGABAergicニューロンとの相互作用を調べるのに使用された。長距離移動アッセイでは、細胞はゼロ日目に長方形のパッチとして始まったが、48時間までに無細胞空間に移行した。アポトーシスのマーカーである抗活性カスパーゼ-3抗体による免疫細胞化学的染色は、シードニューロンにアポトーシスシグナルを示さなかった。共培養移行アッセイでは、インターニューロンをヒト心膜内皮細胞と共播させた場合、ニューロンは、インターニューロンが単独で播種されたとき、または対照内皮細胞と共播したときと比較して、より遠い距離を移動した。化学誘引アッセイでは、内皮細胞の制御と比較して、心膜内皮細胞に向かって移行したインターニューロンの数が有意に多く、GABAergicインターニューロンが、骨膜上皮細胞によって分泌される化学魅力的なキューに選択的に反応することを確認した。これらのアッセイはリガンド、阻害剤またはアッセイアネスを使用して修飾することができ、ヒトの心室内皮細胞とヒトのインターニューロンとの相互作用に対する機械的な洞察を得ることができる。彼らはまた、私たちのグループや他の人によって報告されるように、他の神経細胞とのヒト室周膜内皮細胞の相互作用を研究するために使用することができます.この手順を試みるとき、皿の上にしっかりと挿入物を固定し、アッセイ全体を通して邪魔されずに保つことが重要であり、そうでなければ、細胞漏れ、細胞剥離または引き出された境界を持つ挿入物のずれにつながる可能性があります。我々の研究は、統合失調症、てんかんおよび自閉症のような精神疾患の病因におけるヒト心室内皮細胞の細胞自律的役割を示している。したがって、これらのアッセイは、IPSC技術を用いてこれらの障害を有する患者由来の疾患性骨膜内皮細胞の評価を可能にする。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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新しい共培養法を用いた軸索の成長に関する研究グリア細胞の不均一性の影響

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介在ニューロンと脳室内皮細胞との共培養の確立

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共培養におけるグルタミン酸作動性ニューロンと神経膠腫細胞の相互作用の評価

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脳室周囲内皮細胞からの化学療法引力の手がかりに対する介在ニューロン応答の評価

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共培養モデルの組み込みGABA作動性中型有棘ニューロンおよびHEK293細胞における抑制性シナプスの形成を安定的にGABAを表現 A受容体

神経膠芽腫幹細胞 (GSCs) のグリア分化を促進する小さい分子の同定の効率的なスクリーニングのプロトコルが表示されます。アッセイは、人間の GFAP プロモーターによって強化された GFP (eGFP)...

流れの Cytometry ベースの医薬品スクリーニング システム神経膠芽腫幹細胞の細胞分化を促進する小さい分子の同定に関する研究

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住セルイメージ投射アッセイ研究神経膠腫脳腫瘍幹細胞の遊走と浸潤に

ここでは、ヒトグリオーマ細胞(hGC)移行をリアルタイムで研究するためのex-vivo混合単層培養システムを提示する。このモデルは、区画化されたチャンバー内のhGCと骨髄化した軸索と非骨髄化軸の間の相互作用を観察する能力を提供する。...

後根神経節軸軸索-オリゴデンドロサイト共培養におけるヒトグリオーマ細胞移動のリアルタイムモニタリング

本プロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞を分化して得られる脳内血管内皮細胞を導き出し、拡大、および凍結保存し、 また、ex vivo...

ヒト人工多能性幹細胞由来脳微小血管内皮細胞の誘導、拡大、凍結保存および特性評価

ここでは、パターン化されたニューロン上で神経膠芽腫(GBM)の移行を分析するための使いやすい共培養アッセイを提示する。我々は、ニューロン上のGBM細胞移動を容易に定量化するためのFiJiソフトウェアでマクロを開発し、ニューロンがGBM細胞侵襲能力を変更することを観察した。...

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最近の研究では、高等度の小児神経膠腫(pHGG)細胞とそれらの相互相互作用に対する神経細胞の影響を明らかにする。本研究は、イン ビトロ...

グルタミン酸ニューロンと小児の高品位グリオーマ細胞の微小流体デバイスへの共培養による電気的相互作用の評価

学ぶヒト幹細胞由来内皮細胞とGABAergicニューロンの相互作用を評価する3種類のin vitroアッセイ。長距離移動、共培養、化学誘引アッセイにより、神経発達と精神疾患の病態解明に貢献する簡便で低コストな手法を確立する。

ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

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