老化脳の収集、処理、特徴付けのためのアッビアテグラッソブレインバンクプロトコル
June 3rd, 2020
このプロトコルは、脳の寄付プログラムと脳の適切な特性を通じて個々の脳老化軌道を追跡する方法を記述する。脳のドナーは、連続多次元評価を含む長期的な縦断的研究に関与しています。プロトコルは、脳処理の詳細な説明と正確な診断方法論が含まれています。
神経認知障害の有病率が継続的に増加するにつれて、私たちの目的は、正確な診断を達成し、神経変性メカニズムに光を当てるために質の高い脳組織サンプルを取得し、特徴付け、保存することです。脳のアサイメトリーを考慮すると、私たちのサンプリング方法論は、すべてのメタ研究を両方の半球から組織学的に明確に定義された組織に対して行うことを可能にし、多くのデータを深層学習を通じて収集し、相関させることができる。複数の病理による脳障害に対する付加的な影響が頻繁に観察される。
明確な診断には、臨床症候群と神経病理学的知見を組み合わせて、疾患の病因を発見し、可能な治療法を必要とする。新鮮な切断手順とマクロセクション管理は難しいだけでなく、良い結果を得るためにも不可欠です。この困難を克服するには、訓練を受けたタイトなチームが不可欠です。
私たちのプロトコルには哺乳類の器用さが必要な一連のステップが含まれているため、視覚的なデモンストレーションは、これらの技術を習得したい研究者のための説明的なテキストよりも有用であり得る。また、超音波検査を確認した後、鋭いメスを使って、一方の側の乳ソイドプロセスの先端から他方の側に毛髪の皮膚と皮下組織を通して頭皮切開を行い、頂点を通過させる。頭皮の2つの折り目を頭蓋骨から慎重に分離し、黄色の超軌道脂肪が見えるまで切開を続ける。
頭皮を前に反射し、後に組織の他の部分を引っ張ります。メスと鉗子を使用して、頭蓋骨の両側の側頭筋の小さなサンプルを収穫し、1つの標本を4%ホルムアルデヒドに、もう1つの標本を摂氏4度に置く。電気鋸を使用して、正面側のVカットで頭蓋骨を切断し、頭蓋骨を取り除きます。
髄膜を切断した後、固定のための硬膜の1片と凍結のための別の部分を収穫します。3番目の心室に到達するために、脳梁を通して10ミリリットルの注射器に取り付けられた20ゲージ3.5インチの針を挿入し、プランジャーを引き込んで約10ミリリットルの脳脊髄液を得る。流体の外観の色と濁度を評価し、pHを測定します。
脳を持ち上げるために両前頭葉をそっと引っ張り、眼内神経インファンディブラム、内頸動脈、第3、第4、第5、第6頭脳神経の両方を切断する。後部フォッサに到達するために、テトリウムをカットし、椎骨動脈と下頭蓋神経を切断します。その後、メスを孔マグナムを通してできるだけ深く挿入して、メデュラの最も大きな部分を切断し、慎重に脳全体を取り除きます。
メスを使用してメッケルの洞窟の上の骨に見え、固定と凍結のために両側からガッセリアン神経節を収集します。外科用マレットとチゼルを使用して骨のセラ・ターシカを骨折し、4%ホルムアルデヒドの固定のために下垂体を取り除きます。巨視的な変化と血管の変化から頭蓋骨と脳全体を検査します。
測定テープを使用して、脳の横方向および前姿勢の直径を測定し、スケールで脳の重量を量ります。ウィリスの円を慎重に取り出し、解剖学的な評価を行い、解剖学的変異体、病変、血管狭窄の有無を評価します。組織を個別に計量する前に、大脳、小脳、脳幹を分離して検査します。
凸からレプトメニンジュの1〜2〜4センチメートルの正方形の部分を取り除き、完全な高グルコースDMEM培養培地でサンプルを摂氏4度で保存します。4%ホルムアルデヒドで固定のための松葉腺を収穫し、各ペアの1つの固定と凍結のための嗅球と視神経を取り除きます。大脳、小脳、脳幹を摂氏4度の氷の上に置きます。
目的の組織のすべてが収穫されている場合は、骨を再び取り付け、手術針を使用するためにスーパー接着剤接着剤を使用し、頭皮を縫い戻すために非吸収性縫合糸を使用します。脳バンク解剖のために切除ナイフを使用して脳幹を軸に切断し、上のコリカルを通して鼻孔中脳のレベルで最初のカットを行い、実質的なニグラを露出させるために2つのスライスを得る。脳幹を10ミリメートルに切り、4番目の心室の上部マージン付近のロストラルポンを通過するカットを含むように注意し、軌跡を観察し、音響線に劣る髄膜長体を通り抜け、第4心室の下頂部のすぐ上に置き、下側核を含むスライスを得る。
すべてのスライスに、脳幹の BS としてラベルを付け、その後にアラビア数字を付けます。最後の脳幹セクションの後、脊髄の指定SCを使用し、その後にアラビア数字を続けて使用します。矢状平面上の小脳を切断して、2つの小脳半球をベルミのレベルで分離し、矢状切除を行い、各半球から5つのスライスを得る。
ベルミのすべてのスライスに、それぞれ右および左小脳のCBRまたはCBLという名前を付け、アラビア数字を使用して各セクションを識別します。次に、射手結節面のコーパス梁を通して大脳の2つの半球を分離し、前頭葉側極、前側のcingulate、前部堆積、前方のコリスル、補助的な核、および基底核を通って、眼窩の円錐体との間を通過する冠状平面に沿って単独で半球をスライスする。約1センチメートルの後部が骨髄体を通過し、大脳基底核、視床前視床、扁桃体を露出させる。
各半球に対して15〜21センチメートルのスライスが得られるまで、前部および後部領域を解剖するためにスライスを続ける。前頭部から後頭部までの前後方方向の元の位置に従ってスライスを平らな面に置き、前のスライドを上向きに連続した部分にします。すべてのスライスが配置されたら、以前に取得したセクションと海馬、頭頂部および後頭部セクションを含む組織病理学のために固定される主要なセクションを選択し、スライスを固定するか凍結するかを示すラベルを含むアラビア数字が続くLまたはRとしてスライスにラベルを付ける。
すべての組織が切断され、ラベルが付かれたら、固定または凍結する前に、セクションの各シリーズの画像を取得します。サンプルを凍結するには、予約された代替組織セクションをあらかじめ凍結したアルミニウムトレイに置き、それらを平らに保つためにインターロックされたアルミニウム板でセクションを覆います。その後、液体窒素でスライスを3分間凍結してから、冷凍サンプルに対応する識別コードとスライス番号がラベル付けされたビニール袋の中に入れ、適切な極低温ボックスに80°Cで保管します。
サンプルを固定するには、ガーゼの個々の部分に予約された代替組織セクションを配置し、4°Cの冷たい部屋で5日間の10%リン酸緩衝ホルマリン溶液にスライスを置きます。収穫された27の脳のうち24は、明確な臨床病理学的診断を伴う完全な神経病理学的特徴付けを受けた。一連の36の脳ドナーの予備的定量的脳波分析は、主要な神経認知障害において主要なαリズム率が、通常の高齢軽度の神経認知障害よりも有意に低いことを示している。
ここでは、非対称的な病理の例が、左と比較して右の冠動脈セクションで観察された重度の心室拡張と共に、マクロ的に明らかな右側萎縮を示す。別の症例は右半球の梗塞を示し、別の標本は右骨髄体の明確な萎縮を示す。マクロセクションは、ミエリンの喪失または半球内の免疫反応性の分布を同定するために染色することができる。
これらのサンプルは、エピジェネティックおよび環境要因のために異なる時間枠でアルツハイマー病の臨床発症を持っていた双子からである。それにもかかわらず、顕微鏡分析は、高いアルツハイマー病病病理およびアミロイド血管症を示す非常に類似した神経病理学的画像を明らかにした。しかし、これら2つの患者では、アルツハイマー病の同じ臨床診断は、複数の病因における認知症デュオを明らかにした神経病理学的特徴と正確に一致しなかった。
確かに、最初のケースは、回の単一の嘘と実質的なニグラでレビー体を提示しました。そして2番目の症例は、扁桃体と副核におけるレウィ神経突起に関連するレビー体を示した。スライスの写真は、顕微鏡分析中に解剖学的領域を正確に識別するために慎重に行われます。
単一スライスの固定および凍結は、組織微細構造Omics遺伝子活性化とタンパク質分布の地形を維持し、これらのデータを組織病理学と相関させる上でも重要である。細胞培養物は、十分に特徴付けられる組織から、病態の病態に関する調査も行う。常に十分な個人的な保護具を着用する既得脳組織は感染の可能性があると考えられ、鋭利な器具や液体窒素などの危険なツールの使用が必要であるため。
概要
このプロトコルは、脳ドナープログラムを通じて個々の脳老化の軌跡を追跡する方法を概説し、脳組織の適切な特徴付けに焦点を当てています。高品質の組織サンプルを得るための包括的な処理と診断方法を説明しています。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 神経変性メカニズム
- 脳老化
背景
- 神経認知症の有病率が上昇しており、正確な診断には質の高い脳組織が必要です。
- 縦断的研究では、包括的な理解のために多次元評価が利用されています。
- サンプリング方法論は、効果的なメタ研究のために脳の非対称性の考慮を統合しています。
- 複雑な脳解剖プロセスをナビゲートするために、訓練されたチームは不可欠です。
研究の目的
- 神経変性疾患の診断のために脳組織を特徴付け、保存すること。
- 包括的な分析を通じて疾患の病因と潜在的な治療法を探索すること。
- 脳組織の採取と保存のための堅固な方法論を確立すること。
使用される方法
- このプロトコルには、詳細な脳の処理と保存技術が含まれています。
- 様々な脳領域の慎重な解剖と脳脊髄液の収集が含まれています。
- この方法論は、脳処理タスクに必要な精度のために訓練されたチームの使用を強調しています。
- 技術の習得を向上させるために、研究者への視覚的デモンストレーションが提案されています。
主要な結果
- 詳細な方法論により、様々な病理を通じて一貫した高品質の脳サンプルの採取が可能になります。
- このプロトコルは、脳の解剖学的および病理学的変化のより良い理解を促進します。
- 臨床症候群と神経病理学的所見の統合が、確定診断のために強調されています。
結論
- この研究は、神経変性疾患の診断と研究を強化できる脳組織の特徴付けのための効果的なプロトコルを示しています。
- 将来の脳老化研究のための正確な採取技術の重要性を強調しています。
- この発見は、脳の健康と潜在的な治療介入の理解に重要な意味を持っています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol supports target validation in neurodegenerative disease research by enabling histologically well-defined tissue collection from both hemispheres, facilitating mechanistic de-risking through correlated omics and pathology data. It enhances predictive confidence in preclinical models by providing neuropathologically verified human brain samples linked to longitudinal clinical and lifestyle data. The approach strengthens translational continuity by integrating ante-mortem phenotyping with post-mortem neuropathology, reducing biological uncertainty in target selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct comparison of frozen and fixed tissue from contralateral hemispheres for omics and histology alignment.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing neuropathologically confirmed tissue to validate target engagement and pathway modulation.
- Strategic Value: Improves target confidence by linking clinical syndrome with definitive neuropathological diagnosis, reducing false-positive target assumptions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares well-characterized brain tissue for biomarker assay development using histologically defined regions from both hemispheres.
- Operational Value: Enables assay standardization through reproducible tissue processing and fixed/frozen pairing for cross-platform validation.
- Strategic Value: Enhances screening readiness by supplying qualified human tissue for target-based and phenotypic screening cascades.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by providing human tissue with matched clinical and neuropathological profiles for target validation.
- Operational Value: Supports preclinical continuity by allowing omics studies on histologically validated tissue, improving biomarker translatability.
- Strategic Value: Enables risk-adjusted advancement decisions through mechanistic de-risking using human-derived pathological and molecular data.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supplying validated human brain tissue for target identification, assay development, and preclinical validation stages, particularly in neurodegenerative programs requiring pathological confirmation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling molecular analysis of histologically defined brain regions linked to clinical phenotypes.
- Screening: Enhances assay readiness through standardized tissue preservation and longitudinal donor data for reproducible biomarker measurement.
- Analytics: Generates quantitative neuropathological and omics readouts that enable cross-condition comparison and target prioritization.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical validation by providing human tissue with verified pathology, improving predictive modeling of target modulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue characterization pipeline for longitudinal neurodegenerative studies across multiple therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through neuropathologically verified human tissue.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via paired fixed/frozen processing and detailed labeling protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing pathological confirmation to de-risk targets before preclinical investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by integrating clinical, lifestyle, and neuropathological data for target validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, neuropathology, and aseptic tissue handling for proper dissection and preservation.
- Depends on instrumentation including scalpels, saws, forceps, cryogenic storage, and formalin fixation systems.
- Necessitates cross-team standardization between clinical coordinators, neuropathologists, and molecular biologists for consistent data collection.
- Involves adaptation considerations for different brain regions and pathologies due to asymmetric disease distribution.
- Limited by geographic donor availability and resource intensity of longitudinal clinical assessment and neuropathological processing.
