Name: 細菌性ウィルト病の簡単な遺伝子解析のためのラストニア・ソラナセアラムによるトマト根形質転換 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学ぼう、トマト根形質転換とRalstonia solanacearum接種による細菌性ウィルト病の遺伝子解析法。簡便な操作で設備が少なくても迅速に遺伝子発現操作とアッセイが可能です。

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マッチョ研究所の研究室メンバーの皆さんに、有益な議論、統計アドバイスのためのアルバロ・ロペス・ガルシア、そしてこの作業中の技術的および管理的支援のための新宇建に感謝します。我々は、蛍光イメージングの支援のためのPSC細胞生物学のコア施設に感謝この研究は、中国科学アカデミーの戦略的優先研究プログラム(助成金XDB27040204)、上海植物ストレス生物学センター(中国語)科学アカデミー)と中国の1000タレントプログラム。

注:この方法の重要な部分は、インビトロで植物材料を取り扱うことを含むので、DsRed蛍光の可視化を含むすべてのこれらの手順の間に無菌状態を維持することが重要です。すべての変換プロセス中に、トマトの苗は25-28 °Cおよび16時間/8時間のライト/ダーク(130 μmol光子m-2s-1光)で成長する。プレートは、ガス交換および蒸散を容易にするためにマイクロポアテープで密封されています。
1. トマト植物とアグロバクテリウム根茎遺伝子の調製
<ol><li>殺菌トマト種子(ソラナムリコペルシカムcv.マネーメーカー、LA2706、トマト遺伝学リソースセンター、TGRC)5%(v/v)次亜塩素酸ナトリウム5分間洗浄し、蒸留滅菌水で4-5回洗浄し、種子を1晩以上にわたって滅菌水でゆっくりと揺らし続けます。</li>
	<li>トマトの種をスクロース(2.21 g/L MS、8%w/v寒天)なしで半強度の村重とスクーグ(1/2 MS)培地に移します。25-28 °Cの暗闇の中で3日間シーズを保ちます(図1A)。 注:通常、各構成体に必要な種子は約40種です。</li>
	<li>オートクレーブ8.5 cm2平方フィルターペーパー。正方形のフィルターペーパーを9 cm2の正方形のシャーレの中に入れて(寒天の上に紙を置く)、各プレートに6つの発芽トマトの種を置く(図1B)。プレートをマイクロポアテープで密封し、発芽した種子を25-28°Cで3〜4日間インキュベートします。</li>
	<li>植物の形質転換の2日前に28°Cで固形LB培地中のアグロバクテリウム・リゾゲネスMSU440を成長させる。 注:A.リゾゲネスは、フアン・アントニオ・ロペス・ラエス博士、EEZ-CSIC、グラナダ、スペインによって提供されています。この記事で説明した実験では、pK7GWIWG2_II-RedRoot::CESA6または空のベクターを含むA.根茎遺伝子を制御として使用した。pK7GWIWG2_II-RedRootは、シロイヌナプシス・タリアナ・ユビキチンプロモーター(pAtUBQ10)によって駆動されるレポーター遺伝子DsRedを含み、スペクチノマイシン(50μg/mL)に対する耐性を与える。5より前に報告されているように、遺伝子過剰発現に他のベクターを使用することが可能です。本研究では、SlCESA6サイレンシングに特異的な断片の増幅を、トマト(S.リコパルシカムcv)から単離したRNAを用いた逆転写(RT)PCR法により得られ、p-ENTR/D-TOPOベクターに連結した(表1)。続いて、SlCESA6-RNAiフラグメントをpK7GWIWG2_II-RedRootバイナリベクターにクローン化した。</li>
</ol>2. プラントの変換と選択
<ol><li>無菌メスを使用して、トマト苗のラジクルと低コチルの底部を切断する(図1C,D)。</li>
	<li>プラスチックチップまたはメスの刃を用いてLB培地の表面からA.リゾゲネスバイオマスを収穫し、切断されたトマト苗を細菌バイオマスに慎重に浸す(図1E)。</li>
	<li>A.根茎遺伝子で接種した後、トマトの苗を2cm x 4cm半円形のフィルター紙(図1F)で覆い、高湿度を維持し、生存と新しい根の開発を容易にします。</li>
	<li>6-7日間の変換トマトの苗を保存します。次に、無菌メスを使用して新しい毛深い根(図1G,H;このステップでは根はまだ変換されていません)をカットし、苗が新しい毛深い根を作り出すことを可能にします。</li>
	<li>第2世代の毛深い根が現れたら(図1I)、苗の上にフィルターペーパーを取り除き、再びマイクロポアテープでプレートを密封します。 注: この時点で、変換ベクトルに DsRed 蛍光マーカーが存在することで、新しいルートの変換効率を視覚化できます。</li>
	<li>DsRed蛍光を可視化するには、生体内イメージングの植物に対して立体顕微鏡またはその他の装置を用いる(図1J)。陽性(赤色蛍光)変換された根をマークし、無菌メスを使用して陰性の非形質化された根(赤い蛍光なし)を除去します。</li>
	<li>赤色蛍光を示す苗を1/2MS培地を含む新しいプレートに移し、変換された根を主根として開発しやすくする(図1K)。同じプレートに赤色蛍光を示さない苗を保管し、後の時点で蛍光根(図1L)の出現を確認します。</li>
	<li>抗生物質の選択に基づく代替方法<ol>
<li>ステップ2.5の代わりに、適切な抗生物質で1/2 MS培地を含む半分充填された9 cm 2平方プレートを調製する。調製プロセス中にプレートを約5°傾斜させて、培地なしで空きスペースを生成し(図2A)、抗生物質との接触を避けて芽を成長させます。</li>
		<li>ステップ2.6の代替として、最初の非変形毛深い根を切断した後(ステップ2.4)、適切なサイズのフィルターペーパーを使用して根のない苗を半分充填されたプレートに移す(図2B)。 注意:陽性対照として、同じ抗生物質耐性とレポーター遺伝子を含むプラスミドを持ついくつかの苗を変換することをお勧めします(このプロトコルでは、pK7GWIWG2_II-RedRoot;カナマイシン50 μg/mL)。</li>
		<li>ステップ2.7の代替として、苗が新しい毛深い根を開発し、これらの根が抗生物質の選択を避ける可能性があるため、フィルターサンドイッチペーパーの表面に直接接触していないそれらの根を切断させる。 注:抗生物質の効果により、根の発生は抗生物質のないプレートよりも遅くなる可能性があります。新しい変換された毛深い根は、半満たされたプレートに根のない苗を移した後、14〜18日以内に現れます(ステップC-E2.8.2)。</li>
	</ol></li>
	<li>苗を2cm x 4cm半円のフィルターペーパーで覆い、プレートを密封し、苗をインキュベートして新しい毛深い根を開発できるようにします。 注:抗生物質を使用してA.根茎を排除する必要はありません。MS培地の上のろ紙とスクロースの欠如は、プレート5上のA.根茎遺伝子の広がりを阻害する。</li>
	<li>最初のルート選択から 5 ~ 7 日経過した後、選択プロセスを繰り返して新しい変換されたルートを選択し、変換されていないルートを削除します。1/2 MS培地を含む新しいプレートに、変換された根を含む苗を移します。</li>
</ol>3. 接種ポットへの移行
<ol><li>根の表面が細菌の接種物にさらされる接種ポットを準備する:水で接種ポットを浸し、余分な水を注ぎ、プラスチック製の植栽トレイに入れます。ピンセットを使用して、根を変換した苗を接種ポットに移します(図3A)。</li>
	<li>ラップまたは透明な蓋でトレイを覆い、25-28 °Cおよび65%の湿度(16時間/8時間光/暗い;130 μmol光子m-2s-1光)に保ち、高レベルの湿度を維持します図3B)。5~6日後にカバーを取り外します。 注:変換されたトマトの植物は、土壌にそれらを転送した後、2〜3週間の接種の準備ができています(図3C)。土壌上の成長中に、トマトの植物は、変換されていない新しい根を生成することができます。この現象の程度を決定するために、赤色蛍光を3週齢形転換トマト植物の根で可視化した。ほとんどの根(80%-100%)赤色蛍光を示し、それらが実際に変換されていることを示す(図3D,E)。</li>
</ol>4. 土壌びしょ濡れの接種
<ol><li>28°Cの軌道シェーカー(200rpm)で、28°Cのピリキッド媒体(表211)でR.ソランサーム(このプロトコルでは株GMI1000)を定常相まで成長させます。</li>
	<li>細菌培養物の光学密度を600nm(OD600)で測定して600細菌数を決定する。0.1のOD600に水で細菌培養物を希釈します(ここで使用される条件では、これは約108コロニー形成単位[CFU]/mLに相当します)。</li>
	<li>変換されたトマト植物を含む16-20の接種ポットを接種トレイ(29 cm x 20 cm)に入れます。図 4A)</li>
	<li>接種ポットを含むトレイに細菌接種(0.1のOD600)の300 mL(植物当たり15 mL〜15 mL)を注ぎます。彼らに20分間接種を浸して下す(図4B)。</li>
	<li>ポッティング土壌の層で新しいトレイを準備します。接種されたポットを新しいトレイ(図4C)に移し、湿度75%、26-28°C、12時間光と12時間の暗闇(130 μmol光子m-2s-1光)の成長チャンバーにトレイを置きます。</li>
</ol>5. 感染パラメータの決定と統計解析
<ol><li>前述の12,13,13に従って疾患症状をスコア付けし、0(症状なし)から4(完全なしおれ)(図4D-H)の範囲のスケールを使用して、ラルストニア接種後毎日2週間の間に。 注:疾患指数データは、同じ実験ユニット(各植物)から時間の経過とともに収集されます。</li>
</ol>6. 遺伝子発現解析
注: トランスジーンの発現または標的遺伝子のサイレンシングは、RT-PCR または定量的 RT-PCR (qRT-PCR) によって決定できます。
<ol><li>サンプルを収集し、変換された根系の代表的な部分からRNAを抽出します(標的遺伝子への影響を評価する)と葉(内部制御として)。</li>
	<li>DNase処理RNAの1 μgを使用してcDNAを合成します。</li>
	<li>qRT-PCRにより標的遺伝子の遺伝子発現を解析する。2-ΔΔCT法14を用いて相対転写レベルを算出し、SlEFα-1をハウスキーピング遺伝子15として用いた。 注: プライマー シーケンスは、表 1に示します。</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Wilt+in+China%3A+History%2C+Current+Status%2C+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives.</a> Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549(2017).</li>
<li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+plant+pathology%22%5BJournal%5D)">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li>
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<li>Sang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ralstonia+solanacearum+type+III+effector+RipAY+targets+plant+redox+regulators+to+suppress+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).</li>
<li>Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversification+of+the+GALA+type+III+effector+family+contributes+to+Ralstonia+solanacearum+adaptation+on+different+plant+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts.</a> New Phytologist. 192, 976-987 (2011).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assignment+to+positively+selected+sites+in+the+core+type+III+effector+RipG7+from+Ralstonia+solanacearum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum.</a> Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>León-Morcillo, R. J., Martín-Rodríguez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+activation+of+the+9-oxylipin+pathway+during+arbuscular+mycorrhiza+formation+in+tomato+and+its+regulation+by+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).</li>
<li>Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retire+statistical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retire statistical significance.</a> Nature. 567, 305-307 (2019).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ラルストニア・ソラナ科は農業に対して重要な脅威を与えている。しかし、農業の重要性の自然の宿主との相互作用は、特に作物植物種において、他の細菌病原体と比較してまだ十分に理解されていない。ほとんどの場合、遺伝的解析は、宿主植物を遺伝的に改変するために必要な時間と費用によって妨げられる。この問題に対処し、トマトにおけるR.ソラナ科の感染の遺伝子解析を容易にするために、我々はトマト根のアグロバクテリウム・リゾゲネス媒介性形質転換に基づく容易な方法を開発した(図1)、続いて土壌びしょ濡れの接種(図3)。変換された根は蛍光レポーター(このプロトコルではDsRed)を使用して選択される(図1)。また、非変形した空中部分に損傷を与えない抗生物質の選択に基づく代替方法も開発しました(図2)。
変換プロトコルは、...

細菌性萎痛病の原因物質であるラルストニア・ソラナ科は、ジャガイモ、トマト、タバコ、バナナ、コショウ、ナスなど、植物種の広い範囲に感染する可能性のある世界的な分布を有する壊滅的な土壌媒介血管病原体1,である。ラルストニアによって引き起こされる収量損失は、品種、気候、土壌および他の要因に応じて、トマト、ジャガイモまたはバナナの生産の80-90%に達することができます3.しかし、ラルストニアモデルは、シュードモナスシリンガエやキサントモナス属などの細菌性植物病原体を含む他のモデルと比較してかなり未踏である。さらに、植物と微生物の相互作用のほとんどの研究は、モデル植物シロイヌナズナ科に焦点を当てています。これらのモデルを用いた研究は、植物と細菌の相互作用の理解に大きく貢献していますが、作物植物におけるこれらの相互作用を理解する現在の必要性には対処していません。ラルストニアと作物植物の相互作用を理解することを目的とした研究は、細菌性萎し病と戦うために持続可能な解決策を開発するために不可欠であるが、現在、相互作用の異なる構成要素を特徴付けるための簡単な実験アッセイの欠如によって妨げられている。特に、ラルストニアの天然宿主であるトマトは、世界で2番目に重要な植物作物であり、細菌性萎し症を含む多くの疾患4の影響を受ける。本研究では、トマトのラルストニア感染の遺伝子解析を行う簡素な方法を開発した。この方法は、トマト根のアグロバクテリウム-媒介性形質転換に基づいており、DsRed蛍光を選択マーカー5として使用し、続いて得られた植物のラルストニア土壌びしょ濡れの接種を行い、目的の構築物を発現する形質転換された根を含む。根形変換アッセイの汎用性により、RNAiによって媒介される遺伝子過剰発現または遺伝子サイレンシングのいずれかを行うことができます。
この方法の潜在的な制限は、非変換された根の残留成長に基づいて行われます。これは、使用されるプラスミドが変換された根の選択を可能にするレポーター遺伝子を欠いている場合に特に重要である。この問題を解決するために、我々は、健康な抗生物質耐性形質転換根の成長を可能にしながら、非形質化された根の成長を阻害する抗生物質選択に基づく代替方法を開発した。A.根生は芽の変態を誘発しないので、抗生物質の影響を受けやすく、したがって、抗生物質含有培地から分離しておくべきである。
ラルストニアに対する植物耐性はよく理解されていないが、いくつかの報告は、細菌のしおれ,6、7、8、97に対する耐性の強化に関連する細胞壁の変化を有する。8,96これらの細胞壁の変化が血管の発達に影響を及ぼすことが示唆されている、 植物10内のラルストニアの生活様式に不可欠な側面。シロイヌナズナのセルロース合成酵素CESA4、CESA7およびCESA8をコードする遺伝子の突然変異は、二次細胞壁の完全性を損なうことを示しており、これはABAシグナル伝達8に関連していると思われるラルストニアに対する耐性の増強を引き起こす。 CESA4そこで、我々の方法の概念実証として、SlCESA6(Solyc02g072240)、Solyc02g072240セルロース合成酵素の二次細胞壁セルロースシンターゼ、およびAtCESA8のオルソログ(At4g18780)のRNAi媒介遺伝子サイレンシングを行った。 SlCESA6その後のラルストニアによる土壌びしょ濡れの接種は、SlCESA6をサイレンシングする細菌性萎し症状に対する耐性が高まることを示し、ラルストニアに対する細胞壁媒介性耐性がトマト中で保存される可能性が高いことを示唆し、トマト根における細菌性萎し耐性の遺伝子解析を行う方法を検証した。ここでは、この方法を詳細に説明し、比較的短時間で、機器や植物の成長空間の要件が小さい細菌性萎し病を理解するための遺伝的アプローチを可能にする。

<table><tbody><tr><td>90 mm角シャーレ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>寒天粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>BD (Becton and Dickinson)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カサミノ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>濾紙</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジフィーポット</td><td>ジフィープロダクツインターナショナルA.S.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロポアテープ</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ムラシゲ&スクーグ メディウム (M519)</td><td>Phytotechlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピンドストラップ 基材</td><td>ピンドストラップ モーズブルグ A/S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メスとブレード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>次亜塩素酸ナトリウム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌クリーンベンチ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wahtman paper</td><td>Wahtman International Ltd. Maldstone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>OXOID</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

細菌性ウィルト病の簡単な遺伝子解析のためのラストニア・ソラナセアラムによるトマト根形質転換

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

ラルストニア・ソラナ科は、広範囲の植物種に感染し、農業に対する重要な脅威を引き起こす壊滅的な土壌媒介血管病原体です。しかし、ラストニアモデルは、シロイヌナプシスのシュードモナスシリンゲのような細菌性植物病原体を含む他のモデルと比較してかなり未踏である。ラルストニアと作物植物の相互作用を理解することを目的とした研究は、細菌性萎し病と戦うために持続可能な解決策を開発するために不可欠であるが、現在、ネイティブホスト植物における相互作用の異なる成分を特徴付ける簡単な実験的アッセイの欠如によって妨げられている。このシナリオでは、我々は、トマトのラルストニア感染の遺伝子解析を行う方法を開発しました,ラルストニアの自然なホスト.この方法は、トマト根のアグロバクテリウム・リゾゲレンス-媒介性変換に基づいており、続いて得られた植物の土壌びしょ濡れの接種を行い、目的の構築物を発現する形質転換された根を含む。根形変換アッセイの汎用性により、RNAiによって媒介される遺伝子過剰発現または遺伝子サイレンシングのいずれかを行うことができます。概念実証として、この方法を用い、RNAi媒介性のトマト根におけるSlCESA6のサイレンシングがラルストニアに対する耐性を与えることを示した。ここでは、この方法を詳細に説明し、比較的短時間で、機器や植物の成長空間の要件が小さい細菌性萎し病を理解するための遺伝的アプローチを可能にする。

図5は、空のベクター(EV)で形質転換した根を有するトマト植物の疾患症状の発達を示し、そして、RNAi構築物を標的とする根を有する植物はSlCESA6(Solyc02g072240)を標的とする。 SlCESA6 Solyc02g072240疾患指標データ(図5A)は、0から4までの任意のスケールに従って、同じ実験単位(各植物)から時間の経過とともに収集され、ガウス分布に従わない、パラメトリックデータの標準テストの使用を除外する。さらに、この種の実験には、植民地化と感染ダイナミクスによる固有の植物間のバリエーションがあります。以下、我々は、ラルストニア感染に関連する症状の表現および統計解析のための異なる方法を検討した。
標準的なアプローチとして、コ...

ここでは、細菌性萎痛病の研究のための簡単な遺伝子解析を行うために、ラストニア・ソラナ科を接種した後、トマト根形質転換のための汎用性の高い方法を提示する。

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

このプロトコルは、科学者がトマトの細菌性萎れ性疾患の簡単な遺伝子解析を行うことを可能にするので、重要です。この技術の主な利点は、遺伝子発現の操作とその後のアッセイが短時間で、設備や植物の成長空間の小さな要件で行うことができるということです。これは、非常に汎用性の高い方法であり、病原体接種および他の生理学的アッセイの両方を行うために他の作物植物に適用され得る。インビトロで苗の操作中に無菌性を維持するためには、それらがフローフードの外にあるときにプレートを閉じておくことを重要です。これは簡単な手法ですが、操作には複数の手順が必要です。この方法の視覚化は、原稿で説明するのが難しい小さなトリックを見るのに役立ち、他の研究者が研究室でこの方法を実装するのに役立ちます。この手順を実証するのを手伝うのは、大学院生のアーヘン・ジャオです。トマトの種を殺菌して洗った後、スクロースを使わずに半強度の村重・スクーグ培地に移します。3日間摂氏25度から28度の温度で暗闇の中で種子を保ちます。半強度のムラシゲとスクーグ培地を含む9平方センチメートルのペトリ皿の中にオートクレーブされた8.5平方センチメートルのフィルターを置き、各プレートに6つの発芽トマトシードを置きます。プレートをマイクロポアテープで密封し、発芽した種子を摂氏25~28度で3~4日間インキュベートします。植物の形質転換前に28°Cで2日間適切な抗生物質を用いて固形LB培地でアグロバクテリウム根虫MSU440を成長させます。無菌メスを使用して、トマト苗のラジクルと低血糖の底を切断します。プラスチックチップまたはメスブレードを使用して、LB培地の表面からA.rhizogenesバイオマスを収穫し、カットトマトの苗を細菌バイオマスに慎重に浸します。この後、トマトの苗を2センチメートル/4センチメートルの半円形のフィルターペーパーで覆い、高湿度を維持し、生存と新しい根の開発を容易にします。蒸散が可能な環境で、高湿度で苗を保つことが重要です。これを行うには、ろ紙で苗を覆い、マイクロポアテープでプレートを閉じます。25〜28°Cの温度で成長室に6〜7日間変換されたトマトの苗を保存します。その後、新しい新興毛深い根をカットするために無菌メスを使用し、苗が新しい毛深い根を生成できるようにします。新しい毛深い根の第二世代が現れたら、苗の上にフィルターペーパーを取り除き、再びマイクロポアテープでプレートを密封します。DsRed蛍光または植物インビボイメージング用の他の機器を可視化するには、赤い蛍光によって識別することができる正の形質転換された根をマークします。メスを使用して、赤い蛍光の欠如によって識別できる陰性非形質の根を除去する。赤い蛍光を示す苗を半強度のムラシゲとスクーグ培地を含む新しいプレートに移し、変換された根を主根として開発しやすくする。同じプレートに赤色蛍光を示さない苗を保管し、後の時点で蛍光根の出現を確認します。苗を2センチメートル/4センチメートルの半円のろ紙で覆い、プレートを密封し、苗をインキュベートして新しい毛深い根を開発できるようにします。最初に接種ポットに水を浸し、余分な水を注ぎ、プラスチック製の植栽トレイに入れることで、根の表面が細菌の接種に曝される接種ポットを準備します。ピンセットを使用して、選択した苗を、形質転換した根を入れ替えた苗を接種ポットに移します。ラップまたは透明な蓋でトレイを覆い、湿度65%で摂氏25~28度に保ちます。5~6日後にカバーを取り外します。28°Cの軌道シェーカーで5つのLB液体媒体でラルストニアを成長させ、静止期まで200rpmで揺れる。600ナノメートルで光学密度を測定し、細菌数を決定します。1のOD600に水で細菌培養を希釈します。変身したトマト植物を含む16〜20個の接種ポットを接種トレイに入れます。その後、希釈した細菌接種物の300ミリリットルをトレイに注ぎ、植物が接種物に20分間浸漬できるようにします。この後、ポッティング土壌の層で新しいトレイを準備します。接種されたポットを新しいトレイに移動し、湿度75%、摂氏26~28度の温度、12時間の光と12時間の暗闇の光周期を備えた成長室にトレイを置きます。ここでは、トマトの根を変換し、細菌性萎れ病の研究のための簡単な遺伝子解析を行うためにラルストニアを接種する。病気の症状の発症は、空のベクターで形質転換された根を持つトマト植物と、トマトCESA6を標的とするRAI構造で形質転換されたもので追跡される。疾患指数データは、ゼロから4までの任意のスケールに従って同じ実験単位から時間の経過とともに収集され、ガウス分布に従わない、パラメトリックデータの標準的なテストの使用を除外する。標準的なアプローチとして、コントロールと感染曲線の両方を比較するUマンホイットニー、両側の非パラメトリックテストが使用されます。この分析では、両方の曲線の中央値の差は有意ではないようです。また、疾患進行曲線下の領域を定量化することも可能であり、疾患進行の複数の観測を単一の値に組み合わせることが可能である。病気進行曲線の下の領域は、感染プロセスの終わりにトマトCESA6 RNAi植物と比較して対照植物の方が高い値を示し、トマトCESA6沈黙植物は対照植物よりもラルストニア感染に対してより耐性があることを示している。信頼区間は、高い確率で、特定の変数の母集団値が見つかる値の範囲を推定する方法を提供します。ここで見られるように、制御および感染曲線の95%信頼区間の面積は、CESA6が沈黙したときの抵抗の高い確率を推定する。疾患指数値は、ゼロに対応する2未満の疾患指数と1つに対応する2つ以上の疾患指数を考慮して、バイナリデータに変換することができる。これは、ラルストニア接種後の生存曲線の表現を可能にする。対照と感染した植物の生存率の差は、ゲハン・ブレスロー・ウィルコクソン統計検定によると統計的に有意ではない。次に、CESA6の発現を接種工程の前にランダムに選択した2つの形質転換根で解析し、RALSTONIAに対する抵抗力の増強がCESA6の発現低下と相関することを示す。2回の選択の後、35~40%の変換速度を得ることができ、追加の選択ラウンドを行うことでこの値を増やすことができます。この手順を実行している間、高湿度を維持するために濾紙で覆われた苗を維持し、ガス交換を確実にするためにマイクロポアでプレートを密封することが重要です。根形転換後、根の生理学を観察したり、分子生物学、細胞生物学、生化学を用いて植物の反応を研究するために、多くの治療を応用することができます。主に、この技術は、限られたリソースを持つ研究者がトマトの根の細菌感染の遺伝子解析を行うことを可能にする。

tomato-root-transformation-followed-inoculation-with-ralstonia

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

出典:Hassan、JA、et al.Pseudomonas syringae pvに対する耐性のハイスループット同定苗フラッドアッセイを用いたトマト中のトマトJ. Vis. 経験。...

トマトの細菌耐性をスクリーニングするための苗の洪水アッセイ

出典: Matthysse, A. G. 実験室で測定された植物表面への細菌の付着。 J. Vis.

トマト苗の根系菌による病原性細菌の定着を評価するための生存細胞数

DNAアセンブリを使用して、複数のCRISPRベクトルが単一クローニング反応に並列に構築することができ、CRISPR多数の構造を作ることは簡単な作業ベクトル。トマト毛状根は、CRISPRベクトルを検証し、突然変異体材料を生成するための優れたモデルシステムです。...

トマト毛状根の発生によるDNAの修飾のハイスループットCRISPRベクター構築と特性

ここで提示されたプロトコルの目的は、ジャガイモ根分泌物への endosphere 分離細菌...

植物と微生物の相互作用: ジャガイモ根分泌物に細菌 Mycoidesの転写応答

ここでは、ジャガイモを変換する 2 つのプロトコルを提案する.サツマイモネコブセンチュウ生成トランスジェニック植物毛状根自己伝達することができます野生型撮影アグロバクテリウム変換完了形質転換植物に します。我々...

アグロバクテリウムとサツマイモネコブセンチュウ-ジャガイモの変換を介したと GUS 染色によってスベリン遺伝子のプロモーター活性

苗の洪水アッセイは、シュードモナスシリンガエ細菌に対する耐性のための野生のトマトの受診の迅速なスクリーニングを促進する。このアッセイは、苗菌増殖アッセイと組み合わせて使用され、細菌に対する根底にある耐性をさらに特徴付けるのに役立ち、かつ、マッピング集団をスクリーニングして抵抗の遺伝的基礎を決定するために使用することができる。...

シュードモナスシリンゲpvに対する耐性のハイスループット同定苗フラッドアッセイを用いたトマトのトマト

このプロトコルは、植物の根に土壌媒介微生物を接種するための戦略の詳細な要約を提示する。真菌 Verticillium longisporum および Verticillium...

植物の根に土壌媒介微生物を感染させる接種戦略

ここでは、トランスジェニックダイズ毛根の高効率生産のためのプロトコルを提示します。...

遺伝子機能解析のためのダイズ毛状根形質転換

このプロトコルは、光学顕微鏡による根構造の組織化学的分析のためのin vivo温室条件下での植物寄生性線虫およびジャガイモin vitroトランスジェニック根によるSolanum...

植物寄生性線虫によるジャガイモ根のin vivoおよびin vitro感染による植物寄生性線虫の感染

ハイスループット、自動化され、タバコプロトプラストの生産と変換方法について説明します。ロボットシステムは、非モデル作物に翻訳可能であるべきであるBY-2システムモデルにおける大規模並列遺伝子発現と発見を可能にします。...

ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

学ぼう、トマト根形質転換とRalstonia solanacearum接種による細菌性ウィルト病の遺伝子解析法。簡便な操作で設備が少なくても迅速に遺伝子発現操作とアッセイが可能です。

細菌性ウィルト病の簡単な遺伝子解析のためのラストニア・ソラナセアラムによるトマト根形質転換

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