内皮管形成アッセイに適用可能な線維芽細胞由来3Dマトリックスシステム
2019年12月26日
この方法の目的は、その後の細胞アッセイのための天然足場として線維芽細胞由来の3D行列を得る。線維芽細胞は、前処理された培養プレートに播種され、マトリックス生成のためにアスコルビン酸で刺激される。マトリックスは、脱細胞化され、関連する細胞(例えば、内皮細胞)を培養するために遮断される。
このプロトコルは、異なるタイプの培養物を見て、細胞外マトリックスとの相互作用を観察することを可能にする。この方法の主な利点は、あなたが得るマトリックスが線維芽細胞によって再生され、それは生体内で生成されるものと非常によく似ているということです。私たちは、この病気は、ベーキング皿から得る線維芽細胞を使用する場合には無関係になると考えています。
これらの細胞から行列を確立することは、それがどのように影響するかを私たちに啓発することができます, 例えば, 永続的な状況.これらの方法は、例えば、マトリックスの妥当性から生存者に物理的研究に適用することができます。このプロトコルの視覚化では、摂起する必要があるステップのピペッティング技術を観察することが重要です。
これらのメソッドを初めて試すとき、おそらく予想以上に時間がかかります。私たちのアドバイスは、あなたが事前にできる限り準備し、次のステップの準備のために期間を使用する方法です。原稿の指示に従って0.2%ゼラチン、1%グルタルアルデヒドおよび1モルエタノールアミン溶液を調製することから始めます。
使用前に0.22マイクロメートルのフィルターを通して各溶液を実行することを確認してください。次に、アスコルビン酸およびリシスバッファーを調製する。原稿に記載されているようにPBSペンストレップを希釈し、10%FBSでDMEMを調製します。
100ミリリットルの無菌水に2グラムのBSAを加え、沸騰した水浴で7分間温めることで、熱変性した2%BSAを準備します。次に、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、アンホテリシンB.Culture組換えテロメアを10%FBSでヒト包皮線維芽細胞とDMEMをトランスフェクトし、37°Cと5%の二酸化炭素でFBSを補った。一次線維芽細胞培養を確立するには、組織サンプルを約2〜3ミリリットルの小片に切り、高濃度の抗生物質でFPSに播種する。
最初の線維芽細胞が現れたら、細胞維持のために培地をFBM培地に交換してください。6ウェルプレートの各ウェルに0.2%ゼラチン溶液の2ミリリットルを加え、摂氏37度または摂氏4度で一晩1時間インキュベートします。インキュベーション後、ゼラチンを吸引し、2ミリリットルのPBSでそれぞれをよく洗います。
各ウェルに1%のグルタルアルデヒドを2ミリリットル加え、ゼラチンを架橋する30分間室温でプレートをインキュベートします。グルタルアルデヒドを吸引し、2ミリリットルのPBSで井戸を5分間洗浄します。残りのグルタルアルデヒドをブロックするには、1つのモルエタノールアミンを2ミリリットル加え、室温でプレートを30分間インキュベートします。
エタノールアミンを吸引し、PBSでの使用を繰り返します。10%FPSでDMEMを1ミリリットル加えます。メディアがすぐにピンク色に変わったら、それを取り除き、PBSの2ミリリットルで井戸を1回洗い、DMEMの別のミリリットルを追加します。
5 x 10で線維芽細胞懸濁液の1ミリリットルを各ウェルの5番目の細胞に播種し、100%合流するまで細胞を培養する。その後、培地を取り出し、10%FBSと1ミリリットルアスコルビン酸あたり50マイクログラムでDMEMに置き換えます。2日ごとに6日間培地を交換してください。
最後のアスコルビン酸処理の2日後に培地を取り除き、2ミリリットルのPBSで井戸を洗います。洗剤の後、予熱した溶液バッファーを1ミリリットルゆっくりと加え、繊維芽細胞が溶けるまで5〜10分間室温でプレートをインキュベートする。溶液バッファーを取り除かずに、慎重に各ウェルにPBSの2ミリリットルを追加し、約2.5ミリリットルを吸引します。
このプロセスを 2 回繰り返して、合計 3 回の操作を行います。最後の洗浄の後、ペンストレップでPBSを2ミリリットル加えます。フィルムでプレートを密封し、最大3ヶ月間摂氏4度に保ちます。
HUVEC細胞とEMB-2を最大合流まで2%FBSで成長させます。その後、8時間FBSなしでEBM-2で媒体を交換してください。細胞の播種用のマトリックスを準備するには、冷蔵庫から取り出し、室温で1時間放置します。
熱変性2%BSAの2ミリリットルを加えてマトリックスをブロックし、摂氏37度で1時間インキュベートします。その後、BSAを吸引し、2ミリリットルのPBSで洗浄します。第5種HUVEC細胞に第5種10を線維芽細胞由来マトリックスで被覆したプレートの各ウェルに。
37°Cで細胞を16時間インキュベートし、20〜40倍の倍率で標準的な明視野顕微鏡でチューブ状の構造を調べます。このプロトコルは、線維芽細胞由来マトリックス形成に対するPDGF治療の影響を調べるために使用された。PDGFと共にインキュベートされたBGH第3の線維芽細胞は、PDGFなしでインキュベートされたものよりもマトリックス中でより整列した細胞分布を示した。
コラーゲン1およびフィブロネクチンタンパク質発現は、PDGF刺激線維芽細胞由来のマトリックスにおいて増加し、その結果、マトリックス厚さが増加した。また、指向性ヒストグラムは、コラーゲン1とフィブロネクチンが平行パターンを示すことを示す。HUVEC細胞をPDGF刺激線維芽細胞由来の脱細胞化マトリックスに播種すると、刺激を受けた状態よりも毛細血管様構造が発達した。
PDGF-BB刺激線維芽細胞に由来するマトリックスが内皮細胞活性化を促進することを確認する。この手順を実行する場合は、事前にソリューションを準備し、開始する前にセルの準備ができていることを確認することが重要です。内皮細胞の研究のほかに、マトリックスは上皮細胞で播種することができ、また、メディアや細胞傷害性薬物の状態などの外部要因への反応を観察することができます。
腫瘍マクロ環境実験の設計において細胞外マトリックスの生成は極めて重要である。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
このプロトコルにより、さまざまな細胞培養および細胞外マトリックスとの相互作用の観察が可能になります。線維芽細胞由来のマトリックスは、生体内に存在するマトリックスに酷似しており、細胞アッセイに適した足場を提供します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞培養
- 細胞外マトリックス研究
- 線維芽細胞生物学
背景
- 線維芽細胞は、細胞外マトリックスの生成において重要な役割を果たす細胞である。
- 細胞とマトリックスの相互作用を理解することは、さまざまな生物学的研究において極めて重要である。
- 再生されたマトリックスは、生理学的および病理学的な状態に関する知見を提供することができる。
- この方法により、プロトコルに不可欠なピペッティング技術を視覚的に確認することができる。
研究目的
- 線維芽細胞由来のマトリックスを用いて、細胞アッセイのための天然スキャフォールドを作製する。
- これらのマトリックスが異なる細胞種に及ぼす影響を調べる。
- マトリックス研究を通じて、持続的な疾患状態への理解を深める。
使用方法
- 前処理した培養プレートに線維芽細胞を播種します。
- マトリックスの生成を促進するためにアスコルビン酸を使用します。
- 細胞培養の準備として、マトリックスの脱細胞化を行います。
- 血管内皮細胞などの適切な細胞をマトリックス上で培養します。
主な結果
- 作製されたマトリックスは、in vivoで観察されるものと類似しています。
- マトリックスと細胞との相互作用を効果的に観察できます。
- 本手法は、適切な環境下での細胞挙動を研究するための信頼性の高いアプローチを提供します。
- 可視化技術により、プロトコルの実行手順への理解が深まります。
結論
- 線維芽細胞由来のマトリックスは、細胞アッセイのための効果的なスキャフォールドとして機能します。
- この手法は、マトリックス特性の物理学的研究を含む、さまざまな生物学的研究に適用可能です。
- 細胞と細胞外マトリックスの相互作用を理解することは、細胞生物学の研究を進展させる上で極めて重要です。
よくある質問
業界における実用的意義
この手法は、線維芽細胞由来の生理学的に妥当な3D細胞外マトリックスモデルを提供し、探索研究における血管新生および腫瘍形成表現型のより予測性の高い評価を可能にします。生体内のマトリックス組成と構造を模倣することで、腫瘍学および血管新生に焦点を当てた創薬パイプラインにおける標的検証およびメカニズム的なリスク低減を支援します。本システムは、制御可能で再現性のある条件下でマトリックス介在性の細胞挙動を研究することを可能にし、トランスレーショナルな連続性を向上させます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見とターゲット検証
- 科学的価値： 血管新生能の機能的リードアウトとして、線維芽細胞を介したマトリックスリモデリングが内皮細胞の管腔形成に及ぼす影響を解析することを可能にする。
- 実用的価値： PDGF-BBなどの血管新生促進因子がマトリックス組成および下流の内皮細胞応答に与える影響について、仮説検証を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： コラーゲンおよびフィブロネクチンの沈着量を定量化した、標準的な脱細胞化マトリックスを作製し、一貫した血管内皮細胞の播種を可能にする。
- 実用的価値： 明視野顕微鏡下での管状構造の高コンテンツイメージングに向けた、生物活性スキャフォールドの再現性のある調製を可能にする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：がん関連線維芽細胞（CAF）が誘導し、腫瘍関連血管新生を促進する細胞外マトリックスの変化をモデル化しています。
- 運用的価値：疾患に関連したシステムにおいて、内皮細胞の形態形成に対するマトリックス依存的な薬剤の効果を評価できます。
パイプラインおよびワークフローの統合
線維芽細胞由来マトリックスアッセイは、ターゲットのバリデーションから表現型スクリーニングに至る探索の連続的なプロセスに適合し、前臨床試験への移行前に、分子レベルのヒット化合物と機能的な血管新生出力との間を繋ぐ架け橋となります。
- 発見生物学：線維芽細胞の活性化状態がマトリックス構造をどのように調節し、内皮細胞の挙動に影響を与えるかを検証します。
- スクリーニング：チューブ形成の定量的なイメージングベースのリードアウトを提供し、実験群間でのマトリックス条件を比較します。
- 分析：コラーゲンおよびフィブロネクチンの配向の方向性ヒストグラム分析を可能にし、マトリックスリモデリングの表現型を評価します。
- トランスレーショナルリサーチ：線維芽細胞由来のマトリックス特性を、腫瘍微小環境のモデリングに関連する血管新生シグナル伝達経路へと結びつけます。
- 企業の再利用：生理学的コンテキストを備えたアッセイにおいて、血管新生促進または抑制化合物を評価するための再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：in vivoのECM組成および構造に密接に似たマトリックスを使用することで、血管新生ターゲットのバリデーションにおける予測信頼性を向上させます。
- 運用的価値：複数の細胞種や実験条件に適用可能な、生物活性3Dマトリックスを生成するための標準化され、かつ拡張性のある手法を提供します。
- 戦略的価値：創薬カスケードの早期段階で間質介在性のマトリックス効果を組み込むことにより、血管新生スクリーニングにおける生物学的な偽陽性を減少させます。
- ポートフォリオへの影響：線維芽細胞によって再構築されたマトリックスへの影響および下流の内皮細胞応答に基づき、血管新生調節剤のリスク調整済み優先順位付けに情報を提供します。
実施上の検討事項
- 初代線維芽細胞の培養、細胞外マトリックスの生化学、および脱細胞化技術に関する専門知識が必要です。
- マトリックスの安定化には、制御されたアスコルビン酸刺激、グルタルアルデヒドによる架橋、およびエタノールアミンによるクエンチングが不可欠です。
- 再現性のある血管内皮管形成アッセイを行うには、熱変性BSAを用いた標準的なブロッキングと、一貫した細胞播種プロトコルが必要です。
- 定量可能な血管新生表現型を得るためには、HUVECまたはその他の血管内皮細胞における細胞密度およびインキュベーション時間の最適化が含まれます。
- マトリックス作製プロセスに時間を要すること（6日以上のアスコルビン酸処理）および、コンタミネーションを防ぐための滅菌ろ過済み試薬の使用が必要であることが制限となります。
