Name: 交感性乳癌モデルを用いたトリプルネガティブ乳癌の研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 学ぶ 交感性乳癌モデルを用いたトリプルネガティブ乳癌の研究手法。GFPタグ付きバイオルミネセンスイメージングとリアルタイムPCRにより微小転移の検出・定量化を実現し、抗がん剤の治療効果評価に有用なモデルを提供します。

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著者らは、国立衛生研究所、国立がん研究所、ベセスダMD、がんと炎症プログラム、フレデリック国立研究所 - 小動物イメージングプログラムの壁内研究プログラムによる支援を認めたいと考えています。レイドスバイオメディカルリサーチ株式会社、フレデリックメリーランド州、米国。

腫瘍の成長の分析は、国立がん研究所動物実験倫理委員会が承認したプロトコルを用いて実施し、米国国立研究評議会の勧告に従った「ケアと使用のためのガイド」米国公衆衛生サービスの「実験動物のケアと使用のためのガイド」、および「実験動物の人道的ケアと使用に関する方針」。
1. 移植のための細胞の調製
注:MDA-MB-231ヒト乳房腺腺癌細胞(市販取得)は、レンチウイルスによってルシファーゼ遺伝子IIIおよび強化された緑色蛍光タンパク質(GFP)マーカーと安定的にトランスフェクトされ、選択抗生物質(ピューロマイシン)の存在下で増殖した。.
<ol><li>1 x 106 MDA-MB-231-Luc/GFP 細胞で細胞培養を開始し、T75 培養フラスコに 10% ウシ胎児血清 (FBS) を含む 15 mL のプリウォーム (37 °C) RPMI 1640 培地を加えます。温度制御された細胞培養インキュベーターで細胞を5%CO2で37°Cで増殖させ2続ける。完全な媒体を週に2倍以上交換してください。 注:細胞の成長を妨げず、細胞の成長状態を毎日チェックし続けてください。増殖期を維持するために、細胞は85%-90%の合流度に達したときにサブカルチャーする必要があります。</li>
	<li>細胞移植ステップの1週間前に、まず培養フラスコ内のすべての培地を取り除き、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の10 mLで2xをすすいで細胞培養フラスコからピューロマイシンを取り除き、最後に培地を完全な培地に置き換えます。プロマイシンなし。中程度の追加とリンスの手順中に、セルを邪魔しないでください。すべての培地補充ステップのために、今後選択抗生物質で完全な培地を使用しないことを忘れないでください。</li>
	<li>細胞を移植のために準備した日に、トリプシンを失わないようトリプシン化前にすべての完全な培地を取り除く。5 mLのトリプシンをフラスコに加えて細胞をトリプシン化します。細胞を監視し、それらが培養フラスコから切り離されることを確認します。</li>
	<li>大部分の細胞が剥離したら、完全培地10 mLを加えてトリプシン活性を中和する。次に、細胞懸濁液を50mL遠心分離管に移し、遠心分離機を〜150xgで細胞をペレットにする。 g遠心分離後に上清を取り除き、10 mLの10 mLのPBSを加えて細胞を再中断し、細胞カウントの準備をします。</li>
	<li>細胞カウンターを持つ細胞を数え、25%基体膜マトリックスを含む冷たい1x PBSで20 x 106細胞/mLに細胞濃度を調整します。25%基底膜マトリックスを用いた0.1 mL 1x PBSに2 x 106細胞を各マウスの第4乳腺脂肪パッドに注入します。細胞の注入のための余分な針および注射器を持って来、注入する前に氷の上に細胞の基質膜マトリックスの組合せを保つ。 注:注射器と針にデッドスペースがあります。針および注射器の長さ、種類、およびサイズの選択に応じて、26G針の0.5を有する結核シリンは、最大70μLのデッドスペース10を有することができる。デッドスペースやその他の偶発的な損失を補償するために、40%-50%以上の細胞注入ミックスを準備してください。</li>
</ol>2. 異形性乳癌モデルと腫瘍サイズ測定
<ol><li>6週齢の雌の腺性ヌードマウスが細胞移植の前に少なくとも1週間、住宅施設に順応することを許可する。 注: 同じ年齢のマウスを使用すると、データの変動が減少します。</li>
	<li>各ラウンドに対して、3-4分間の流量1 L/minで4%のイオブルランを有する5匹のマウスを麻酔する。彼らが動かなくなったら、1つのマウスを取り除き、同じ麻酔で鼻と口の上に鼻コーンを置きます。</li>
	<li>左4回目の乳腺をアルコールでスワブします。細かいラット歯の鉗子を使用して、4番目の乳腺をわずかに持ち上げて25G針を挿入します。針がベベルアップされていることを確認し、針が血管に当たらないようにプランジャーをわずかに引っ張ります。血液が注射器に入らない場合は、乳腺脂肪パッドに細胞基底膜マトリックスミックスの100 μLをゆっくりと注入し続けます。 注:円形の盛り上がった領域がスキンの下に表示されます。</li>
	<li>基質膜マトリックスが硬化するまで10~15s待ってから針を取り外します。誘導室の残りのマウスでプロセスを繰り返します。使用したすべての針と注射器を鋭い箱に入れます。</li>
	<li>すべてのマウスに同じ乳腺注射部位を使用してください。注射部位を注意深く見て、注射部位から漏れ出る細胞注入ミックスに注意してください。 メモ:数分以内に、マウスは意識を取り戻し始めます。</li>
	<li>異種移植片は、腫瘍サイズ測定の7〜10日前に中断することなく自由に成長することができます。</li>
	<li>すべてのマウスの異種移植片の大きさを調べる。キャリパーで腫瘍の大きさを測定します。次の式で腫瘍体積(mm3)を決定します。 <img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq1.jpg"> ここで、L は最も長い寸法で、W は L に対して垂直な最短の寸法です。</li>
	<li>平均の標準偏差を1つ上回る外れ値を特定して除去します。実験には、同等の腫瘍サイズを持つマウスのみを使用してください。マウスを異なる治療群にランダムに分割し、治療を開始します。</li>
	<li>週2倍のキャリパーで腫瘍サイズを測定します。異種移植片のすべての物理的変化(すなわち、壊死、裂傷)に注意してください。</li>
</ol>3. 生体発光とエキソビボ蛍光イメージング
注:本研究では、2次元生物発光と蛍光イメージングの両方を実験の終点で行います。生物発光イメージング(BLI)は、16ビット冷却CCDカメラと加熱イメージングステージを備えた市販の前臨床光学スキャナーを使用して行った。
<ol><li>イメージングの前に、イオブルランを3%に設定し、3-4分間1 L/minの空気を1 L/minに設定して、誘導室内の最大5匹の腫瘍を含むマウスを麻酔します。イオブルランへのスタッフの暴露を最小限に抑えるために、誘導室が通気フードの内部に保管されていることを確認してください。</li>
	<li>D-ルシフェリン(150mg/kg)を27G針を用いて腹腔内経路で麻酔中マウスに投与し、麻酔用マウスを撮像室に移した。スキャナーイメージングチャンバで、1 L/minの流量を持つキャリアとしてO2を使用して、イソフルランを2%-2.5%に維持します。 注:麻酔誘導室の下に加熱されたパッド、イメージングテーブル(ステージが加熱されていない場合)、および術後回復ケージを維持することにより、手順中にマウスの体温を〜37°Cに維持します。</li>
	<li>研究マウスをイメージングする前に、励起フィルタブロック、エミッションフィルタオープン、f/ストップ1、FOV-D、ミディアムビニング(8 x 8)、および自己暴露の3つの余分な腫瘍担持マウス(どの研究グループにも割り当てられていない動物)を合計40分間隔で2分間間隔でイメージングしてルシフェリン動力学を得る。測定したピーク生物発光信号を使用して、後続のすべての時間ポイントに最適な画像取得時間を定義します。</li>
	<li>転移画像化を行う際に、黒い手袋から切り取られたスリーブで覆うことで、原発腫瘍から高BLI信号を遮蔽します。ステップ 3.3 で説明した同じパラメータを使用して、マウスの腹側をカメラに向けて肺転移画像化し、脳転移イメージング用のカメラに対してマウスの後側を使用して画像を取得します。 注:それは最小限の自動発光を持つものを選ぶために黒い手袋のいくつかの異なるブランドをテストすることが不可欠です。</li>
	<li>スキャナーとデータ解析ソフトウェアを使用して、胸腔または脳の上に標準的な形状領域(ROI)を描き、関心のある臓器全体をカバーして転移性の負担を評価します。生物発光(BL)出力を総フラックス(光子/秒)として定量化します。</li>
	<li>BLIの直後に、CO2窒息(ACUCガイドラインおよび機関承認動物プロトコルに従って)を介してマウスを安楽死させ、肺と脳をex vivoイメージング用のハサミと鉗子を解剖して抽出する。 注:ex vivoイメージングおよび肺転移結節カウントのために抽出された肺は、互換性のない手順のために同じマウス上で行うことができません。</li>
	<li>1x PBSですべての臓器を素早くすすぐすいで表面性の血痕を取り除き、低自己蛍光、黒いプラスチック板に臓器を置きます。GFP検出用の12ビットCCDカメラを用いたスペクトル非混合機能(固体液晶波長調整)を備えたマルチスペクトル蛍光スキャナーに臓器を輸送します。</li>
	<li>抽出された臓器および非腫瘍軸受制御マウスのマルチスペクトルGFP画像(励起フィルタ= 457±23nm;発光フィルタ=490nmロングパス)を、ステップサイズ10nmで500-720 nmまでスキャンして取得します。非腫瘍軸受制御マウスからの切除臓器を使用して、自己蛍光を補正する。</li>
	<li>マルチスペクトルGFPイメージングの後、最適なイメージング設定を決定します。メーカーのプロトコルに従って、すべての標的臓器の画像取得を行い、画像解析を行う(すなわち、自家蛍光用のスペクトルライブラリとスペクトル非混合手順用のGFPを生成する)</li>
</ol>転移性乳癌細胞の分子検出
<ol><li>ex vivoイメージングの後、スナップは液体窒素で脳全体を凍結し、DNA抽出の準備ができるまで-80°Cで冷凍庫に保管します。</li>
	<li>DNA抽出のために、脳全体を2mLのDNAリシスバッファーを有する5 mL均質化チューブに入れる。50の電源設定でホモジナイザーを使用して、スナップ凍結全脳組織を均質化します。脳組織が完全に均質化されたら、1 mL懸濁液(lysate)をDNaseフリーおよびRNaseフリーの2 mLマイクロ遠心分離チューブに移し、製造業者のプロトコルに従ってDNAを分離し続けます。 注:持ち越しDNA汚染を最小限に抑えるには、まずDNaseフリーおよびRNaseフリー水で75%エタノールで洗浄し、次に1M NaOH溶液でリンスし、次にDNaseフリーで75%エタノールを含むリンスを行い、各サンプル後にホモジナイザーを十分に洗浄し、RNaseフリー水は、DNA残渣を効果的に減少させ、破壊する。</li>
	<li>0.5 mLの100%エタノールのDNAリシスバッファーをリセートに加えます。逆にサンプルを混合し、室温で3分間保存します。 注:何度も、またはあまりにも激しく反転しないでください。DNAはウール状の沈殿物として見えます。</li>
	<li>ピペットチップを使用して、DNAを新鮮なDNaseフリーおよびRNaseフリーの2 mLマイクロ遠心分離チューブに移します。サンプルの空気を1分間乾燥させ、1 mL 75%エタノールを加え、マイクロ遠心チューブを3-6倍反転させてDNAサンプルを洗浄します。各洗浄後にエタノールをピペット処理して廃棄します。洗浄ステップ2xを繰り返します。</li>
	<li>空気はDNAサンプルを10 sのために乾燥させる。その後、52 μLの8 mM NaOHを加え、DNAサンプルを溶解します。DNA定量用にDNAサンプルの2μLをピペットし、濃度調整後のリアルタイムPCRアッセイに残りの50μLを使用します。 注意:NaOHはDNAサンプルを完全に可溶化するのに役立ちます。</li>
	<li>分光光度計で各DNAサンプルの2μLを定量し、品質チェック基準としてA260/280間の吸光度比を使用します。次の式でDNA濃度を計算します。 <img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq2.jpg">
</li>
	<li>DNA濃度を50 ng/μLに調整します。DNAサンプルごとに、リアルタイムPCRアッセイの開始テンプレートとして50ngのDNAを使用します。8 mM NaOH溶液またはDNaseフリー水およびRNaseフリー水を使用して、DNAサンプルを希釈します。</li>
	<li>外因性緑色蛍光タンパク質(GFP)配列に固有のプライマーペアを社内で設計し、遠位部位に侵入してコロニー形成した転移細胞のGFPタグをリアルタイムPCR検出するためのオープンソースプライマー設計ウェブポータルを使用します。 注:この研究は、F:5'-アガッカッチャグガック3'、R:5'TGCTCAGGTAGTGGTGTCG-3'を使用しました。</li>
	<li>高速リアルタイム PCR 試薬と高速リアルタイム PCR プロトコルをサポートするリアルタイム PCR マシンを使用します。通常の30サイクル増幅ステップに加えて、非特異的増幅の検出のために、解離曲線ステップを実行の最後に追加します。 注:分子検出には、95°C 2分ホットスタート、95°C5sの40サイクル、60°C15s、最後に融解曲線解析の条件を使用しました。GFPアンプリコンのサイズは135 bpです。</li>
	<li>陰性コントロールとして、ナイーブマウス脳DNA(MDA-MB-231細胞インプラントではない)を使用してください。MDA-MB-231-GFP/Luc細胞から抽出したDNAを陽性対照として使用する。DNAテンプレートを使用せずにすべてのPCR試薬を無テンプレートコントロール(NTC)として追加します。 注: PCR の各アッセイには PCR コントロールが必要です。</li>
</ol>5. 肺における転移性乳癌細胞検出
<ol><li>転移性肺結節計数用に選択されたマウスのサブグループについては、ex vivoイメージングの直後にイソフルラン(ステップ2.2のように)を有するマウスを麻酔し、採血のための心臓穿刺を行い、子宮頸部転位によって安楽死させる。</li>
	<li>はさみを解剖して胸腔を開き、心臓と胸腺を切り抜いて気管を露出させる。</li>
	<li>ブインの溶液を含む22G針の10 mLシリンジを気管に挿入します。崩壊した肺がブインの溶液の〜2 mLで腫れるまで注射器プランジャーを押します。肺を膨らませたら、注射器と針を取り除きます。</li>
	<li>ブインの溶液を含む15 mLチューブに肺全体を入れ、チューブを数回軽く反転させ、室温で24時間浸漬します。</li>
	<li>24時間後、チューブからブインの溶液を取り出し、肺を水ですすいでから、70%エタノールでチューブに戻します。解剖顕微鏡を用いて肺の表面に転移(白い斑点または結節)を数える。</li>
</ol>6. データ収集と分析
<ol><li>電子スプレッドシートに腫瘍の体積データ、生体内およびex vivoイメージングデータを記録し、データの入力、収集、管理を容易に行うことができます。</li>
	<li>実験の最後に、すべてのデータを電子スプレッドシートに転送し、データプロットと統計解析用の統計ソフトウェアを作成します。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

動物におけるTNBCの研究では、免疫不全マウス(扁平上皮性ヌードマウス、NSGマウス)におけるMDA-MB-231ヒト乳房腺癌細胞と、免疫に優れたBALB/cマウスの4T1の2つのマウスモデルが開発されている。どちらのモデルにも利点があります。研究のための動物モデルの選択は、研究目標に依存します。例えば、MDA-MB-231モデルは、免疫抑制されたヒト乳癌患者を模倣する免疫不全マウスで増殖したヒトTNBC細胞株である。一方、BALB/cマウスにおける異所4T1トリプルネガティブマウス乳癌細胞の侵襲的表現型は、ステージIVヒト乳癌患者に生じる転移過程を密接に模倣する。静脈内細胞注射アプローチとは異なり、ヒトMDA-MB-231乳癌細胞は、同様に、異性体性乳癌モデル11、13において乳腺脂肪パッド11、12,13に注入された。11,12より長い腫瘍増殖および獲得した転移能がより生理的に関連し、したがって、人工転移癌モデル44、1414ではない。このような自発的転移モデルは、開始段階を除いてヒト乳癌の発症を密接に模倣する。これは、転移性乳癌におけるインビボ薬物スクリーニングおよび治療有効性評価のための重要なモデルである。
マウスの腫瘍移植部位は、腫瘍の成長を維持する微小環境を提供し、ヒトで起こるのと同様の転移表現型の選択において重要な役割を果たす。近位リンパ節と脂肪組織の存在は、乳癌15、16,16の疾患進行に影響を与える重要な因子である。ヒト患者において、リンパ節と脂肪組織は、いずれも乳癌,17、18、19,18の悪性腫瘍および罹患率に影響を及ぼす主要な相互作用因子である。19したがって、注射部位の正解剖学的位置の選択は、ヒト疾患と比較して腫瘍モデルの関連性に大きな影響を与える可能性がある。本研究では、主に前述の要件により、第4の乳腺を移植部位として使用し、解剖学的によりアクセスしやすく、操作が容易である。
異なる腫瘍体積計算方法が利用可能であり、研究者は彼らが合うと思う任意を選択することができます。この研究のために選択されたアルゴリズムは、ファウスティーノ・ロチャらによる知見に基づいており、異なる腫瘍体積計算式を比較し、以下の式が最も正確な20であると結論づけた。
<img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq3.jpg">
基体膜マトリックスは、各種in vitro21およびin vivo22、23,23アッセイにおいて使用される重要な細胞外マトリックスである。異種移植片悪性腫瘍に対する基膜マトリックスの影響に関する矛盾する報告が,22、24、25である。24,22異種移植片の初期の確立にのみ影響を及ぼし、異種移植片の成長にこれ以上の影響を及ぼさないと思われる25.記載された異種移植のために、基体膜マトリックスを癌細胞と混合し、移植前に細胞/ゲル混合溶液粘度を増加させる。基部膜マトリックスの存在は、注入部位からの混合溶液の損失を減少させ、移植部位での混合溶液を維持し、移植された異種移植片容積の均一性を増加させる。
MDA-MB-231細胞株は悪性不死化ヒト乳房腺癌細胞株であり、その三重陰性の状態のために乳癌研究で一般的なツールである。デュアルレポーター(ルシファーゼとGFP)細胞株を使用することで、生体内およびex vivoイメージングの取り扱いにおいてより柔軟に対応できます。生物発光シグナルは、GFP信号よりも感度、深度検出性、優れたコントラスト(シグナル対ノイズ比)を有することが十分に確立されています。このため、全身イメージングに広く使用されているイメージングモダリティです。残念ながら、生物発光検出は、信号検出が線形である狭い時間枠(〜15〜20分後ルシフェリン注射)によって制限されます。動物が安楽死するとBLIシグナルは急速に減少する。これは、多くのマウスを安楽死させる必要があり、複数の組織や臓器を収穫する必要がある場合、実験的な設計上の問題になります。これらの研究では、血液を直接心臓穿刺により採取し、脳、原発腫瘍、肺、および罹患したリンパ節を40匹のマウスで検査した。臓器が収穫され、エキビボイメージングの準備が整う頃には、生物発光シグナルは検出できなかった。したがって、GFP検出は、これらの状況でより適している。GFP信号の発光は可視範囲にあり、これらの波長では、血液(すなわち、ヘモグロビン)による信号吸収が著しく高い。また、NADH、リポ顔料、フラビンによる可視範囲での自己蛍光は、低レベルのGFPシグナルと自己蛍光の背景を区別することが困難になる重要な背景をもたらします。従来のフィルタペアイメージングの代わりにマルチスペクトル蛍光イメージングアプローチを採用し、スペクトル非混合アルゴリズムを使用することで、目的の器官における真のGFP信号を特定するのに役立ちます。したがって、生体内検出と多スペクトルGFPイメージングを生体内で全体での生物発光イメージングの強みを組み合わせることで、マウスの大きなコホートで定量可能なデータを最大化することができます。
動物研究にどのアプローチを選択しても、特に転移性負担を対象とした研究では、臓器/組織の検索前にすべての血液を抽出することを強くお勧めします。このプロトコルは、マウスから得られた全血サンプル(データは示されない)から得られたGFP信号をリアルタイムPCRアッセイにより、同一体型乳癌モデルで検出する。臓器/組織の血液量を最小限に抑えることで、標的臓器の偽陽性シグナルが減少します。
結論として、MDA-MB-231-Luc/GFP細胞を用いた異所性乳癌モデルは、ヒトTNBC患者の状態を密接に模倣する非常に関連性の高い動物モデルである。このモデルは、ヒトと同様の腫瘍微小環境における治療効果の研究、モニタリング、評価に不可欠です。デュアルレポーター細胞株の使用は、この異性所乳癌モデルの実用性をさらに高める。

米国では約8人に1人の女性が生涯に浸潤性乳癌を発症し、これらの女性の10%~20%が積極的なトリプルネガティブ乳癌(TNBC)サブタイプと診断される。原発性病変はほとんどの場合外科的に除去することができるが、亜臨床微小転移および化学抵抗性はそれを難治性疾患にする。重要なことに、転移性TNBCを有するほとんどの患者は、たとえ初期段階1で治療を受けたとしても、最終的に再発する。したがって、がんの不均一性、微小転移、および治療抵抗性は、TNBC患者の臨床結果の成功を制限する3つの大きな課題である。したがって、TNBCの多形分子背景をよりよく理解し、転移性疾患を制限する効果的な治療薬を開発することが急務である。
腫瘍転移は、腫瘍細胞が原発病変(すなわち、血管内切断)への侵入および血管内(すなわち、血管内切断)からの出口を介して、膜分解および腫瘍細胞脱出を介してそれ自身の普及を促進するために、その微小環境を制御し、誘惑する多段階のプロセスであり、最終的には血管内の適応および植民地化である2。動物モデルは、直接血液循環注射と直腸移植の2つの方法論が一般的に実施される乳癌転移を研究するために開発されました。直接血液循環注射のための一般的に採用された方法は、尾静脈注射を含むが、直接心臓注射3、直接脳注射4、および直接肝注射5を含む他のアプローチも採用されている。直接血液循環注射は人工転移モデルと呼ばれることが多く、これは、原発性病変および内空部からの腫瘍脱出を回避するため、迅速かつ容易であるが生理学的に正確ではない66、7、87,8である。直噴モデルと比較すると、直交性乳癌モデルは、肺などの遠隔器官における検出可能な転移性病変の発生に時間がかかるが、ヒトで起こる多段階転移過程を密接に模倣するため、より生理学的に関連する。重要なことに、2013年の研究9は、尾静脈注射と直腸モデルを比較し、尾静脈に注入された乳癌細胞と尾静脈注射後の肺転移病変から分離されたものが同様のグローバル遺伝子発現プロファイルを示したことを発見した。対照的に、同一性注入乳癌細胞の全域遺伝子発現プロファイルは、同交性注入細胞9に起因する肺転移性病変のそれとは劇的に異なっていた。これらの観察は、転移性病変がヒトで起こるように転移の多段階プロセスと同様の選択プロセスを経るので、正交性モデルがより生理学的に関連していることを示唆している。
この研究は、イメージング検出技術のために当研究室で最適化されたヌードマウスの好交性乳癌(MDA-MB-231-Luc/GFP)モデル、ならびに新しいバイオマーカーの同定および標的化学療法剤の開発について説明する。

<table><tbody><tr><td>Bouins Solution</td><td>Sigma</td><td>HT10132-1L</td><td>肺転移性結節</td></tr>染色 <tr><td>D-ルシフェリン、カリウム塩</td><td>GoldBio</td><td>LUCK-1G</td><td>ルシフェラーゼ基質</td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10503027</td><td>DNA 抽出キット</td></tr><tr><td>Excel マイクロソフト</td><td></td><td></td><td>スプレッドシート ソフトウェア</td></tr><tr><td>ホモジナイザー</td><td>Virtis</td><td>サイクロン Virtishear</td><td>組織の均質化に</td></tr><tr><td>IVIS SPECTRUMスキャナー</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>蛍光およびBLIイメージングシステム</td></tr><tr><td>Maestro GNIR-FLEX蛍光スキャナー</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>蛍光イメージングシステム</td></tr><tr><td>MatriGel Matrix</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>-20°Cで保存し、使用中は古い(4°C)保管してください。</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP 安定細胞株</td><td>GenTarget</td><td>SC044</td><td>Dual Reporter ヒト乳がん細胞株</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ThermoFisher</td><td>EVOS</td><td>組織学画像キャプチャ</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td>リンスバッファー</td></tr><tr><td>Primer3</td><td>MIT</td><td></td><td>Primer Design</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>統計解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A1113803</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>RPMI 1640培地</td><td>サーモフィッシャー</td><td>61870127</td>培<td>地</td></tr><tr><td>SeniFAST SYBR Lo-ROXキット</td><td>バイオライン</td><td>BIO-94020</td><td>高速リアルタイムPCR試薬</td></tr><tr><td>StepOne Plus リアルタイムPCRシステム</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td>リアルタイムPCR装置</td></tr></tbody></table>

交感性乳癌モデルを用いたトリプルネガティブ乳癌の研究

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

トリプルネガティブ乳癌(TNBC)は、限られた治療選択肢を有する積極的な乳癌サブタイプである。あまり積極的な乳房腫瘍を有する患者と比較すると、TNBC患者の5年生存率は、その特徴的な薬剤耐性表現型および転移性負担のために77%である。この目的に向けて、マウスモデルは、TNBC腫瘍の増殖および転移性広がりを制限する新しい治療戦略を同定することを目的として確立されている。この研究は、ヒトの癌細胞挙動を密接に模倣する第4乳腺脂肪パッドに、基底膜マトリックスに懸濁したMDA-MB-231乳癌細胞を移植するTNBC同位体モデルの実用的なガイドを説明する。キャリパーによる腫瘍の測定、生体内およびエキソビボイメージングによる肺転移評価、および分子検出について検討する。このモデルは、治療効果を研究するための優れたプラットフォームを提供し、原発性腫瘍と遠位転移部位との相互作用の研究に特に適している。

キャリパーによる腫瘍体積測定は、治療効果を評価する十分に確立された方法である(図1)。移植された細胞の数、基質膜マトリックスの使用、マイクロバイオーム、施設の清潔さ、および注射部位は、腫瘍の増殖速度に影響を与える重要な要因です。
GFPイメージングとは異なり、BLIはBLIイメージングの少なくとも15〜20分前にルシファーゼ基板の投与を必要としました。さらに、マウス株、細胞株、治療、およびルシファーゼレポーターはすべて生物発光シグナルレベルに影響を与える。したがって、研究群間で同等のシグナルを得るためには、イメージング前のBLI運動研究を行い、最良のイメージング時間を決定する必要があります(図2)。
優れたシグナル対バックグラウンド比26,27,27により、生体発光イメージングの生体内全身は、GFPアプローチに比べて低レベル転移シグナルの検出に非常に敏感であった(図3)。さらに、生物発光シグナルは、数ミリメートルでGFPよりも深い浸透を提供した。しかし、生物発光シグナル産生は、EX生体組織サンプルを評価する際の制限因子であるATPを必要とする。動物が迅速に処理されれば、BLIは転移に関する定量的な結果を得るための実行可能なアプローチである可能性があります。これを実現する1つの方法は、一度に1匹の動物を処理することです。しかし、このアプローチは、マウスの大きなコホートが使用されたため、この研究には不可能であった。BLIシグナルは、ルシフェリン注射後45分前後で臓器が画像化されたときに検出されなかった。この状況では、デュアルレポーターセルラインを使用すると便利です。GFP分子の安定した性質により、研究者は標的臓器からGFP信号を捕捉する前に死体を処理するのに十分な時間を持っているであろう(図4)。
図5は、異種移植片が生存可能な腫瘍細胞含有量のほとんどを失ったが、依然として大きな質量と形状を維持しているため、キャリパー腫瘍サイズ測定がデータ解釈を歪める方法の実際の例を示している。これらの異種移植片の病理組織学的検査は、塊の中で壊死を示した(図5B)。
正腸性乳癌モデルにおける脳転移に関する画像化結果に挑戦する研究者にとって、リアルタイムPCRによる分子検出は説得力のある証拠を提供できる(図6)。この場合、外因性GFP DNA配列は、トランスフェクトされたGFP DNA配列がヒトやげっ歯類に自然に存在しないため、この問題に対処する最良の方法でした。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig1.jpg"> 図1:腫瘍体積測定。異種移植移植後10日目にキャリパーによる腫瘍体積/負荷測定を開始し、実験終了まで週2回測定した。誤差範囲は SEM 値で計算されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig2.jpg"> 図2:最適な画像取得ウィンドウの決定左:大きな異種移植片を有するマウス1個と、小さな異種移植片を有するマウス1個を、最適なルシフェリン運動範囲決定のために選択した。右:ルシフェリン運動曲線は、2分ごとに40分間画像を取得することによって得られる。15~22分間の間にプラトーを観測し、その後の全ての撮像に最適な画像取得時間として使用した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig3.jpg"> 図3:全身BLIイメージング。L:全身BLIイメージング。M:下半身が黒い手袋の袖で覆われた腹側の眺め。R:下半身が黒い手袋の袖で覆われた後ろビュー。神経節節転移は、BLIイメージングによって腹側図で検出される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig4.jpg"> 図4:元のvivo BLI/GFP信号検出。マウスが屠殺された20分後に同じマウスから脳と肺でGFP信号が検出された。BLIシグナルは、ルシフェリン注射後45分検出されなかった。ナイーブマウス脳と肺ではGFPシグナルは検出されなかった。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig5.jpg"> 図5:キャリパー測定に対する光学イメージング技術の利点(A)初発腫瘍における生体内GFPシグナル検出を示す代表的な画像。異種移植片のわずかな部分だけがGFPシグナルを示し、質量のかなりの部分が間質であることを示唆した。これは従来のキャリパー測定では決定できず、不正確な結論につながる可能性があります。この例は、動物モデル研究における光学イメージングの重要性を強調しています。(B)壊死領域(すなわち、内領域)が腫瘍サイズ計算にも寄与したことを示す同一マウスの組織病理学部。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig6.jpg"> 図6:融解曲線解析GFPアンプリコンの特異性を示すメルトカーブプロット。MDA-MB-231-Luc/GFP移植マウスから得られた脳からのDNAと、培養で増殖したMDA-MB-231-Luc/GFP細胞から単離されたDNA(陽性対照)をアッセイした。リアルタイムPCRアッセイを行い、脳組織中のGFP含有量を評価した。(A,B)陽性対照の融解曲線とマウス脳から抽出されたDNAをそれぞれ。(C)パネルAとBの重なり合った曲線は、マウス脳DNAからのピーク信号が外因性GFP配列に特異的であることを示す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig6large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

本研究は、緑色蛍光タンパク質および生物発光シグナルの検出と定量的分子検出技術の統合によって腫瘍負荷を正確に評価するための高度なプロトコルをプリセットする。

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

当社のプロトコルは、PCR分析による微小転移の検出と定量化を容易にするGFPタグを含めることで、限られた生物発光イメージングウィンドウを克服します。GFPタグは限られた生物発光獲得ウィンドウを回避するため、信号損失なしでより多くの被験者を画像化することができ、偽陰性の結果の可能性は限られている。この研究は、抗がん剤の治療効果の評価に役立つ研究者に有用であろう。この方法論は、EMT、薬剤耐性、および転移過程に関連する癌幹細胞機構および抗癌薬の開発に関心を持つ研究者に有用なモデルを提供する。ペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、アルコールで左4番目の乳腺をスワブし、細かいラット歯の鉗子を使用して4番目の乳腺をわずかに持ち上げる。先端がベベルアップされていることを確認し、細胞基膜マトリックスミックスの100マイクロリットルを含む1ミリリットルの注射器に取り付けられた25ゲージ針を挿入し、針が血管に接触しないことを確認するためにプランジャーをわずかに引き込みます。比較結果のために、腫瘍細胞注入部位は、すべてのレシピエント動物間で一貫している必要があります。血液が注射器に入らない場合は、溶液の全容を乳腺脂肪パッドにゆっくりと注入する。丸い盛り上がった塊が皮膚の下に現れます。基部膜マトリックスが硬化してから針を取り除き、異種移植片が腫瘍サイズ測定を行う前に7〜10日間中断することなく自由に成長できるように10〜15秒待ちます。次に、キャリパーを使用して、すべてのマウスにおける異種移植片のサイズを測定し、示された式を使用して腫瘍体積を決定する。研究動物をイメージングする前に、研究のためのルシフェリン動態を得るために示されたパラメータを使用して、2分間間隔で40分間、3つの追加の腫瘍軸受マウスを画像化する。ピーク測定された生物発光信号を使用して、後続のすべての時点に最適な画像取得時間を定義します。転移イメージングを行うために、黒い手袋から切り取られたスリーブで原発腫瘍を覆い、麻酔薬をスキャナに入れ、肺転移イメージングのためにカメラに向かうマウスの腹側と脳転移のためにカメラに面したマウスの側と同じパラメータを使用してルシフェリン信号を画像化します。スキャナとデータ解析ソフトウェアを使用して、画像化された領域に関心領域を描画して、対象となる臓器全体をカバーし、転移性負担の評価を可能にし、生物発光出力を毎秒の総フラックスおよび光子として定量化します。生物発光シグナル定量後すぐに、脳と肺組織を収穫し、PBSの臓器を素早く洗い流して表面的な血液汚れを取り除きます。低い自己蛍光黒いプラスチック板の上に器官を置き、GFPの検出のためのスペクトルの非混合機能が装備されている多分スペクトル蛍光スキャナにサンプルを運ぶ。抽出した臓器のマルチスペクトルGFP画像を取得するには、10ナノメートルのステップサイズで500〜720ナノメートルの臓器をスキャンします。組織の自己蛍光プロファイルを得るために、未注入制御マウスの切除器官をスキャンする。さらに、画像GFP陽性組織、例えば原発性腫瘍のような、自己蛍光混合GFPプロファイルを取得する。これらのスペクトルをメーカーのプロトコルに従って処理し、純粋なGFPおよび自動蛍光プロファイルを備えたスペクトルライブラリを確立します。スペクトルライブラリの精度を確認し、GFP信号を組織自動蛍光の背景から分離した後、同じライブラリを利用して研究上のすべての画像をアンミックスする。スナップ凍結後のDNA抽出のために、2ミリリットルのDNAリシスバッファーを含む5ミリリットル均質化チューブに脳全体を入れ、ホモジナイザーを50にセットして組織を均質化します。組織が完全に均質化されたら、1ミリリットルのライゼをDNAAseおよびRNAseフリー2ミリリットルマイクロ遠心チューブに移し、製造業者のプロトコルに従ってDNAを単離する。100%エタノールの500マイクロリットルを分離物に加え、反転によってサンプルを混合する。室温で3分後、ピペットを使用して、ウール様DNA沈殿物を新しい2ミリリットルのDNAAseおよびRNAseフリーチューブに移します。サンプルの空気を1分間乾燥させてから、75%エタノールの1ミリリットルをチューブに加え、チューブを3~6回反転させてサンプルを洗浄します。最後の反転後にエタノールを捨ててから、DNAを洗浄ごとに新鮮なエタノールでさらに2回洗浄します。最後の洗浄後、サンプルを10秒間乾燥させてから、DNAを52マイクロリットルの水酸化ナトリウムを52マイクロリットルで溶解します。2マイクロリットルのDNAアリコートを分光光度計バイアルに移し、式に従ってA260と280の間の吸光度比を使用してサンプル中のDNAの濃度を定量化する。追加の8ミリモル水酸化ナトリウムでサンプルのDNA濃度をマイクロリットル当たり50ナノグラムに調整し、GFPタグと腫瘍の遠位部位に侵入してコロニー形成した転移細胞のリアルタイムPCR検出のためのオープンソースプライマー設計ウェブポータルを使用して、外因性の緑色GFP配列に固有のプライマーペアを社内で設計します。次に、高速リアルタイム PCR 試薬と、サンプルのリアルタイム定量 PCR 分析に高速リアルタイム PCR プロトコルをサポートするリアルタイム PCR マシンを使用します。肺の転移性乳癌細胞の検出には、切除ハサミを使って胸腔を開き、心臓と胸腺を切り抜いて気管を露出させる。ブイン溶液を含む10ミリリットルの注射器に取り付けられた22ゲージの針を気管に挿入し、崩壊した肺が溶液の約2ミリリットルで腫れるまでプランジャーを押し下げ。肺が膨張したら注射器と針を取り出し、肺全体を新鮮なブイン溶液を含む15ミリリットルのチューブに移します。組織を残す前にチューブを数回軽く反転させ、室温で24時間浸します。翌日、肺を水ですすい、試料を70%エタノールのチューブに入れます。次に、解剖顕微鏡を使用して、肺の表面上の転移性白色パッチと結節の数を数えます。キャリパーによる腫瘍体積測定は、治療効果を評価するための十分に確立された方法である。研究グループ間で同等のシグナルを得るには、イメージング前のBLIキネティクス研究を行い、最良のイメージング時間枠を決定する必要があります。優れた信号対バックグラウンド比により、生体内BLIの全身はGFPアプローチに比べて低レベル転移信号の検出に非常に敏感です。しかし、GFP分子の安定した性質のために、研究者はデュアルレポーター研究で標的臓器からGFP信号を捕捉する前に死体を処理するのに十分な時間を持っています。この実生活の例は、キャリパー腫瘍サイズ測定が、この異種移植片が大きな質量と形状を維持しながら生存可能な腫瘍細胞含有量のほとんどを失ったとして、データ解釈を歪める方法を示しています。リアルタイムPCRによる分子検出は、ヒトやげっ歯類に自然に存在しないGFPDNA配列が外因性GFPDNAシーケンシングを用いた交感性乳癌モデルにおける脳転移の説得力のある証拠を提供することもできる。移植部位は、癌の悪性腫瘍に生理学的および解剖学的に関連するべきである。腫瘍遺伝子およびタンパク質発現の両方を、一次および遠位部位で評価することができ、転移性細胞は、さらなる特徴付けのために単離することができる。

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