Name: 高分子表面上の吸着タンパク質層におけるトール様受容体媒介NF-kB/AP-1シグナル伝達を調べるマクロファージレポーター細胞アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学ぶ 高分子表面のタンパク質層で培養したマクロファージレポーター細胞におけるNF-κB/AP-1活性評価法。この簡便な酵素アッセイにより、トール様受容体介在シグナル伝達を迅速に解析し、生体材料の免疫応答メカニズムを解明する。

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著者らは、カナダ保健研究プロジェクト(PTJ 162251)、クイーンズ大学上院諮問委員会、カナダイノベーション財団ジョン・エヴァンのリーダーシップ基金(プロジェクト34137)および研究革新オンタリオ研究基金(プロジェクト34137)からのインフラ支援からの運営資金を感謝して認めています。L.A.M.は、クイーンズ大学R.サミュエル・マクラフリン・フェローシップ、カナダカナダ大学院奨学金修士賞、オンタリオ州大学院奨学金の自然科学・工学研究評議会の支援を受けました。著者たちは、NF-κB/AP-1レポーターマクロファージ細胞株とマイケル・ブレナーハセット博士とサンドラ・ロウレンセン博士のゲルイメージングシステムとプレートプレートの使用に対する寛大な贈り物に対するマイロン・シェフツク博士に感謝したいと思います。

著者たちは何も開示する必要はない。

私たちの研究室の主な焦点は、固体生体軟組織インプラントに対する宿主応答であり、特に移植手順中に生じた細胞損傷が宿主応答にどのような影響を与えるかである。ここで提示する研究は、レポーターマクロファージ細胞株とインビトロ生成DAMP含有細胞リサートを用いた予備実験について説明し、細胞損傷中に放出される分子の影響(すなわち、インプラント手術から)が生体材料に対するマクロファージ応答に及ぼす影響を調べる。線維芽細胞リサートは、生体材料の配置によるMMPの細胞損傷および放出をモデル化するために使用された。線維芽細胞は、軟部組織における線維芽細胞の蔓延、ならびにフィブロネクチン18を含む様々な細胞外マトリックス(ECM)タンパク質を分泌する能力のために、リジン酸塩を作成するために選択された。凍結融解サイクリングは、インプラント環境に存在するものと同様に、細胞内およびECM由来のDampの両方を生成するリシスの方法として選択された。プロテアーゼ阻害剤は、このリサートを作るために使用されなかった.凍結融解サイクリングのような制御されていない細胞分解は、Dammpを分解する可能性のあるプロテアーゼの放出をも...

異物反応(FBR)は、移植された物質または装置(例えば、薬物送達装置、バイオセンサー)の性能に悪影響を及ぼし得る慢性宿主応答であり、炎症メディエーターの持続的放出を通じて、および移植された物質と周囲組織1との間の統合を妨げることによって。この自然免疫応答は、移植手順によって開始され、インプラント1の周りに先天性免疫細胞および線維性カプセル形成の長期存在によって特徴付けられる。物質ホスト応答の文脈の中で、マクロファージ材料相互作用は、ホスト応答の進行およびFBR1の開発に大きな影響を与える。マクロファージは、多様な自然免疫細胞集団であり、組織常駐マクロファージ集団または単球由来マクロファージとして血液のいずれかからインプラント部位にリクルートされる。彼らは移植直後にインプラント部位に蓄積し始め、数日以内にインプラント微小環境における主要な細胞集団となる。材料接着マクロファージは、マクロファージ融合によって形成される異物巨細胞(FBGC)とともに、インプラント2、3の寿命にわたって材料表面で持続し得る。その結果、マクロファージは、FBRの特徴的なステップを調整する役割に起因する異物反応の主要なプレーヤーであると考えられる:急性炎症反応、組織改造、および線維組織の形成1。
トール様受容体(TR)は、マクロファージを含む多くの免疫細胞によって発現されるパターン認識受容体のファミリーであり、炎症および創傷治癒において重要な役割を果たすることが示されている。病原体由来のリガンドに加えて、TRは、細胞壊死中に放出される損傷関連分子パターン(DamP)として知られる内因性分子に結合し、炎症性サイトカイン4の産生をもたらす炎症性シグナル伝達経路を活性化することができる。我々および他の人は、軟組織生物質注入手順中に生じた損傷が、血液タンパク質に加えて生体材料表面に吸着し、その後の細胞と物質間相互作用を調節する、Dammpを放出することを提案している。マクロファージがインプラント上の吸着タンパク質層と相互作用すると、その表面TRは吸着したDRPを認識し、炎症性シグナル伝達カスケードを活性化し、NF-κBおよびAP-1転写因子活性化および炎症性サイトカインの産生につながる。我々は、マウスマクロファージがNF-κB/AP-1活性および腫瘍壊死因子α(TNF-α、 炎症性サイトカイン)は、吸着血清または血漿のみ(すなわち、DMPが存在しない)の表面と比較して様々なポリマー表面上のDAMP含有吸着タンパク質層に応答して、かつこの応答がTLR2によって主に媒介されることを、TLR4はより少ない役割を果たしている5。
このプロトコルで使用されるNF-κB/AP-1レポーターマクロファージ細胞株(材料表)は、マクロファージ5、7、8における相対的なNF-κBおよびAP-1活性を測定するための便利な方法である。TLR経路阻害剤と組み合わせて、この細胞株は、様々な刺激5、7、8に応答して炎症におけるTLR活性化およびその役割を調べるのに有用なツールである。レポーター細胞は、NF-κBおよびAP-1転写因子活性化9に際して分泌胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)を安定的に産生することができる改変マウスマクロファージ様細胞株である。比色酵素アルカリホスファターゼアッセイ(材料表)は、NF-κB/AP-1活性の間接尺度としてSEAP発現の相対量を定量するために使用することができる。NF-κBおよびAP−1は多くの細胞シグナル伝達経路の下流にあるように、特定のTLR(例えば、TLR2)またはTLRアダプタ分子(例えば、MyD88)を標的とする中和抗体および阻害剤は、特定の経路の役割を検証するために使用することができる。この記事で説明する方法論は、移植されたバイオマテリアルのインビトロモデルとして、血液タンパク質とDMPの両方を含む吸着タンパク質層を有する様々なポリマー表面に対するマウスマクロファージ応答におけるTLRシグナル伝達の寄与を評価するための簡単かつ迅速なアプローチを提供する。

<table><tbody><tr><td>細胞培養試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗マウス/ヒトCD282(TLR2)</td><td>Biolegend</td><td>121802</td><td></td></tr><tr><td>CLI-095(TLR4阻害剤)</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-CLI95</td><td></td></tr><tr><td>C57補体血漿K2 EDTA 10ml、革新的グレード米国起源</td><td>革新的研究</td><td>IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml</td><td>マウス血漿</td></tr><tr><td>ダルベッコの改変ワシ培地(DMEM)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D6429-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水(DPBS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14190250</td>カルシウム<td>、マグネシウムなし</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)、研究グレード</td><td>Wisent</td><td>98150</td><td></td></tr><tr><td>LPS-EK</td><td>インビボゲン</td><td>TLRL-EKLPS</td><td>大腸菌K12からのリポ多糖</td></tr><tr><td>NIH/3T3 線維芽細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Pam3CSK4</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pms</td><td>合成トリアシル化リポペプチド - TLR1/2 リガンド</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Plasmocin</td><td>Invivogen</td><td>ANT-MPP</td><td>マイコプラズマ除去試薬</td></tr><tr><td>RAW-Blue cells</td><td>Invivogen</td><td>raw-sp</td><td>NF-&カッパ;B/AP-1 レポーターマクロファージ細胞株</td></tr><tr><td>Trypan 青色溶液、0.4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE 発現酵素 (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12604021</td><td>動物由来フリーの組換え細胞解離酵素</td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invivogen</td><td>ANT-ZN-1</td><td></td></tr><tr><td>Kits and assays</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ELISAプレコートプレート、マウスIL-6</td>バイオ<td>レジェンド</td><td>B213022</td><td></td></tr><tr><td>ELISAプレコートプレート、マウスTNF-&alpha;</td><td>Biolegend</td><td>B220233</td><td></td></tr><tr><td>エンドトキシン(大腸菌) - コントロールスタンダードエンドトキシン(CSE)</td><td>Associates of Cape Cope Inc.</td><td>発</td><td>色性エンドトキシンアッセイLAL水の標準曲線用エンドトキシン</td></tr><tr><td>、100 mL</td><td>Associates of Cape Cope Inc.</td><td>WP1001</td><td>発色性エンドトキシンアッセイ</td></tr><tr><td>Micro BCAタンパク質アッセイ</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI23235</td><td></td></tr><tr><td>Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit</td><td>Associates of Cape Cope Inc.</td><td>C1500-5</td><td>発色性エンドトキシンアッセイ試薬</td></tr><tr><td>QUANTI-Blue アルカリホスファターゼ検出培地</td><td>Invivogen</td><td>rep-qb2</td><td>NF-&kappaを間接的に測定するアルカリホスファターゼアッセイ;B/AP-1 活性</td></tr><tr><td>高分子コーティング試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム、無水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306-1L</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール無水</td><td>市販アルコール</td><td>P006EAAN</td><td>Sigma: 試薬アルコール、無水、676829-1L</td></tr><tr><td>ストレートテーパー細先端鉗子</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>16-100-113</td><td></td></tr><tr><td>フッ素活性FC-40溶媒</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9755-100ML</td><td>fPTFE細胞培養グレード水用フッ素化溶媒</td></tr><tr><td>(エンドトキシンフリー)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>SH30529LS</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(メタクリレートメチル)(PMMA)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>182230-25G</td><td></td></tr><tr><td>シルガード184エラストマーキット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50822180</td><td></td></tr><tr><td>テフロンAF(fPTFE)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>469610-1G</td><td>ポリ [4,5-ジフルオロ-2,2-ビス(トリフルオロメチル)-1,3-ジオキソール-co-テトラフルオロエチレン]</td></tr><tr><td>消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>接着プレートシール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>Axygenマイクロチューブ、1.5 mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-222-155</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスシンチレーションバイアル、白いポリプロピレンキャップ付き</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>クリアPS 48ウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-772-52</td><td></td></tr><tr><td>クリアTCPS 96ウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-772-2C</td><td></td></tr><tr><td>クリアTCPS 48ウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-772-1C</td><td></td></tr><tr><td>カバーグラス、サークル</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン組織培養処理フラスコ、T25</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10-126-10</td><td></td></tr><tr><td>スティッキースライド 8 ウェル</td><td>イビディ</td><td>80828</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロスト顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>組織培養処理フラスコ、T150</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-772-48</td><td></td></tr></tbody></table>

高分子表面上の吸着タンパク質層におけるトール様受容体媒介nf-kb/ap-1シグナル伝達を調べるマクロファージレポーター細胞アッセイ

A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces

異物反応として知られる移植された生体材料に対する持続的な炎症宿主応答は、生物医学デバイスおよび組織工学構造の開発および実施において重要な課題である。先天性免疫細胞であるマクロファージは、装置の寿命にわたってインプラント部位にとどまるため、異物反応の主要なプレーヤーであり、この有害な宿主応答の理解を得るために一般的に研究されている。多くのバイオマテリアル研究者は、移植された材料に吸着したタンパク質層がマクロファージの挙動に影響を与え、その後宿主の応答に影響を与えることを示しています。本論文の方法では、ポリマー生体材料表面上の細胞損傷分子を含む吸着タンパク質層を用いたインビトロモデルを用いてマクロファージ応答を評価する。NF-аB/AP-1レポーターマクロファージ細胞株および関連する比色アルカリホスファターゼアッセイは、体内の生物材料表面に形成された複雑な吸着タンパク質層のモデルとして、血液タンパク質および損傷関連分子パターンを含む複雑な吸着タンパク質層に応答してNF-аB/AP-1転写因子活性を間接的に調べる迅速な方法として使用された。

ポリマー被覆面の洗浄方法を試験し、コーティングの中断がないことを確認した。PMMA被覆顕微鏡スライドを70%エタノールに1時間浸漬してPMMAコーティング(図2、左パネル)を除去することが分かり、80重量%エタノール13におけるPMMAの溶解度に起因する可能性が高く、従ってPMMA被覆面を30分間のUV殺菌だけで洗浄した。コーティングのためのPMMAの濃度は、以前に最適化された5.1時間70%のエタノール浸漬をPDMSの洗浄に用い、UV光が鎖の分裂を引き起こし、PDMS14の表面湿潤特性に影響を与える可能性があるため、紫外線殺菌は無視された。70%エタノール浸漬および紫外線殺菌の両方がfPTFE被覆カバーリップの水接触角に影響を及ぼさなかった(図2、右パネル)のしたがって、2つの方法は、連続して、fPTFEコーティング...

このプロトコルは、生体材料インプラント微小環境をモデル化する様々なポリマー表面および吸着タンパク質層に応答して、マウスマクロファージ細胞株におけるTLR依存性NF-аb/AP-1転写因子活性を測定する迅速かつ間接的な方法を研究者に提供する。

高分子表面上の吸着タンパク質層におけるトール様受容体媒介NF-kB/AP-1シグナル伝達を調べるマクロファージレポーター細胞アッセイ

The persistent inflammatory host response to an implanted biomaterial, known as the foreign body reaction, is a significant challenge in the development ...

このプロトコルは、吸着タンパク質層上で培養されたレポーターマクロファージにおけるNF-κ-BおよびAP-1活性の迅速な評価と、Toll様受容体のような細胞シグナル伝達経路の寄与を、その応答に可能にする。この技術の主な利点は、そのシンプルさであり、細胞培養上清を簡単な酵素アッセイを使用してNF-kappa-BおよびAP-1活性について迅速に分析することが可能です。ヒュームフードの20ミリリットルガラスシンチレーションバイアルで、1ミリリットルの最終濃度で20ミリグラムのクロロホルムでPMMAを溶解させることから始めます。バイアルに磁気攪拌棒を入れ、混合物を少なくとも2時間かき混ぜます。すべての固形物が溶解したら、PMMA溶液の400マイクロリットルをスピンコート機上の計画状態ごとに各ホウケイ酸ガラス顕微鏡スライドの中央に移し、PMMAを1分間に3,000回転でスライドに2分間回転させます。その後、スピンコートスライドを70%エタノールスプレークリーンボックスに保管します。次に、生物学的安全キャビネットで、無菌鉗子と無菌技術を使用して、8チャンバーの粘着性のある井戸をPMMAコーティングスライドに取り付け、各粘着性の上部にしっかりと押し付けて強く取り付けられていることを確認します。すべてのウェルがスライドに取り付け、漏れないように、粘着井戸を顕微鏡スライドの端に並べるように注意してください。シールを固定するために一晩摂氏37度で粘着性のよく取り付けられたスライドをインキュベートします。その後、200マイクロリットルの細胞培養グレードの内毒素フリー水を各井戸に加え、室温で60分間インキュベーションし、翌朝シールをテストします。インキュベーションの終わりには、水を吸引し、PMMAコーティングを乱さないように注意する。1回1時間、300マイクロリットルの新鮮な内毒素フリー水で3回、残りの溶剤を除去するために使用する前に12時間と1回24時間洗浄します。その後、30分間のスライドをUV殺菌します。3T3細胞ライセートを得るために、3T3細胞培養がT150培養フラスコで70%合流に達すると、各培養物を5ミリリットルのPBSで洗浄し、37°Cの酵素フラスコ当たり5ミリリットルの細胞を3〜5分間摂氏37度で処理する。インキュベーションの終わりに、各フラスコを数回ゆっくりと前後に傾けて細胞を取り外してから、培養ごとに5ミリリットルのPBSで酵素を中和する。解約した細胞を単一の50ミリリットル遠心分離チューブにプールし、ピペットを使用して細胞の塊を分解します。カウント後、遠心分離により細胞を採取する。上清を吸引し、新鮮なPBS中で1ミリリットル濃度当たり6細胞に1回10回で細胞を再懸濁した。その後、完全に解凍されるまで37°Cの水浴に凍結細胞溶液を置く前に、サンプルが完全に凍結さ

a-macrophage-reporter-cell-assay-to-examine-toll-like-receptor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

シアリダーゼのアッセイは、微生物感染と生マクロファージの細胞表面の受容体レベルでの炎症性疾患への関与のTLRセンサの新しい分子機構（s）を解明する簡単な技術的なアプローチです。...

Toll様受容体の活性化を調節するのNeu1シアリダーゼ活性の検出

出典: バルベロ, A. M., et.al. 免疫受容体SLAMF1と結 核菌 の相互作用研究のための蛍光アッセイ。 J. Vis. Exp. ((2025年)このビデオでは、マクロファージ受容体と 結核菌...

マクロファージ受容体と細菌抗原の相互作用を調査するための蛍光ベースアッセイ

このビデオは、マクロファージにおける転写因子核因子-κ-B(NF-κB)および活性化因子タンパク質-1(AP-1)のToll様受容体(TLR)依存性活性を調べるアッセイを示しています。TLRは、損傷関連分子パターン(DAMP)を認識すると炎症誘発性シグナル伝達カスケードをトリガーし、NF-κBおよびAP-1を活性化します。遺伝子操作されたレポーターマクロファージは、NF-κBおよびAP-1の活性化により分泌された胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)酵素を産生し、これは発色反応によって検出されます。...

マクロファージにおけるTLR依存性NF-&kcy;B/AP-1転写因子シグナル伝達のアッセイ

このビデオは、Toll様受容体(TLR)シグナル伝達を阻害する可能性のある生理活性ナノ粒子をスクリーニングするためのレポーター細胞ベースのアッセイを示しています。このアッセイでは、ペプチド-金ナノ粒子ハイブリッドと混合したリポ多糖(LPS)を、レポータータンパク質(分泌型胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)およびルシフェラーゼ)を発現するレポーターマクロファージに導入します。ハイブリッドによって媒介されるLPS誘導TLR信号の減少は、レポーター信号を測定することによって決定されます。...

Toll様受容体シグナル伝達阻害のための生理活性ナノ粒子のスクリーニングアッセイ

樹状細胞（DC）は、ニゲリシンとNLRP3ソーム活性化に続いて、合成プリン、R848のTLR8認識に応答してIL-1βを分泌し、したがって、IL-1βはNLRP3ソーム活性を測定するために使用することができる。細胞内サイトカイン染色、イムノブロッティング、およびELISAを正確にIL-1βの発現を介してNLRP3ソームプライミングおよび活性化を測定するために使用される。...

ヒト単球由来樹状細胞におけるIL-1βを用いて活性化し、NLRP3ソーム活性の測定

このプロトコルでは、Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle...

マウスマクロファージにおける先天性免疫応答を調査するために、RNA干渉を使用

私たちは、ヒトマクロファージの生成のための簡単​​かつ効率的なプロトコルを提示する。バフィーコートは、二重密度勾配遠心分離によって処理され、単離された単球は、次いで、テフロンコーティングした細胞培養バッグ中でマクロファージに分化される。これは、マクロファージ収量を最大化し、その後の実験のために細胞の回収を容易にします。...

ダブル勾配遠心、テフロンコーティングされた細胞培養バッグ中のマクロファージへの分化によるヒト単球の単離

ここでは、接着性マクロファージ細胞株による蛍光粒子の食作用を蛍光測定法を用いて定量化するプロトコールを紹介します。この方法により、粒子の内在化とそれに伴うアクチン重合のハイスループット定量が容易になります。...

マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

全反射蛍光顕微鏡を用いて、生きたマクロファージにおける前例のない高分解能のファゴソーム形成とクロージャを3次元で可視化するための実験設定について説明します。これにより、食細胞カップの基部、伸びる偽足、および食細胞の正確な部位を監視できます。...

「ファゴソーム閉鎖アッセイ」全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を用いて、三次元的にファゴソーム形成を可視化します

Toll様受容体（TLR）シグナル伝達は、多くのヒト炎症性疾患の病態生理学において重要な役割を果たし、生物活性ナノ粒子によるTLR応答の調節は、多くの炎症状態において有益であると予想される。 THP-1細胞ベースのレポーター細胞は、TLRシグナル伝達の新規インヒビターを同定するための多目的で堅牢なスクリーニングプラットフォームを提供する。...

トール様受容体シグナル伝達の阻害剤に対する食作用性免疫細胞における生物活性ナノ粒子のスクリーニング

学ぶ 高分子表面のタンパク質層で培養したマクロファージレポーター細胞におけるNF-κB/AP-1活性評価法。この簡便な酵素アッセイにより、トール様受容体介在シグナル伝達を迅速に解析し、生体材料の免疫応答メカニズムを解明する。

高分子表面上の吸着タンパク質層におけるトール様受容体媒介NF-kB/AP-1シグナル伝達を調べるマクロファージレポーター細胞アッセイ

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