Name: 一定の流れの原発性ヒト内皮細胞の肺炎球菌感染 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 学ぶ 一定の流れ下での原発性ヒト内皮細胞の肺炎球菌感染メカニズム。シア応力環境における細菌の接着と血管インテグリティへの影響を可視化する手法を解説します。

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<ol><li>Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae%3A+transmission%2C+colonization+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).</li>
<li>Bergmann, S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatility+of+pneumococcal+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Versatility of pneumococcal surface proteins.</a> Microbiology. 152, 295-303 (2006).</li>
<li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-linked+kinase+is+required+for+vitronectin-mediated+internalization+of+Streptococcus+pneumoniae+by+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells.</a> Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).</li>
<li>Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+bacterial+enolase+and+plasminogen+promotes+adherence+of+Streptococcus+pneumoniae+to+epithelial+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells.</a> International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).</li>
<li>Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae+is+a+plasmin%28ogen%29-binding+protein+displayed+on+the+bacterial+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface.</a> Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).</li>
<li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+plasmin%28ogen%29-binding+motif+in+surface+displayed+alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae.</a> Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).</li>
<li>Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nine+residue+plasminogen-binding+motif+of+the+pneumococcal+enolase+is+the+major+cofactor+of+plasmin-mediated+degradation+of+extracellular+matrix%2C+dissolution+of+fibrin+and+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration.</a> Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).</li>
<li>Jagau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Von+willebrand+factor+mediates+pneumococcal+aggregation+and+adhesion+in+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 511(2019).</li>
<li>Tischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+local+disorder+in+a+clinically+elusive+von+willebrand+factor+provokes+high-affinity+platelet+clumping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping.</a> Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).</li>
<li>Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+von+willebrand+factor+and+its+function+in+platelet+adhesion+and+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+Research+Clinical+Haematology%22%5BJournal%5D)">Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation.</a> Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).</li>
<li>Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Von+willebrand+factor+in+cardiovascular+disease%3A+Focus+on+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes.</a> Circulation. 117, 1449-1459 (2008).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Von+Willebrand+factor%2C+Jedi+knight+of+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124, 1412-1425 (2014).</li>
<li>Luttge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+induces+exocytosis+of+weibel-palade+bodies+in+pulmonary+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells.</a> Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).</li>
<li>Cornish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+in+a+Pipe+of+Rectangular+Cross-Section%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+A%22%5BJournal%5D)">Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section.</a> Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).</li>
<li>Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+von+Willebrand+Factor+Pathophysiology+Using+a+Flow+Chamber+Model+of+von+Willebrand+Factor-platelet+String+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation.</a> Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).</li>
<li>Kjos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+Streptococcus+pneumoniae+for+live-cell+imaging+of+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions.</a> Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).</li>
<li>Bergmann, S., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+single+cells+to+engineered+and+explanted+tissues%3A+New+perspectives+in+bacterial+infection+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Reviews+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology.</a> International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).</li>
<li>Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromachining+a+miniaturized+capillary+electrophoresis-based+chemical+analysis+system+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip.</a> Science. 261 (5123), 895-897 (1993).</li>
<li>Magnusson, M. K., Mosher, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin%3A+Structure%2C+assembly%2C+and+cardiovascular+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).</li>
<li>Zerlauth, G., Wolf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+fibronectin+as+a+marker+for+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases.</a> The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).</li>
<li>Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2012.+Microfluidic+3D+cell+culture%3A+potential+application+for+tissue-based+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays.</a> Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).</li>
<li>Fiddes, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circular+cross-section+PDMS+microfluidics+system+for+replication+of+cardiovascular+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions.</a> Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).</li>
<li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).</li>
<li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultralarge+von+willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128, 50-59 (2013).</li>
<li>Schneider, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+unfolding+triggers+adhesion+of+von+willebrand+factor+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).</li>
<li>Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wall+shear+stress+as+measured+in+vivo%3A+consequences+for+the+design+of+the+arterial+system%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+%26+Biological+Engineering+%26+Computing%22%5BJournal%5D)">Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system.</a> Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).</li>
<li>Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+Weibel-+Palade+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of Weibel- Palade bodies.</a> Blood. 117, 5033-5043 (2011).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+animal+cells%3A+A+manual+of+basic+Technique%2C+5th+edition%22">Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition</a>. , Wiley-Liss Publication, Wiley-Blackwell. (2005).</li>
<li>Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+JA+%22Epithelial+cell+culture-+a+practical+approach%22">Epithelial cell culture- a practical approach</a>. Shaw, A. J. , IRL Press at Oxford University Press. 218(1996).</li>
<li>Elm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectodomains+3+and+4+of+human+polymeric+Immunoglobulin+receptor+%28hpIgR%29+mediate+invasion+of+Streptococcus+pneumoniae+into+the+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).</li>
<li>Nerlich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+endothelial+cells+by+tissue-invasive+M3+type+group+A+streptococci+requires+Src+kinase+and+activation+of+Rac1+by+a+phosphatidylinositol+3-kinase-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).</li>
<li>Ho, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-cell+patterning+lab+chip%3A+mimicking+the+morphology+of+liver+lobule+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue.</a> Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328, 1662-1668 (2010).</li>
<li>Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration-on-a-chip%3F+The+perspectives+on+use+of+microfluidics+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine.</a> Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

VWFのようなメカノ感受性宿主タンパク質との細菌相互作用のシミュレーションは、定義された、単方向、および液体の連続的な流れの生成を可能にする含水性細胞培養システムを必要とし、それによって信頼できるせん断応力を発生させる.いくつかのマイクロ流体ポンプシステムがすでに説明されている。Bergmannらからの包括的なレビューは、異なる2次元および三次元細胞培養モデル17の主要な側面をまとめた。
マイクロ流体技術は、マイクロメートルおよびナノメートルスケール18でも制御可能で再現性、および浸透性のマイクロ環境の開発と1990年代初頭に始まった非常に若い技術です。提示されたマイクロ流体アプローチは、細菌接着機構および関与タンパク質の広い範囲を研究するためにも適用することができる。これは、一般的に標準的な細胞培養技術を使用して接近できないVWFなどのメカノレスレス反応接着成分を含む任意の相互作用に最適です。例えば、いくつかの細胞外マトリックスタンパク質の立体構造は、その位置によって異なることは知られ...

肺炎球菌感染症の病因は、プラスミノーゲンおよびVWF1、2などのヒト止血症の細胞外マトリックス化合物および成分の多様性との多面的相互作用によって特徴付けられます。3,4,5,6,7,8.マルチドメイン糖タンパク質VWFは、血管血栓形成9の部位における血栓細胞リクルートおよびフィブリンの組み込みを媒食することにより、バランスのとれた止血症の主要な調節体として機能する。出血制御および創傷治癒のための機能的、活性VWFの重要性は、フォン・ヴィレブランド病、一般的な遺伝性出血性疾患10によって実証される。
球状VWFは、最大14.0μg/mL11、10の濃度でヒト血液系を循環する。血管損傷に対して、内皮ワイベルパレードボディ(WBP)によるVWFの局所放出は著しく増加する11、12である。これまでの研究では、肺炎球菌がヒト内皮細胞に付着し、細孔形成毒素肺炎の産生が発光VWF分泌13を有意に刺激することが示されている。血流の流体力学的力は、メカノレスポンシブVWFドメインの構造開口部を誘導する。10 dyn/cmの流量で、VWFは、サブ子宮皮10、12に取り付けられたままの長さ数百マイクロメートルまでの長いタンパク質ストリングに多量化する。
肺炎球菌と内皮表面との相互作用においてせん断応力下で発生する多量体化VWF弦の機能を理解するために、マイクロ流体ベースの細胞培養感染アプローチが確立された。ソフトウェア制御空気圧ポンプシステムを備えたマイクロ流体装置を使用した。これにより、定義された流量を有する細胞培養培地の連続的な単方向再循環が可能にされた。それによって、システムは、特殊なチャネルスライド内に取り付けられたままの内皮細胞の表面に定義されたせん断応力を適用した。このアプローチにより、定義された一定の流れ条件下で分化した内皮細胞にVWF弦が生成される、ヒト血管系の血流中のせん断力のシミュレーションが可能となった。この目的のために、内皮細胞を特定のチャネルスライドで培養した(材料表参照)。マイクロ流体ポンプシステムは、コンフルエント内皮細胞層上の拡張VWF弦の形成に必要な高度に定義され、制御されたせん断応力状況を提供しました。ヒスタミン補充によりヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を収縮的に増殖させたヒト臍静脈内皮細胞のVWF分泌の刺激後、弦形成は10dyn/cm2のせん断応力(・△)を加えることによって誘導された。せん断応力は、細胞層に作用する力として定義されます。コーニッシュetに従って計算される。al.14方程式 1: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ01.jpg">
ここで、dyn/cm2のせん断応力、ε = 粘度(dyn∙s)/cm2、h= チャネル高さの半分、w = チャネル幅の半分、および Φ = 流量 (mL/min) です。 
方程式 1 の結果は、使用するさまざまなスライドの高さと幅によって異なります (「材料表」を参照)。本研究では、0.4μmのルアーチャンネルスライドを用い、チャンバースライド係数131.6を用いた(式2参照)。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ02.jpg">
37°Cでの媒体の粘度は0.0072 dyn∙s/cm²であり、10dyn/cm²のせん断応力を使用した。その結果、流量は10.5mL/分になります(式3を参照)。 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ03.jpg">
ここで、宿主血管系における細菌感染機構の調査及び可視化のための単方向層流システムを用いた微小流体細胞培養手順の適応及び進歩について詳細に説明する。内皮層上のVWF弦の生成は、連続的で安定したせん断応力15を適用することができる他のポンプシステムを使用することによって刺激することができる。
VWF弦形成の流れと刺激に合流する一次内皮細胞の培養後、赤色蛍光タンパク質(RFP)16を発現する肺炎球菌16を、一定の顕微鏡制御下で内皮細胞層に添加した。内皮細胞表面のVWF弦への細菌の付着は、VWF特異的蛍光標識抗体を用いて顕微鏡的に可視化し、最大3時間リアルタイムで監視した。このアプローチにより、血管内皮への細菌付着を促進する接着補因子としてのVWFの役割が8と判定された。
タンパク質分泌と立体構造変化の顕微鏡的可視化に加えて、この方法は、細菌感染プロセスの単一ステップをリアルタイムで監視し、異なる時点での付着菌の量を定量化するために使用することができる感染。特定のソフトウェア制御ポンプシステムはまた、内皮細胞を定義された一定の流れ条件で数日間培養する可能性を提供し、定義されたパルス媒体フローインキュベーションを可能にする。さらに、このメソッドは、異なるセルタイプを使用して適用することができます。染色プロトコルを適応させることは、真核細胞に内部化された細菌の検出および可視化も可能にする。
この原稿では、病態生理学的プロセスの効率的かつ汎用的な特性評価のための定義された、信頼性が高く、再現可能なアプローチとして使用できるこの高度な実験プロトコルについて説明します。

<table><tbody><tr><td>1 mLルアーシリンジ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10303002</td>、<td>スライドのルアー接続を使用したゼラチン注入用</td></tr>容量1 mL <tr><td>2 mLルアーシリンジ</td><td>Sarstedt</td><td>9077136</td><td>チャネルチャンバースライドのルアー接続部に液体をピエッティング/注入するために</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>eBioscience now thermo fisher</td><td>00-4555-56</td><td>プロテアーゼミックス 内皮細胞の穏やかな剥離に使用されます</td></tr><tr><td>AlexaFluor350結合ファロイジン</td><td>Abcam</td><td>ab176751</td><td>メーカーから入手可能な濃度はありません、ストック溶液は300テットに十分です、会社は100 & microを使用することをお勧めします。1:1,000希釈、青色蛍光(DAPIフィルター設定)</td></tr><tr><td>AlexaFluor488標識ヤギ由来抗マウス抗体</td><td>Thermo Fisher Sientific</td><td>A11001</td><td>ストック濃度:PFA固定後のマイクロ流体スライド中のヒトVWFの免疫染色のための2 mg/mL、緑色蛍光</td></tr><tr><td>AlexaFluor568標識ヤギ由来抗ウサギ抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>ストック濃度:pFA固定後のマイクロ流体スライドにおける肺炎球菌の免疫染色用2 mg/mL、赤色蛍光</td></tr><tr><td>Bacto Todd-Hewitt-Broth</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>BD 249210</td><td>複合細菌培養培地</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-25G</td><td>、ブロッキングバッファーの調製用、</td></tr><tr><td>フィルターTPP</td><td></td><td>90026</td><td>表面 25 cm2</td></tr> 遠心<tr><td>分離機 Allegra X-12R</td><td>ベックマン・コールター</td><td>ライフサイエンス 392304</td><td>細菌のスピンダウン (>2mL の量)</td></tr> <tr><td>遠心分離機 Allegra X-30</td><td>ベックマン・コールター</td><td>ライフサイエンス B06314</td><td>真核細胞のスピンダウン</td></tr><tr><td>遠心分離機 Z 216 MK</td><td>Hermle</td><td>305.00 V05 - Z 216 M</td><td>細菌のスピンダウン(2mL未満の容量)</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG、カールスルーエ</td><td>3886.2</td><td>0.2 mg/mLの濃度で使用され、赤色蛍光タンパク質とクロラムフェニコール耐性カセットを運ぶ遺伝子構築物で形質転換した肺炎球菌の培養に</td></tr>使用 <tr><td>灌流チューブ用クランプ</td><td>スライド</td><td>をポンプシステムに接続するチューブベボルに液体を保持するための</td>同上<td>10821</td></tr><tr><td>CO2-インキュベーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>MIDI 40</td><td>インキュベーターサイズは、チャネルスライドが接続された流体ユニットのサイズに完全に適合しており、37°Cでのフロー培養に使用されました。Cおよび5% CO2</td></tr><tr><td>CO2-incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18 AIC</td> は、<td>5% CO2および37°Cで、定義された雰囲気で細菌と細胞をインキュベーションします。C</td></tr><tr><td>コロンビア血液寒天プレート</td><td>ベクトン・ディキンソン GmbH</td><td>PA-254005.06</td><td>寒天ベースの複合培養培地 S. pneumoniae 7% 羊の血液</td></tr><tr><td>を補充 コンピューター</td><td>Dell</td><td>Latitude 3440</td><td>コミューター 圧力ポンプ ソフトウェア</td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査型顕微鏡 (CLSM)</td><td>ライカ</td><td>DMi8</td><td>加熱可能なチャンバーで覆われたステージと、蛍光フィルター、キセノン光源(SP8、DMi8)、DFC 365 FXカメラ(1392 x 1040、1.4メガピクセル)を備えたステージを備えた逆顕微鏡</td></tr>ですリン酸<tr><td>二カリウム水素(KH2PO4)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG、 </td><td>PBS緩衝液に使用される</td>カールスルーエ<td>3904.1</td></tr><tr><td>乾燥材料メル</td><td>ク</td><td>101969</td><td>オレンジシリカビーズ チューブアダプター付きガラス瓶で使用</td></tr><tr><td>ECGMサプリメント ミックス</td><td>Promocell</td><td>C-39215</td><td>ECGM 用サプリメントミックス -培地、内皮細胞の予備培養に必要:0.02 mL/mL ウシ胎児血清、0.004 mL 内皮細胞増殖サプリメント、0.1 ng/mL 上皮成長因子、 1 ng/mL 塩基性線維芽細胞成長因子、90 &micro;g/mL ヘパリン、1 &micro;g/mL ヒドロコルチゾン</td></tr><tr><td>ECGMS</td><td>プロモセル</td><td>C-22010</td><td>ECGM に 5 % [w/w] FCS と 1 mM MgSO4 を添加して細胞接着を増加させる</td></tr><tr><td>内皮細胞増殖培地 (ECGM、すぐに使用可能)</td> <td>プロモセル</td><td>C-22010</td><td>HUVECs の培養培地、サプリメントミックスのすべての成分をすでに補充</td></tr> 子<tr><td>牛胎児血清 (FCS)</td><td>バイオクローム 今 メルク</td><td>S 0415</td><td>感染解析に使用される細胞培養用サプリメント</td></tr><tr><td>FITC 標識ヤギ 抗ヒト VWF 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab8822</td><td>ストック濃度:10 mg/mL、フロー中の球状および多量体 VWF の免疫検出用</td></tr><tr><td>流体ユニット</td><td>同上</td><td>10903</td><td>フロー培養用流体ユニット</td></tr><tr><td>ゼラチン(ブタ)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G-1890-100g</td><td>マイクロスライドチャネル表面のプレコーティング用</td></tr><tr><td>内皮からのVWF分泌の誘導のための</td><td>ヒスタミン二塩酸塩</td><td>ΣΣAldrich</td><td>H-7250-10MG</td> Weibel Palade Bodies</tr><tr><td>の人間の臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)</td><td>Promocell</td><td>C-12203 Lot-Nr. プールされたドナーからの396Z042</td><td>の初代内皮細胞は、液体窒素で保存されたクリプコマウス</td></tr><tr><td>(モノクローナル)から得られるヒトVWF特異的抗体</td><td>サンタクルス</td><td>sc73268</td><td>ストック濃度:200 & マイクロ;PFA固定後のマイクロ流体スライド中のVWFの免疫染色用g/mL</td></tr><tr><td>注入ポート</td><td>同上</td><td>10820</td><td>流れ循環中にヒスタミンまたは細菌をリザーバーチューブに注入するための</td></tr><tr><td>光顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 35M</td><td>逆光顕微鏡は、真核生物の細胞剥離を制御し、400倍の倍率</td></tr><tr><td>を可能にする40倍の水対物レンズを使用した細胞計数のためのLuer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)</td><td>同上</td><td>80176</td><td>フルーディック培養用物理的に修正されたスライド (&mu;&ndash;スライドI0.4Luer、チャネル高さ0.4mm、チャネルボリューム100 &mu;L、2.5 cmの成長領域と25.4 cm2)のコーティング領域は、あらゆる種類のフローアッセイに適しており、物理的処理により親水性で接着性の表面が生成されます。</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム(MgSO4、非水和)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>M7506-500G</td><td>ECGMS培地</td></tr><tr><td>の調製用 マイクロ流体ポンプ</td><td>同上</td><td>10905</td><td>空気圧ポンプ</td></tr><tr>ノ<td>イバウアー細胞計数室</td><td>カール・ヘクトGmbH&Co KG</td><td>40442002</td><td>HUVECsのための顕微鏡計数室</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド16%(PFA)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710-S</td><td>サンプルの架橋用</td></tr><tr><td>灌流セット</td><td>同上</td><td>10964</td><td>灌流セット イエロー/グリーンは、チューブ径1.6mm、チューブ長50cm、総作業容積13.6mL、デッドチューブ容量2.8mL、リザーバーサイズ10mLです。&micro;-slide L0.4Luerとの組み合わせで、 37°Cで。Cと0.0072 dyn x s/cm2の流量範囲、3.8mL/minから33.9 mL/minまでの流量範囲、3.5 dyn/cm2から31.2 dyn/cm2の間のせん断応力に達することができます。長さ50cmのマイクロ流体</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td></td><td></td>溶液<td>は、0.2 g/L KCl、1.44 g/L Na2HPO4、0.24 g/L KH2PO4、 pH 7.4</td></tr><tr><td>プラスチックキュベット</td><td>Sarstedt</td><td>67,741</td><td>(2 x optic) 600 nm</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> での外径測定用 熱<td>不活化Streptococcus pneumoniae NCTC10319 および D39 を使用してウサギで飼育し、タンパク質 A-セファロースカラムを使用して IgG 精製した IgG</td></tr>.<tr><td>ポリスチレンまたは発泡スチロールプレート</td><td></td><td></td><td>これは、チャネルスライドに播種された細胞への冷えストレスを回避するための予防措置です。包装箱の材料のようなどんなタイプの発泡スチロールも使用することができます。プレートの厚さは0.5cmで、サイズは20cm2である必要があります。</td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>6781.1</td><td>PBSバッファーに使用</td></tr><tr><td>ポンプ制御ソフトウェア (PumpControl v1.5.4)</td><td>同上</td><td>v1.5.4</td><td>圧力ポンプを制御し、流動条件を設定し、流れを開始/終了するためのコンピュータソフトウェア</td></tr><tr><td>反応チューブ 1.5/2.0 mL</td> 抗体<td>希釈に必要な</td><td>Sarstedt</td><td>72.706/ 72.695.500</td></tr><tr><td>50mLの反応チューブボリューム</td><td>Sarstedt</td><td>6,25,48,004</td><td></td></tr><tr><td>RFP発現肺炎球菌</td><td>National Collection of Type Cultures, Public Health England</td><td>10,319</td><td>Streptococcus pneumoniae 血清型 47 RFPを発現し、ゲノムに統合されたアヒストン様タンパク質に融合</td></tr><tr><td>Serological pipets 5, 10 mL</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.025/ 86.1254.025</td><td>大容量ピペッティング用</td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム(Na2CO3、水を含まない)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>451614-25G</td><td>100 mM炭酸ナトリウム緩衝液</td></tr>二<tr><td>水素リン酸ナトリウム(NaH2PO4)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG、カールスルーエ</td><td>P030.2PBS</td><td>緩衝液</td></tr><tr><td>スペクトル光度計に使用されるLibra S22</td><td>Biochrom</td><td>80-2115-20</td><td>ブロッキングバッファーの調製のための600nmス</td></tr><tr><td>クロー</td>スシ<td>グマアルドリッチ</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr>での細菌懸濁液の光学密度(OD)の測定 <tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T9284-500ML</td><td>PFA固定後の真核細胞透過化のためにdH20で希釈した0.1%末端濃度で使用</td></tr><tr><td>酵母抽出</td><td>物オキソイド</td><td>LP0021</td><td>THBサプリメントで1%[w/w]酵母抽出物=完全細菌培養培地THYで細菌を培養</td></tr></tbody></table>

一定の流れの原発性ヒト内皮細胞の肺炎球菌感染

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

肺炎レンサ球菌と内皮細胞の表面との相互作用は、フォン・ヴィレブランド因子(VWF)などのメカノ感受性タンパク質を介して血流中に媒介される。この糖タンパク質は、せん断応力に応答して分子立体構造を変化させ、それによって宿主リガンド相互作用の広いスペクトルの結合部位を露出させる。一般に、定義されたせん断流の下で一次内皮細胞の培養は、血管の内層の生理学に似た安定で密接に連結された内皮層の形成と特異的な細胞分化を促進することが知られている.したがって、メカノ感受性タンパク質を含む細菌病原体と宿主血管系との相互作用の機能解析には、界面に影響を及ぼすことが知られている生理学的流動力をシミュレートできるポンプシステムの確立が必要である。血管細胞。
本研究で用いられるマイクロ流体デバイスは、定義された流量で流体の連続的かつパルスレスな再循環を可能にする。コンピュータ制御の空気圧ポンプシステムは、連続的、単方向、制御された媒体流れを生成することにより、内皮セル表面に定義されたせん断応力を適用します。細胞および細菌結合の形態学的変化は顕微鏡的視覚化のために設計されている特別なチャネルスライドを使用して流れの顕微鏡的に監視され、定量することができる。一般に、免疫標識と顕微鏡分析の前にサンプル固定を必要とする静的細胞培養感染とは対照的に、マイクロ流体スライドは、タンパク質、細菌、および細胞成分の蛍光ベースの検出の両方を可能にするサンプル固定後;連続免疫蛍光染色;リアルタイムで直接蛍光ベースの検出を行います。蛍光細菌および特異的蛍光標識抗体と組み合わせることで、この感染手順は、血管プロセスに関連する科学的応用の巨大なスペクトルのための効率的な多成分可視化システムを提供します。

一定の単方向流路で一次HUVECを培養すると、メカノ感受性VWF13、14で満たされた細胞WBの生成を促進するコンフルエントで密集した細胞層の形成をもたらす。このプロトコルは、人間の血流におけるせん断応力状況を模倣する必要がある感染解析のための空気圧ポンプベースのパルスレス再循環システムの使用を記述する。
このシステムは、フロー条件の定義済みのソフトウェア制御設定を可能にします。図1のフロースキームは、主なワークフローを示し、一次内皮細胞の事前培養(図1、インセット1)および肺炎球菌の事前培養(図1、インセット2)を示す。適用されたマイクロ流体システム(図1、インセット3)は、2つの媒体貯蔵所を有...

本研究では、定義された流路条件におけるせん断応力下で分化したヒト一次内皮細胞の表面上で産生されるフォン・ヴィレブランド因子ストリングに対する肺炎球菌の視認性の顕微鏡的モニタリングについて述べている。このプロトコルは、微分免疫染色手順を適用することにより、特定の細胞構造の詳細な可視化および細菌の定量に拡張することができる。

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

この内皮細胞培養システムを用いることが血流の状況の同化を可能にする。そして、この状況では、細菌ベクターの同定や、このプロセスに関与する細胞ベクターの同定を含む細菌感染プロセスも分析することができます。この技術は、細菌感染が血管の完全性に及ぼす影響を探求する道を開きます, また、形態形成メカニズムへの影響を含みます, 炎症応答と免疫調節に.この技術は、内皮細胞のいくつかの特別な取り扱いを必要とするため、視覚的な説明は単なる口頭での説明よりも優れています。この方法は、内皮細胞分化、創傷治癒、腫瘍発生および血管新生などの浸透血管系と相関する研究の他のいくつかの分野に関する洞察を提供する。重要なステップの1つは、標準化された細胞培養と、一次内皮細胞の正確な取り扱いです。この技術は、口頭で説明するだけでは明らかではなかった特別な細胞培養処理を必要とする。まず、クリーンベンチを使用して無菌環境で作業します。ピペットを使用して、2%無菌濾過ブタゼラチンPBS溶液の100マイクロリットルを温度平衡チャネルスライドの単一の貯水池に注入します。薄いポリスチレンまたは発泡スチロールプレートの上にゼラチンコーティングされたチャネルスライドを置き、1ミリリットルのルアーシリンジでスライド温度が低下するのを防ぎ、1ミリリットルのHUVEC懸濁液あたり10倍から5分の1の100マイクロリットルをスライドに加えて種子を播種し、HUVECを栽培します。HUVECでチャネルスライドを摂氏37度と5%の二酸化炭素で60分間インキュベートします。その後、チャネルスライドの両端にある各培地貯留層を60マイクロリットルのECGMS培地で満たします。摂氏37度と5%の二酸化炭素でさらに1時間インキュベートする。次に、マイクロ流体ポンプを調整し、まず平衡した灌流をポンプユニットに接続し、13.6ミリリットルのECGMS培地を充填してポンプ制御ソフトウェアを開始する。流体ユニット設定のメニューで、スクロールダウンウィンドウを使用して、チャンバースライドの適切な灌流セットとタイプを選択します。中粘度のソフトウェアで平方センチメートルあたり0.007ダイン秒を選択してください。インキュベーターの外側で、乾燥シリカビーズを充填したガラス瓶を空気圧チューブに接続します。ソフトウェアメニューでフローパラメータを選択し、圧力を40ミリバールに設定し、連続した媒体フローを開始して液体媒体でポンプチューブをフラッシュします。私たちは、亜コンフルエントに成長したHUVECを使用してタイトな細胞の取り付けを確保し、さらにシステムから気泡を取り出すだけでなく、ポンプシステムのための独立した電源を使用することに焦点を当てます。チューブ接続をタップして気泡を取り除き、ポンプシステムで気泡が循環しないようにします。チャネルスライドを接

pneumococcus-infection-primary-human-endothelial-cells-constant

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

本論文では、成長の異なる方法を説明します...

共培養モデルの緑膿菌</emライブヒト気道細胞上に成長した>バイオフィルム

我々は、無菌連続流回路における層流のせん断応力を受ける接着細胞への方法を記述しています。細胞の接着、形態は、透明なチャンバーを通過代謝物の分析と将来の実験や培養のためのせん断曝露後に細胞を回収するための回路から得られた試​​料を研究することができる。...

層流のせん断応力下の内皮前駆細胞を評価するために、平行平板フローチャンバーと定常流回路

この記事は、最初の臍帯静脈からヒト内皮細胞を単離するための手順を説明した後、フロー条件下で好中球の遊出を調べるために、これらの細胞を使用する方法を示します。ガラスの光学特性を有するポリマーから作られた低容量のフローチャンバーを用いて、希少細胞集団の生細胞蛍光イメージングも可能です。...

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

出典: Jagau、H. 他。定流における初代ヒト内皮細胞の肺炎球菌感染 J. Vis. 経験。(2019年)このビデオは、一定の培地流条件下で、内皮細胞上のフォン・ヴィレブランド因子(VWF)ストリングへの肺炎球菌の付着をリアルタイムで視覚化する方法を示しています。VWF...

一定の培地流量下での初代ヒト内皮細胞への肺炎球菌の付着の評価

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

この手法は、収穫する方法を提供するものであり、哺乳動物細胞の感染に先立って自然原虫の宿主細胞にあらかじめ栽培されている細菌性病原体の細胞内増殖を正常化し、定量化する。このメソッドは、プライミング段階のための宿主細胞、ならびに標的細胞の種類の多種多様に対応するように変更することができます。...

原虫でプライミング細菌で扱いやすい哺乳動物細胞感染

白血球は、傍細胞または経細胞経路を用いて内皮単層を横切る。私たちは、内因性の接合部の分布がVE-カドヘリンおよびPECAM-1を白血球経内皮移行中に生理的な流れの下2移住ルートを区別するために従うように、単純なアッセイを開発した。...

好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

患者由来の内皮との全血相互作用を調べるインビトロ血管疾患モデルを紹介する。このシステムは、様々な状況下での原発性内皮細胞の血栓形成特性の研究を可能にする。この方法は、凝固の異なる段階でのその際の血栓性および抗凝固療法において評価するのに特に適している。...

全血-内皮相互作用と血栓動態をリアルタイムで研究するインビトロ微小流体疾患モデル

我々は、CFBE41o-細胞、THP-1マクロファージ、および空気液体界面-で確立された緑膿菌を用いて、感染した気道の3次元共培養モデルのプロトコルについて説明する。このモデルは、抗生物質の有効性、上皮バリア機能、および炎症マーカーを同時にテストするための新しいプラットフォームを提供します。...

P. アフルギノーサ 抗感染性の前臨床評価のための空気・液体界面における気管支上皮細胞とマクロファージの感染3Dコカルチャー

この記事では、新生児マウスから初代肺内皮細胞を単離し、培養しました。...

初代マウス肺内皮細胞の単離

ここでは、肺切除術を模倣するように設計されたオルガンオンチップ(OOC)システムを構築するためのプロトコルを提示します。このシステムは、グリコカリックス障害と肺切除後の合併症との潜在的な相関関係を調査します。...

3D流体チップにおける肺切除術後の内皮グリコカリックスのモデル化 - 血管ベースの臓器オンチップシステムの構築へのアプローチ

学ぶ 一定の流れ下での原発性ヒト内皮細胞の肺炎球菌感染メカニズム。シア応力環境における細菌の接着と血管インテグリティへの影響を可視化する手法を解説します。

一定の流れの原発性ヒト内皮細胞の肺炎球菌感染

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