Name: 遺伝子型と突然変異プロファイルを薬理学的応答に変換するツールとしての前立腺オルガノイド培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 学ぶ前立腺オルガノイド培養法による薬理学的応答評価。遺伝型と突然変異プロファイルを薬剤応答に変換し、前立腺がんの薬剤耐性メカニズムを解明する標準的かつ再現性の高い手法を示す。

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K.P. は NIH 1F32CA236126-01 によってサポートされています。C.L.S. は HHMI によってサポートされています。CA193837;CA092629;CA224079;CA155169;CA008748;そしてスターがんコンソーシアム。W.R.K.はオランダ癌財団/KWF Buit 2015-7545と前立腺癌財団PCF 17YOUN10によってサポートされています。

このプロトコルに記載されているすべての作業は、以前に確立されたマウスオルガノイドおよび患者由来オルガノイドで行われてきた。すべての動物の仕事は、メモリアルスローンケタリングがんセンターの研究動物資源センター(IACUC:06-07-012)のガイドラインに従って行われました。すべての患者由来組織は、メモリアルスローンケタリングがんセンター(IRB:12001)の規則と規則に従って収集されました。
1. 中・バッファーの準備
<ol><li>実験を開始する前に、基底膜マトリックス(例えば、マトリゲル)を一晩4°Cで解凍する。使用中は氷の上に置いておきなさい。</li>
	<li>実験の前に24時間37°Cで培養プレートを置きます。これは、基底膜マトリックスドーム(以下、マトリックスドームと呼ばれる)を重合するのに役立ちます。めっきオルガノイドは、ステップ2.1.2で説明する。</li>
	<li>確立されたプロトコル5に従ってオルガノイド培地を準備する。</li>
	<li>表皮成長因子を添加せずにオルガロイド培地を調製する(EGF;成分の材料表を参照)。EGFはAR転写出力を抑制し、抗アンドロゲン耐性5を付与する。</li>
	<li>10%ウシ血清(FBS)でダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)を調製します。 注:この媒体はセクション2-4のトリプシン置換による酵素消化を阻害するために使用される。</li>
	<li>メーカーのプロトコルに従って薬剤ソリューションを準備します。エンザルタミド/mdv3100(以下、第2世代抗アンドロゲンと称する)については、ジメチルスルホキシド(DMSO)で100μMの原液を調製する。在庫は-20°Cで最大6ヶ月間保管でき、新鮮にする必要はありません。</li>
</ol>2. オルガノイドの単離、酵素消化、確立
<ol><li>前立腺オルガノイドを、以前に確立されたプロトコル5、7に従ってマウスまたはヒト組織から単離する。簡単な説明を以下に示します。<ol>
<li>ミンチおよび酵素的に前立腺組織を消化し、単一細胞懸濁液を産生する。この実験では、ADMEM/F12の5mg/mLコラゲアーゼIIの1mLを前立腺組織の50mgの消化に使用した。</li>
		<li>5分間300 x gで遠心分離して細胞を収集し、細胞を数え、基底膜マトリックスで再サスペンドし、適切な密度5、7のプレートを、事前に温めたオルガノイド培養プレート上のマトリックスドーム(めっき)メソッドを図1Aに示します。</li>
		<li>ドームが固化し、完全に覆われるようにドームの上部にメディアを追加できるようにします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>下流の適用のための所望の量にオルガノイドを成長させる。セル番号は、標準の棚卸方法によって決定できます。密度の詳細については、プロトコルのアプリケーション固有のセクションを参照してください。</li>
	<li>P1000ピペットを使用して、中程度のピペットを上下に描き、混乱を引き起います。基底膜マトリックスが完全に破壊されたら、懸濁液を15 mL円錐管に移す。単一の15 mL円錐管あたり10個以上のドームを配置しないでください。300 x gで5分間遠心分離機。</li>
	<li>上清を取り出し、5mLのPBSで細胞ペレットを洗浄します。300 x gで5分間遠心分離機。</li>
	<li>上清を引き出し、トリプシン交換の4mLでペレットを再サスペンドします。37°Cで振とう5〜10分間の消化。トリプシン置換を阻害するためにオルガノイド培地+10%FBSの等量を追加します。300 x gで5分間遠心分離機。</li>
	<li>上清を引き出し、PBSの1mLで再サスペンドします。</li>
	<li>40μmフィルターで懸濁液をろ過し、単一のセル懸濁液を確保します。ヘモサイトメーターまたは同等の計数装置を使用してセル番号を定量化します。 注: 実行可能な単一セルの取得が困難な場合は、フローソートを使用して単一のセル溶液を得る。</li>
</ol>3. オルガノイド形成能力の評価
注:オルガノイドを生成できる細胞のパーセンテージを決定するために、播種アッセイは、幹/前駆体電位のプロキシとして行うことができる。オルガノイド形成能は、生存率アッセイの細胞播種数を定義する上でも重要である。
<ol><li>10μM Rhoキナーゼ阻害剤Y-27632を含有するオルガノイド培地を用いて、工程2.7~100μLの懸濁液を10μL当たり10μLで希釈する。</li>
	<li>1,100細胞(懸濁液110μL)を新しい円錐管に移します。</li>
	<li>285°Lの基底膜マトリックスを加え、細胞を再サスペンドします。これにより、約70%のマトリックス濃度になります。 注:播種時の基底膜マトリックスの希釈は、タンパク質マトリックスの粘度によって引き起こされるドームサイズの変動を大幅に減少させます。</li>
	<li>35μLのマトリックスドームの種子細胞を予め温めた24ウェルプレートに入れ、200細胞/ウェルをもたらす。プレート 3-5 はサンプルごとに複製します(図 1Aおよびステップ2.1.2のめっき方法も参照)。</li>
	<li>細胞がマトリックスドーム内に残るようにするには、プレートを反転し、細胞インキュベーターに入れ、基底膜マトリックスを固めます。</li>
	<li>10分後、インキュベーターからプレートを取り出し、Rhoキナーゼ阻害剤を含む培地を添加する。</li>
	<li>メディアを 2 日ごとに更新します。7日後、オルガノイドの数を定量する。Rhoキナーゼ阻害剤は、実験全体を通して媒体に保管してください。</li>
	<li>ドームごとに確立されたオルガノイドの数をカウントし、めっきされた細胞の総数(200細胞)から形成されたオルガノイドの割合を計算します。 注:オルガノイドの確立率は、細胞の種類と遺伝子型に応じて3%-60%から変化します。</li>
</ol>4. オルガノイドの薬理学的応答の決定
<ol><li>ステップ2.7から続いて、マトリックスドーム内のシード1,000〜10,000細胞。最終的な細胞数を決定するためのプロキシとしてオルガノイド形成効率と成長速度を使用してください。 注 : 推奨されるセル番号を表 1に示します。分析ごとに条件ごとに 3 ~ 5 個の反復を使用します。粘度によって引き起こされるピペット誤差を減らすために、70%の基底膜マトリックスの最終濃度を使用してください。</li>
	<li>24ウェルプレート内のマトリックスドームのシード35μLを、セクション3で行ったようにドームを固化させます(図1Aおよびステップ2.1.2のめっき方法も参照)。ローキナーゼ阻害剤および選択した薬物を含む培地を添加する。この方法はすべての薬物に適用することができるが、このプロトコルでは、例えば10μMで第2世代抗アンドロゲンが使用される。半分の最大阻害濃度(IC50)を決定するには、log10増分を行い、および対照として、薬物が溶解した車両を使用する。</li>
	<li>培地を2~3日ごとにリフレッシュし、7日目にオルガノイドを分析して、薬物の薬理学的応答を決定する。タイムポイントは、実験と薬物の選択の間で異なる場合があります。 注:オルガノイドは、これらのアッセイを実行するためにトリプシン化する必要はありません。</li>
	<li>オルガノイドをそのまま維持するには、P1000ピペットを使用して、中型とピペットを上下に描き、基底膜マトリックスを破壊します。</li>
	<li>基底膜マトリックスが完全に破壊されたら、懸濁液を15 mL円錐管に移す。15 mL 円錐管あたり 10 個を超えるマトリックス ドームを転送しないでください。</li>
	<li>300 x gで5分間遠心分離し、上清を引き出し、5mLのPBSで洗浄します。</li>
	<li>PBSの1 mLでオルガノイドを再サスペンドし、トリチュレーションとガラスパスツールピペットを使用してオルガノイドを破壊します。</li>
	<li>オルガノイド断片の数を定量する。シード5は、ステップ2.1.2で説明したように100個のオルガノイド断片を含む複製を行う。</li>
	<li>セクション7で後述するように細胞生存率アッセイを実行する。</li>
</ol>5. オルガノイドからのRNA分離
注:市販のカラムベースの方法は、RNAの良好な量と品質をもたらします。良好な量RNAを確保するには、サンプルごとに少なくとも1つのドームを使用します。ただし、3つのドームを使用することをお勧めします, 12ウェルプレートの単一の井戸に播種することができます.
<ol><li>スメルカプトエタノール添加 (1%)RNA分離キット内のグルタチオンリシスバッファーに。</li>
	<li>オルガノイドを含む基底膜ドームから培地を取り出し、この緩衝液を750°L添加します。P1000ピペットを使用して上下ピペット。すべての基底膜マトリックスが溶解していることを確認します。</li>
	<li>70%エタノールの750°Lを加え、ピペットで混ぜます。続いて700μLの混合物をカラムに移し、12,000 x gで1分間遠心分離し、残りのリサートを繰り返す。</li>
	<li>メーカーの指示に従って、ワッシュとカラムDNase処理を行います。RNAseフリー水の30-50°LでRNAを溶出します。</li>
	<li>OD = 260 nmおよび280 nmの蛍光計を使用して濃度を測定し、-80°Cで保存するか、下流のアプリケーションを続行します。</li>
</ol>6. オルガノイドからのタンパク質分離
注:タンパク質単離の場合、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を含む標準的なRIPA緩衝液を調製する(材料表)。少なくとも3つのドームを使用することをお勧めします, これは、単一の12ウェルで播種することができます。
<ol><li>P1000ピペットを使用して、オルガノイドとピペットを含む基底膜ドームで細胞から培地を引き上げ、基底膜マトリックスを破壊します。</li>
	<li>完全に混乱したら、サスペンションを15 mLの円錐管に移します。300 x gで5分間遠心分離機。</li>
	<li>上清を取り出し、5mLの氷冷PBSで洗います。300 x gで5分間遠心分離機。</li>
	<li>上清を引き出し、トリプシン交換の4mLでペレットを再サスペンドします。37°Cで振りながら5~10分間消化する。</li>
	<li>トリプシン置換を阻害するためにオルガノイド培地+10%FCSの等量を追加します。300 x gで5分間遠心分離機。 注:遠心分離後、基底膜マトリックスはペレットに表示されるべきではありません。</li>
	<li>上清を取り出し、5mLの氷冷PBSで洗います。上清を取り出し、P1000ピペットを使用して300°Lのリシスバッファーで細胞ペレットを再差し込み、1.5 mLマイクロ遠心管に移します。</li>
	<li>氷上で10分間インキュベートし、その後、4°Cの温度で冷却水でそれぞれ30sの2xを超音波処理します。チューブを氷の上に戻し、標準的な方法でタンパク質定量を行います。</li>
	<li>ローディング染料を含むドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を加えてタンパク質を変性し、95°Cで5分間沸騰させる。lysateを-80°Cで保存するか、下流のアプリケーションを続行します。</li>
</ol>7. オルガノイドを伴う細胞生存率アッセイ
注:細胞生存率は、市販の細胞生存率アッセイキットおよびルミノメーターを用いて評価することができる。製造元の指示に従ってバッファを準備します。条件ごとに5つの反復が推奨されます:24ウェルプレートの1ウェルで1つの35°L基底膜マトリックスドームからなる1つの反復。
<ol><li>オルガノイド培養の培地を引き出し、マトリックスドームをそのままにしておくことに注意を払う。</li>
	<li>65°LのPBSとピペットを上下に加え、マトリックスドームを破壊します。</li>
	<li>セル生存率アッセイキットバッファーを100μL加え、ピペットで再サスペンドします。</li>
	<li>室温(RT)で10分間振とうでインキュベートする。</li>
	<li>100μLの混合物をルミノメーターに適した非半透明プレートに移し、セル生存率アッセイキットのメーカーの指示に従って読み取りを行います。</li>
</ol>8. 異種移植のためのオルガノイドの調製
注:オルガノイドは、免疫不全動物および等生マウスの両方における皮下移植にも適しています。注入されたオルガノイドが生体内で区別可能であることを保証するために、構成的に発現するフルオロフォア5でオルガノイドにラベルを付ける。オルガノイドライン間で移植効率が異なるため、注射あたり5 x105細胞から2x106細胞を用いた移植実験を行うことをお勧めします。
<ol><li>P1000ピペットを使用して、中型とピペットを上下に描き、基底膜マトリックスを破壊します。完全に混乱したら、サスペンションを15 mLの円錐管に移します。300 x gで5分間遠心分離機。 注: 15 mL 円錐管あたり 10 個を超えるマトリックス ドームを転送しないでください。</li>
	<li>上清を引き出し、5mLのPBSで洗浄します。300 x gで5分間遠心分離機。</li>
	<li>上清を引き出し、トリプシン交換の4mLでペレットを再サスペンドします。37°Cで振りながら5~10分間消化する。</li>
	<li>トリプシン置換を阻害するためにオルガノイド培地+10%FBSの等量を追加します。300 x gで5分間遠心分離機。</li>
	<li>上清を引き出し、PBSの1mLで再サスペンドします。40μmフィルターで懸濁液をろ過し、単一のセル懸濁液を確保します。標準的な方法を使用して細胞を定量化します。</li>
	<li>PBS + Rho阻害剤の細胞をスピンダウンし、100 μLあたり2 x 106細胞の濃度に再中断します(細胞濃度および濃度の変動に必要な絶対細胞数については表2を参照)。基底膜マトリックスの等量を使用して、1:1の懸濁液を生成します。懸濁液を氷の上に置きます。</li>
	<li>標準プロトコルに従って細胞を注入し、標準的な方法8を使用して異種移植片の増殖を監視する。</li>
</ol>

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</ol>

C.L.Sはノバルティスの取締役会に勤務しています。ORIC医薬品の共同創設者であり、エンザルタミドとアパルタミドの共同発明者である。アギオス、バイジーン、ブループリント、カラムグループ、フォゴーン、ハウスリーファーマ、ネクセック、KSQ、ペトラ、およびPMVの科学アドバイザーです。2014年にジェネンテック/ロシュが購入したセラゴンの共同創設者です。W.R.K.はオルガノイド技術の共同発明者および特許保有者です。

抗アンドロゲン耐性の基礎となる分子機構を理解し、潜在的な治療上の脆弱性を発見するには、前立腺癌を模倣したモデル系における薬理学的応答の検査が必要です。ここで説明する詳細なプロトコルは、患者由来および遺伝子操作された前立腺オルガノイドにおける薬理学的応答の信頼性の高い分析と、下流アプリケーション用のこれらのオルガノイドサンプルの調製のための詳細なプロトコルです。
このプロトコルには 2 つの重要な手順があります。1つ目は、オルガノイドの播種効率と増殖速度を決定することです。オルガノイドの成長速度は大きく異なります。これは、マウス由来のオルガノイドがヒト由来オルガノイドよりも約2倍速く成長するので、種に依存する。種とは別に、成長速度は遺伝子型と表現型に依存する。しかし、播種効率および成長速度が決定されるとき、このプロトコルはすべての前立腺オルガノイドタイプに合わせていることができる。
2 番目の重要なステップは、タンパク質マトリックスベースの 3D 培養を使用して、その後の下流アプリケーションに備えています。めっき時の基底膜マトリ...

薬剤耐性は、がん治療における主要な臨床問題の一つです。転移性前立腺癌(PCa)治療は、主にアンドロゲンシグナル伝達軸に向けられる。次世代の抗アンドロゲン療法(例えば、エンザルタミドおよびアビラテロン)は大きな臨床的成功を示したが、事実上すべてのPCaは最終的にアンドロゲン非依存状態、または去勢耐性前立腺癌(CRPC)に向かって進行する。
CRPCの最近のゲノムおよび転写プロファイリングは、前立腺癌における抵抗性の3つの一般的なメカニズムがあることを明らかにした:1)アンドロゲン受容体(AR)シグナル伝達1の回復をもたらす突然変異を活性化する;2)バイパスシグナル伝達の活性化は、グルココルチコイド受容体(GR)の活性化がARシグナル伝達2の損失を補償することができる次世代抗アンドロゲン療法抵抗のための前臨床モデルで例示されるように;そして3)最近同定された系統可塑性の過程で、腫瘍細胞が薬物標的に依存する細胞型からこれに依存しない別の細胞型に系統を切り替えて抵抗性を獲得する(PCaでは、AR陰性として表される)および/または神経内分泌疾患 [NEPC])3,4.しかしながら、薬剤耐性を引き起こす分子機構は理解されていない。さらに、獲得した抗アンドロゲン耐性は、悪用され得る治療上の脆弱性につながる可能性があります。したがって、患者の表現型および遺伝子型を模倣するモデルシステムにおける薬物応答を評価することが不可欠である。
前立腺オルガノイドは、定義された培地を有する3Dタンパク質マトリックス中で成長した組織異性培養物である。重要なことに、前立腺オルガノイドは、マウスまたはヒト起源の良性および癌組織から確立することができ、それらは生体内5、6に見られる形膜および遺伝性特徴を保持する。重要なことに、抗アンドロゲン感受性PCaおよびCRPC細胞の両方がオルガノイドの現在のコンペンディウムで表される。さらに、前立腺オルガノイドはCRISPR/Cas9およびshRNA5を使用して容易に遺伝的に操作される。したがって、前立腺オルガノイドは、薬物応答を試験し、抵抗機構を解明するための適切なモデルシステムである。ここでは、薬物検査を行い、前立腺オルガノイドを用いて薬理学的応答を分析するための詳細なプロトコルについて説明する。

<table><tbody><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>オルガノイド培地成分 最終濃度 200 nM</td></tr><tr><td>ADMEM/F12</td><td>Gibco/Life technologies</td><td>12634028</td><td>オルガノイド培地成分</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco/Life technologies</td><td>17504-044</td><td>オルガノイド培地成分</td></tr><tr><td>細胞培養プレート</td><td>フィッシャー</td><td>657185</td><td></td></tr><tr><td>細胞力価 Glo</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>DHT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-073</td><td>オルガノイド培地成分: 最終濃度 1 nM</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>フィッシャー</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>オルガノイド培地成分: 最終濃度 50 ng/ml (マウス用)、5 ng/nl (ヒト</td></tr><tr><td>用) FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>ヒト特異的オルガノイド培地 成分: 最終濃度 10 ng/ml</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>ヒト特異的オルガノイド培地成分: 最終濃度 5 ng/ml</td></tr><tr><td>グルタマックス</td><td>Gibco/Life technologies</td><td>35050079</td><td>オルガノイド培地成分</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>自社製</td><td>N/A</td><td>オルガノイド培地成分: 最終濃度 10 mM</td></tr><tr><td>マトリゲル (成長因子低減 &Phenol Red free)</td><td>Corning</td><td>CB-40230C</td><td>オルガノイド培地成分</td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>オルガノイド培地成分: 最終濃度 1.25 mM</td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>ヒト特異的オルガノイド培地成分: 最終濃度 10 mM</td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>Peprotech または安定トランスフェクション 293t 細胞と Noggin コンストラクト (Karthaus et al. 2014)</td><td>120-10C</td><td>オルガノイド培地成分: 最終濃度 10% 馴化培地または 100 ng/ml</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトアビジン</td><td>ジェミニ バイオプロダクツ</td><td>400-109</td><td>オルガノイド培地成分</td></tr><tr><td>ホスパターゼ阻害剤</td><td>メルクミリポアーゼ阻害剤 メルクミリポア</td>ーゼ阻害剤 <td>524629</td><td></td></tr><tr><td>プロスタグランジン E2</td><td>トクリス</td><td>3632464</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤</td><td>メルクミリポア</td><td>539131</td><td></td></tr><tr><td>R-SPONDIN</td><td>Peprotechまたは安定トランスフェクトされた293t細胞とR-Spondin1コンストラクト(Karthaus et al. 2014)</td><td>120-38</td><td>オルガノイド培地成分:最終濃度 10%コンダニード培地または500 ng/ml</td></tr><tr><td>RIPAバッファー</td><td>Merck</td><td>20-188</td><td></td></tr><tr><td>RNA-easy minikit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=152121-30-7&amp;インターフェース=CAS%20No.&lang=ja&region=US&focus=product">152121-30-7</a></td><td>ヒト特異的オルガノイド培地成分:最終濃度10 &mu;M</td></tr><tr><td>TryplE</td><td>ThermoFisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td>オルガノイド培地成分: 最終濃度 10 &mu;メートル</td></tr></tbody></table>

遺伝子型と突然変異プロファイルを薬理学的応答に変換するツールとしての前立腺オルガノイド培養

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

ここで提示するプロトコルは、前立腺上皮オルガノイドにおける薬力学、幹細胞電位、および癌分化を研究するためのプロトコルである。前立腺オルガノイドは、前立腺上皮に似た定義された培地で成長したアンドロゲン応答性の3次元(3D)培養物である。前立腺オルガノイドは、野生型および遺伝子操作マウスモデル、良性ヒト組織、および進行前立腺癌から確立することができる。重要なことに、患者由来のオルガノイドは遺伝学および生体内腫瘍生物学の腫瘍によく似ている。さらに、オルガノイドはCRISPR/Cas9およびshRNAシステムを使用して遺伝的に操作することができる。これらの制御遺伝学は、ゲノム型および突然変異プロファイルが薬理学的応答に及ぼす影響を迅速に検査するためのプラットフォームとしてオルガノイド培養を魅力的にする。しかし、実験プロトコルは、再現可能な結果を得るために、オルガノイド培養物の3D性質に特異的に適合する必要があります。ここで説明する詳細なプロトコルは、オルガノイド形成能力を決定するために播種アッセイを行うための。その後、このレポートは、薬剤治療を行い、生存率測定、タンパク質分離、およびRNA単離を介して薬理学的応答を分析する方法を示す。最後に、このプロトコルは、皮下移植を用いて異種移植およびその後の生体内成長アッセイのためのオルガノイドを調製する方法を記述する。これらのプロトコルは、再現性の高いデータを生成し、3Dカルチャーシステムに広く適用可能です。

シード効率 オルガノイド形成能力は表現型および遺伝子型によって決定される。野生型(WT)前立腺基底細胞は優れたオルガノイド形成能力を示した(30%-40%)発光細胞と比較して (3%)(図 1A)。オルガノイドの確立後、形成能力は劇的に増加した。典型的には、WTオルガノイドに由来する細胞の25%〜30%が新しいオルガノイドを形成することができる(図1B)。CRISPR/Cas9媒介性Pten(PtenΔ/Δ)またはp53(p53Δ/Δ)は、オルガノイド形成能力のわずかな増加をもたらした。p53とPtenの両方の損失は、さらに形成能力を増加させた(図1B)。
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ここで提示する前立腺上皮オルガノイドにおける薬理学的応答を研究するためのプロトコルである。オルガノイドは生体内生物学によく似ており、患者の遺伝学を再現し、魅力的なモデルシステムとなっています。前立腺オルガノイドは、野生型前立腺、遺伝子操作されたマウスモデル、良性ヒト組織、および進行前立腺癌から確立することができる。

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

このプロトコルは、前立腺オルガノイド培養における薬理学的応答を評価するための標準的かつ再現可能な方法を提供する。前立腺オルガノイド培養は、細胞が基体膜マトリックスに三次元構造を採用できるようにすることで、生体内生物学と薬理反応の多くの側面を維持するインビトロシステムを提供する。特に、これらの方法を用いて、遺伝子型が前立腺の薬理学的反応を指示する方法を評価し、薬剤耐性をモデル化することに興奮しています。これらの方法はドームめっき法を用いたオルガノイド培養系に適用することができる。しかしながら、成長因子などの培地中の成分は、組織の種類によって異なる場合がある。視覚的なデモンストレーションにより、プロトコルの手順と、研究者が利用できる他の多くの公表されたオルガノイド培養システムとの違いについて、より具体的かつ詳細な議論が可能になります。オルガノイド培養は、典型的には二次元細胞培養よりも時間がかかる。これらのメソッドに余分な時間を割り当てるようにしてください。マウスまたはヒト組織から前立腺オルガノイドを単離することから始めます。ミンチを酵素的に組織を消化して単一の細胞懸濁液を生成し、その後、5分間gの300倍で遠心分離して細胞を採取する。細胞を数え、基質膜マトリックスで再懸濁します。次に、事前に温めたオルガノイド培養プレート上のマトリックスドームの適切な密度でそれらをプレートします。ドームは互いに離れて、井戸の側面から2ミリメートルでなければなりません。固まったら、ウェルの側面から静かにメディアを加えてマトリックスを破壊しないようにします。ドームが固まったら、完全に覆われるようにドームの上にメディアを追加します。オルガノイドを、標準的なカウント方法で細胞数を決定する下流用途に必要な量まで成長させます。オルガノイドを使用する準備ができたら、Pten00ピペットで媒体を描画し、それを上下にピペットして基質膜マトリックスを破壊します。懸濁液を15ミリリットルの円錐形チューブに移し、遠心分離機を300回gで5分間移動します。上清を吸引し、細胞ペレットを5ミリリットルのPBSで洗浄する。遠心分離を繰り返し、トリプシン交換の4ミリリットルでペレットを再中断し、摂氏37度で振りながら5〜10分間消化させます。10%FBSのオルガノイド培地の等量を加えて、トリプシン置換を阻害し、チューブを300回gで5分間遠心します。上清を吸引し、PBSの1ミリリットルで細胞を再懸濁する。その後、40マイクロメートルフィルターで細胞をひずんで単一細胞懸濁を確実にし、ヘモサイトメーターを使用して数えます。細胞懸濁液を10マイクロモルロキナーゼ阻害剤Y27632でオルガノイド培地を用いて10マイクロリットル当たり100細胞に希釈する。1,100個の細胞を新しい円錐形チューブに移し、285マイクロリットルの基質膜マトリックスを加え、70%のマトリックス濃度になります。次に、細胞を35マイクロリットルのマトリックスドームにあらかじめ温めた24ウェルプレートに播種し、サンプルあたり3〜5個の複製物をプレートします。プレートをめくり、細胞インキュベーターに入れ、地下マトリックスを固めます。10分後、インキュベーターからプレートを取り出し、ローキナーゼ阻害剤を含む培地を添加する。2日ごとに、7日後に培地をリフレッシュし、ドームごとに確立されたオルガノイドの数を数え、細胞の総数から形成されたオルガノイドの割合を計算する。先に説明したようにオルガノイドを単離した後、最終的な細胞数を決定するためのプロキシとしてオルガノイド形成効率および成長速度を用いてマトリックスドーム内のシード1,000〜10,000細胞を用いた。その後、24ウェルプレートにマトリックスドームの35マイクロリットルをシードし、ドームを固めます。ローキナーゼ阻害剤と選択した薬物を含む培地を追加します。対照として薬物が溶解した車両を用いて、最大阻害濃度の半分を決定するために、ログ10インクリメンタルを行う。培地を2~3日ごとにリフレッシュし、7日目にオルガノイドを分析し、原稿に記載されているように細胞生存率アッセイを行うことにより薬剤に対する薬理学的反応を判定する。トリプシン法を使用せずにオルガノイド断片をプレートするには、Pten00ピペットを使用して培地を吸引し、ピペットを上下に使用して基原膜マトリックスを破壊します。マトリックスが完全に破壊されたら、懸濁液を15ミリリットルの円錐形チューブに移し、遠心分離機を300回gで5分間転送します。上清を吸引し、PBSを5ミリリットル加えます。洗浄後、PBSの1ミリリットルでオルガノイドを再中断し、ガラスパスツールピペットでトリチュレーションによってオルガノイドを破壊する。前述のように100個のフラグメントで、オルガノイドフラグメントとシード5個の複製の数を定量化します。7日後、原稿の指示に従って細胞生存アッセイを行う。野生型前立腺基底細胞は、発光細胞に比べて優れたオルガノイド形成を示した。PtenまたはP53のCRISPR-Cas9媒介性損失およびさらに増加した形成能力の両方の損失でオルガノイド形成のわずかな増加が達成された。抗アンドロゲン分子の増殖に及ぼす影響は、異なる遺伝子型を有するマウスオルガノイドで試験された。P53の損失は抗アンドロゲン分子に対する耐性を引き起こさなかったが、Ptenの損失は抵抗性を増加した。しかし、P53とPtenの二重損失は完全な抵抗をもたらした。アンドロゲン受容体阻害はまた、異型を変更しました。野生型Ptenが削除され、P53がオルガノイドを削除するとオルガノイドの大きさが減少し、PtenとP53の両方の損失を伴うオルガノイドは典型的に影響を受けなかった。予想通り、これらの細胞を脇腹に皮下に移植すると、二重に削除されたPtenおよびP53オルガノイドのみが成長した。2つの異なるヒト前立腺癌オルガノイドMSKPCA2およびMSKPCA3は、抗アンドロゲン分子に対するそれらの応答について試験された。MSKPCA2オルガノイドの増殖は強く阻害されたのに対し、MSKPCA3オルガノイドは影響を受けなかった。MSKPCA2は、高レベルのアンドロゲン受容体とFKBP5ならびに顕著な発光タンパク質を発現した。MSKPCA3はまた、基底および間葉マーカーを発現し、これらのオルガノイドが非発光アンドロゲン非依存表現型をモデル化することを示唆するFKBP5の発現を示さなかった。オルガノイドは、生き残るためには、ガラスピペットによるトリプシン化またはトリチュレーションのいずれかによって定期的に破壊される必要があります。頻度は種の起源と遺伝子型に依存する。次世代シーケンシングまたはプロテオミクス実験の任意のタイプは、記載の手順に従って行うことができる。これらの実験は、フェノタイプと薬理学的応答の分子基盤を調査するであろう。この3次元オルガノイド培養技術は、研究者が体外で高度に制御された遺伝的文脈における薬理学的応答を研究することを可能にする。これは、生体内研究で長いの信頼性の高い代替手段とすることができます。

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宿主-病原体相互作用を研究するためのマウス前立腺オルガノイドモデルの生成

学ぶ前立腺オルガノイド培養法による薬理学的応答評価。遺伝型と突然変異プロファイルを薬剤応答に変換し、前立腺がんの薬剤耐性メカニズムを解明する標準的かつ再現性の高い手法を示す。

遺伝子型と突然変異プロファイルを薬理学的応答に変換するツールとしての前立腺オルガノイド培養

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