Name: ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学ぶ 成人マウス脳半球から領域特異的ミクログリアを分離し、ディープシングルセルRNAシーケンシングで遺伝子発現を解析する方法。神経変性疾患におけるミクログリアの機能的多様性を解明する。

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私たちは、このプロトコルの開発中に彼らの助けをマリコL.ベネット、リアナニコールボナンノ、およびスパイロスダルマニスに感謝します。また、スタンフォード・シェアドFACS施設、特にメレディス・ウェグラーツとリサ・ニコルズに感謝します。スタンフォード・プロテイン・アンド・核酸施設(PAN)のヤン・トラン、マイケル・エッカートが撮影を大いにサポート。この作品は、JPB財団とヴィンセント・J・コーツ財団が出資しています。

げっ歯類に関するすべての手順は、スタンフォード大学のガイドラインに準拠し、国および州の法律およびポリシーに準拠しています。すべての動物の手順は、スタンフォード大学の実験動物ケアに関する行政パネルによって承認されました.
注:すべてのソリューションおよびバッファー構成は、材料の表に記載されています。
1. 細胞分離の日の準備
<ol><li>培地A(50mL)、磁気活性化細胞選別(MCS)緩衝液(30mL)、FACS緩衝液(25mL)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS;30mL)、DNase(320μL)、およびRNase阻害剤(30°L)の氷上で冷却します。 注:ここで提供される体積は、単一のマウス脳半球の4つの脳領域(例えば、皮質、小脳、海馬および線条体)からミクログリアを分離するのに十分である。より多くの組織を使用する場合はスケールアップします。</li>
	<li>4つのきれいな2 mLダウンスホモジナイザーを氷の上に置き、DNaseの80°L(12,500単位/mL)と5μLのRNase阻害剤を持つ培地Aの2 mLを各Dounceホモジナイザーに加えます。ピストンを15 mLチューブで冷やします。</li>
	<li>組織採取のための脳領域を持つ4つの6 cmペトリ皿にラベルを付け、氷の上の各皿に冷たい媒体Aの200°Lを加える。解剖用の6cmペトリ皿に約5mLの培地Aを加えます。 注:使用する前に、すべての試薬が無菌でRNA用途に適していることを確認してください。ベンチおよび解剖ツールは清潔で、RNase除染液(材料のテーブル)でスプレーする必要があります。</li>
</ol>2. 脳領域解剖
注:この手順は、約 30 分かかります。
<ol><li>400-500 μLのケタミン/キシラジン(24 mg/mLケタミンおよび2.4 mg/mLキシラジン)を成人期マウス(>1ヶ月)の腹腹に注入する。 注:ここでは男性マウスを使用してイラストを使用しますが、どちらかの性別が適しています。</li>
	<li>5分待ってから後足をつまんで、引き込みの欠如を確認します。</li>
	<li>すぐに26 G x 3/8針を使用して、目に見える血液が無くなるまで20-30 mLの氷冷PBSで心筋灌流を行います。</li>
	<li>外科的なはさみでマウスを切り落とす。小さなはさみを使って皮膚を切り開いて頭蓋骨の下を露出させ、矢状縫合糸、ラムドイダル縫合糸、冠状縫合糸を切ります。鉗子を使用して、組織を損傷することなく頭頂骨と頭頂骨の両側を引き抜き、脳を媒体Aで解剖ペトリ皿に慎重に移動させる。</li>
	<li>プレチルドブレードを使用して、中間線を通って脳を2つの半球に切断します。 注:単一の半球からここで説明する4つの脳領域は、単一細胞またはバルクRNA-seqアプリケーションのための十分な数のミクログリアを生じる。他の半球は、その上の検証で免疫ヒストケミストリーまたはRNAに使用することができる。</li>
	<li>皮質葉と脳幹から小脳を#55鉗子で分離し、組織をコレクションペトリ皿に移す。</li>
	<li>#55鉗子を使用して、海馬と線条体を皮質から慎重に解剖し、各組織をコレクションペトリ皿に移します。</li>
</ol>3. 機械組織解離
注:細胞や試薬は、染色工程中以外は常に冷却してください。この手順は、約 30 分かかります。
<ol><li>各脳組織をカミソリの刃で切り刻み、<1 mm3の細かい部分に入れる。</li>
	<li>1 mL ピペット (先端を切り取ったもの) を使用して、組織片を事前に冷却された Dounce ホモジナイザーに移し、それぞれに DNase および RNase 阻害剤を含む培地 A の 2 mL を含みます。</li>
	<li>6-10フルストロークのためにピストンをゆっくりとねじり出して組織を均質化し、目に見える塊が存在しないまで。 注:ドーピングは、ニューロンや他のほとんどのグリア細胞を殺すが、むしろそのままのミクログリア細胞を残します。不十分と過度の作業の両方が細胞の低収率につながることができます。.</li>
	<li>解一解裂した組織を70μmのストレーナーを通して50 mLの管に移す。</li>
	<li>各Dounceホモジナイザーとピストンを合計6mLのコールドミディアムAですすり、同じストレーナーを通してリンス溶液を対応するチューブに濾過します。</li>
	<li>単一細胞懸濁液(各約8mL)を15mLの円錐管に移し、400 x gで遠心分離機を4°Cで4°Cで5分間、ブレーキ= 5で転送します。</li>
</ol>4. ミエリン除去
注:この手順は、約 60 分かかります。
<ol><li>磁気セパレータ(材料表)に1つの大きな枯渇(LD)カラム(皮質の場合)と3つの大きな選択(LS)カラム(他の3つの領域の場合)を準備します。MCS バッファを 3 mL で各カラムにすすいでください。</li>
	<li>遠心分離が終了したら、ピペットアウトし、ペレットを邪魔することなく上清を廃棄します。皮質および小脳組織の場合、1.8μLのRNase阻害剤を用いてMCS緩衝液の850μLで細胞を再中断する。海馬組織および線条体組織の場合、0.9 μLのRNase阻害剤を用いてMCS緩衝液の400μLで細胞を再サスペンドする。 注:カラム(LD対LS)および懸濁液に使用される体積は、組織中に存在するミエリンの量に基づいて最適化される。他の脳領域がアッセイされた場合、これらの状態は、組織の大きさとミエリンがどれくらい存在するかについて調整する必要がある。ミエリン除去の有効性は、ステップ4.9で推定することができる。</li>
	<li>皮質と小脳から細胞にそれぞれ100μLのミエリン除去ビーズを加え、海馬と線条体から細胞にそれぞれ50μLのミエリン除去ビーズを加えます。</li>
	<li>細胞をビーズと軽く混ぜ、氷上のチューブを10分間インキュベートします。</li>
	<li>皮質細胞を含むチューブの体積をMCSバッファーで2mLに、その他すべてのmLに持ち込みます(すなわち、皮質細胞に1mL、海馬細胞と生体細胞に500μLを加え、小脳細胞に緩衝液を追加する必要はありません)。</li>
	<li>カラムがリンスバッファを空になったら、各カラムの下に15 mLチューブを置きます。皮質細胞(2 mL)をLDカラムにロードし、他のすべての細胞(それぞれ1 mL)をLSカラムにロードします。直ちに1mLのMCSバッファーを使用して、元のチューブを洗浄し、対応するカラムに溶液をロードします。</li>
	<li>LD カラムを MCS バッファーの 1 mL で 1 回洗浄し、各洗浄を 1 mL の MCS バッファーで各 LS カラムを 2 回洗浄します。洗浄中にフロースルー溶液を収集し続けます。</li>
	<li>35μmのストレーナーキャップを通して丸底FACSチューブにセルをフィルタリングします。 注:各チューブは、ミエリンを枯渇させた単一細胞懸濁液の約4 mLを収集する必要があります。</li>
	<li>必要に応じて、細胞懸濁液の10 μLを取り、0.4%トリパンブルー溶液の10°Lと混合します。10倍の明視野顕微鏡で細胞を調べ、収率、生存率、残留ミエリンのレベルを推定します。 注:準備を成功させるには、ミエリンの破片をほとんどまたはまったく含めずに、90%以上の生細胞(形を丸くし、青色の染料を除く)を生成する必要があります。</li>
	<li>FACSチューブ内のペレットセルは400 x gで、ブレーキ= 5で5分間。ゆっくりと上清を注ぎ、ティッシュペーパーにチューブの端をダブします。FACSバッファーの300°Lで各チューブ内のセルを再サスペンドします。 注:MCS選別が好ましい場合、CD11bビーズは、ミエリン除去後にミクログリアおよび他の骨髄細胞を選択するために使用することができる。これらの細胞は、その後、非プレートベースのscRNA-seqだけでなく、バルクRNA-セクに使用することができます。この代替アプローチの注意点は、CD11bビーズは、この抗原に対しても陽性である他の関連免疫細胞からミクログリアを分離しないことである。</li>
</ol>5. 蛍光活性化細胞選別用染色
注:この手順は、約 40 分かかります。
<ol><li>マウスFc受容体ブロック試薬(材料表)を各チューブに5μL添加します。氷の上で5分間インキュベートします。</li>
	<li>CD45-PE-Cy7 を 1 μL、CD11b-BV421 を各チューブに 1 μL 加えます。 注:他の共役フルオロフォアを有する抗体が使用され得る。恒良性ミクログリア9の特定のマーカーであるTMEM119に対する抗体も含めることができますが、特定のミクログリア亜集団がTMEM119表面発現を失う可能性があるため、CD45およびCD11bと一緒に使用することをお勧めします。</li>
	<li>室温(RT)で10分間シェーカーのチューブをインキュベートします。</li>
	<li>2 mL の FACS バッファーを追加して洗浄します。</li>
	<li>ペレット細胞を4°、400 x gで5分間ゆっくりと流し出し、チューブの端をティッシュペーパーに取り付けます。RNase阻害剤の1μLとヨウ化プロピジウムの0.5 μL(PI、1:1,000希釈)を用いて、400μLのFACS緩衝液を使用して各チューブ内の細胞を再サスペンドします。</li>
</ol>6. インデックス FACS ソート
注:この手順は~1時間かかるはずです。
<ol><li>標準的なFACS手順に従って、散乱(破片を除く)、単一細胞、生細胞(PI陰性)、ミクログリアおよび骨髄細胞(CD45+、CD11b+)に基づいてゲートを描画する。 注:典型的なマイクログリア細胞は、血管周辺および髄度マクロファージなどの他の境界関連マクロファージと比較して低レベルでCD45を発現し、したがってCD45低CD11b+にゲーティングすることは、これらの古典的なミクログリア1、2における遺伝子発現プロファイルの焦点であるならば十分であるべきである。しかしながら、ミクログリアの特定のサブセットは、より高いCD45発現を有する可能性があり、これは発達中または疾患状態において特に当てはまる。微小グリア遺伝子発現の偏りのない分析を確実にするために、CD45高およびCD45低免疫フェノタイプは、インデックスソート設定とシーケンシングおよび下流解析のために収集された両方の集団を通じて記録することができる。さらに、TMEM119表面発現は、恒静性微小グリア集団を標的とするために使用され得る(ステップ5.2を参照)、CD45レベルおよびシーケンシング結果と共に分析する。</li>
	<li>単一ミクログリア(100μmノズル付き)を96ウェルポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プレートにソートし、それぞれ4μLのリシス緩衝液を含む(詳細は公開されたプロトコル14を参照)。 注:外部RNA制御コンソーシアム(ERCC)RNAスパイクインミックス(材料テーブル)は、品質管理および正規化目的のために、lysisバッファに1:2.4 x 107で追加することができます。</li>
	<li>ベンチトップ遠心分離機を使用してプレートとスピンダウンを簡単にボルテックスします。</li>
	<li>すぐにドライアイスでサンプルを凍結します。プレートは、ライブラリの準備ができるまで-80°Cで保管してください。 注:あるいは、バルクRNA-セクのRNA抽出バッファーを用いて、より多くの細胞を1.5mLチューブに回収することができる。著者の経験によると、3,000細胞は、公開されたプロトコル2、14に続く良質のライブラリを生成するのに十分です。</li>
</ol>7. 単一細胞RNAシーケンシングライブラリの準備
注:ここで、公開されたプロトコル14は、液体処理ロボティクスおよびいくつかの改変を助けてscRNA-seqライブラリを生成するために続く。この記事では、手順について簡単に説明し、相違点を強調します。4枚のプレートを同時に処理するには約2.5日かかります。
<ol><li>氷上でプレートを解凍し、オリゴ-dT30VNプライマー(リシス緩衝液中)で逆転写を行い、サーマルサイクラーでcDNAを生成する(表1):42°C 90分;70 °C 5 分;4 °Cホールド。次に、PCRマスターミックスとin situ PCR(ISPCR)プライマー(材料テーブル)と次のPCR条件を使用して、最初に追加のエキソヌクレアーゼ消化ステップ(表2)でcDNAを増幅します。95 °C 3 分;98 °C 20 sの 23 サイクル, 67 °15 s, 72 °C 4 分;72 °5 分</li>
	<li>井戸当たり18μLの磁気ビーズ(0.7:1比)を用いてcDNAを精製します。磁気スタンドでプレートを5分間インキュベートし、作りたての80%エタノール、毎回80°Lでサンプルを2回洗浄します。プレートを15〜20分間乾燥させた後、ウェルあたり20μLの溶出緩衝液でcDNAを溶出する。 注:品質管理には、フラグメントアナライザ(高感度次世代シーケンシング[NGS]フラグメント分析、1-6,000 bp)を使用してcDNAのサイズ分布と濃度を確認し、さらに500~5,000 bpのスミアを持つサンプルのみを処理し、0.05 ng/μLを超えます。</li>
	<li>ライブラリを生成するには、ナノリットルピペットマシンの助けを借りて、384ウェルプレートのライブラリ調製キット(材料テーブル)からTn5タグメント試薬の1.2 μLを各cDNAサンプルの0.4μLを55°Cで10分で混合します。 注:ここでは、推奨反応量の1/12.5(5μLサンプルおよび15μLのタグメント試薬)を添加し、コストを削減し、スループットを向上させる。ナノリットルピペットマシン(材料のテーブル)は、試薬(このと次のステップ)を384ウェルプレートとの間で転送するために使用されます。</li>
	<li>0.4 μLの中和緩衝液を加えて、RTでのタグメント反応を5分間停止します。</li>
	<li>384 個のインデックス (材料表、0.4 μL フォワード、0.4 μL リバース)、PCR ミックスの 1.2 μL をサンプルに追加し (それぞれ 2 μL)、次の条件を使用してライブラリを増幅します。95 °C 30 s;95°C 10s、55°30 s、72°1分の10サイクル;72 °5 分</li>
	<li>すべての個々のライブラリ(それぞれ1μLを取る)を同じ384ウェルプレートからプールし、磁気ビーズ(材料表、0.7:1比)を使用して最終的なプールされたライブラリを精製します。</li>
	<li>蛍光計 (材料表)を使用して濃度を測定し、バイオアナライザ (材料表) を使用して、シーケンシングの前にプールされたライブラリのサイズ分布を調べます。シーケンスの深さをセルあたり 100 万の生の読み取り値に設定します。</li>
	<li>標準的なバイオインフォマティクス手順に従って、シーケンシング読み取りをフィルタリングおよびトリムし、アライメント2を実行します。カウント テーブルとメタ データを入力として使用し、Seurat パッケージ15を使用してクラスタリング分析を実行します。</li>
</ol>

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</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

ミクログリアは、CNSの他の細胞タイプと積極的に相互作用し、環境刺激に非常に敏感です。単離過程における炎症反応および遺伝子発現の異常変化を最小限に抑えるために、このプロトコルは以前に公開された方法9から合理化され、ミクログリアを単一マウス脳半球の複数の領域から並列に分離するのに適している。組織および試薬は冷温に保たれ、実験は限られた組織サイズに基づいて少ないワッシュおよびより少ない試薬とタイムリーに(解剖から選別まで約3.5時間)行われる。機械的解離は、ミクログリア9、18にほとんど損傷や活性化を引き起こしながら、ニューロンや他のグリア細胞を除去することができるので、酵素消化などの他の均質化方法をドーニングすることを選択します。しかし、過度のドーニングはミクログリアの収率を低下させる可能性があるため、避けるべきです。機械的解離およびビーズベースのミエリン除去の後、FACSソートは、古典的な炎症遺伝子の最小発現に基づいてミクログリアへの活性化が少なく、例えば、Tnf、Il1b...

ミクログリアは、全神経細胞の5%−10%を表し、中枢神経系(CNS)1全体に散在するマクロファージである。血液脳関門の背後で保護され、健康な成人の脳の典型的なミクログリアは、急速に拡張し、毛陰腫のニューロンや他のグリア細胞と相互作用するために後退する多くの微細なプロセスを含んでいます。ミクログリアはまた、特定の発達段階の間、または傷害および疾患1、2、3、4における免疫上の課題に関連する貪食性形態を採用することができる。最近のエキサイティングな発見は、ミクログリアが脳由来または病理学的シグナルに対して決して受動的な傍観者ではなく、脳の発達と恒常性を制御する上で極めて重要な役割を果たすことを明らかに示している。ミクログリアのより多くの機能が解明されるにつれて、TREM2のような多くの神経変性疾患リスク遺伝子がミクログリア5、6、7によって主にまたは排他的に発現されることを示したヒト遺伝学研究によって興奮がさらに促進される。開発における彼らの意義ともっともらしい疾患駆動の役割を考えると、神経変性疾患1、8の新しい治療標的を見つけることを期待して、近年、微小グリア遺伝子の調節と機能の理解に向けて多大な努力が払われている。
RNAシーケンシング(RNA-seq)は、細胞型特異的遺伝子発現の偏りのない特徴付けを可能にし、これにより科学者が高密度細胞ネットワーク7における遺伝子機能を調査するよう導く。RNA-seqは、主にバルクサンプル上で行われていたが、他の神経細胞および免疫細胞9とそれらを区別する恒静性微小グリア遺伝子シグネチャの発見につながった。しかし、このようなアプローチは、ミクログリア、特に開発中に一過性に存在するミクログリア間の分子的および機能的な違いを見落とす可能性があり、老化や疾患に関連する。実際、単一細胞RNA-seq(scRNA-seq)は、様々な文脈2、3、10においてミクログリアの不均一性を以前に過小評価したことを明らかにすることによって、フィールドに革命をもたらした感度と分解能を提供する。さらに、CNS循環界面に他の同様の免疫細胞が存在するため、scRNA-seqは、これらの関連細胞を分離し、機能的に解剖するための新しいツールの設計を助ける情報を提供する。
scRNA-seqプラットフォームの多様な配列が発明され、それぞれが特定のアプリケーション12に適しています。一般に、10xゲノミクスのような液滴ベースの方法は、各実行で配列された数千個の細胞とのスループットが高く、広範な分類を必要とする混合細胞集団を含む可能性のある入力に対する選択性が低くなります。プレートベースの方法は、より高い感度と読み取り深さ13、14を提供し、通常、微妙な違いやまれなトランスクリプトを明らかにするために、細胞ソートから特定の集団を対象とします。ミクログリア細胞の小さな割合、特に開発または疾患関連のサブ集団を考えると、すべてのCNS細胞型の中で、ミクログリアを特定の目的領域から単離し、それらの異質性を理解するために深く、全長の転写情報を得ることがしばしば望ましい。
ここでは、半自動化されたプレートベースのライブラリ調製手順に従って単一細胞(またはバルク)RNA-seqに使用される単一半球から解剖された異なるマウス脳領域からミクログリアを分離する方法について詳しく説明します。その後、他の半球を組織学的検証に使用できます。以前に公開された方法9から合理化されたこの絶縁プロトコルは、少量の出発物質からの歩留まりを最大化し、一方で内因性微小グリア遺伝子発現プロファイルを維持することを目的とする。蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して、ミクログリア(または対象の他の関連免疫細胞)を96ウェルプレートに濃縮し、ライブラリ調製用試薬の量を小型化してスループットを向上させます。我々は、他のプレートベースの戦略が適用される可能性があるが、この敏感なscRNA-seqプラットフォームを強調する。この方法は、損傷や疾患病巣などの他の解剖組織からミクログリアを分離するために容易に適応することができ、マウスの年齢は、ほぼすべての出生後段階にわたって変化し得る。単一細胞トランストランスクリプトミクス研究のための局所ミクログリアの効率的な分離は、健康および疾患におけるその機能のより良い理解を促進する。

<table><tbody><tr><td>5 M Betaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# B0300-5VL</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R0192</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 15575020</td><td></td></tr><tr><td>10X Hanks'Balanced Salt Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 14185-052</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific Cat</td><td># 15630080</td><td></td></tr><tr><td>1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix</td><td>Kapa Biosciences</td><td>Cat# KK2602</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 丸底ポリスチレンチューブ、セルストレーナーキャップ付き</td><td>Corning</td><td>Cat# 352235</td><td></td></tr><tr><td>AATI、高感度 NGS フラグメント解析キット (1 bp &ndash;6,000 bp)</td><td>Advanced Analytical</td><td>Cat# DNF-474-1000</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# A8806</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington</td><td>Cat# LS002007</td><td>ワーキングソリューション:12500 units/ml</td></tr><tr><td>DTT, Molecular Grade</td><td>Promega</td><td>Cat# P1171</td><td></td></tr><tr><td>ERCC RNA Spike-In Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 4456740</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>カタログ# 10437-028</td><td></td></tr><tr><td>イルミナXTインデックスキット v2 セットA (96インデックス)</td><td>イルミナ</td><td>カタログ# FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>イルミナXTインデックスキット v2 セットB (96インデックス)</td><td>イルミナ</td><td>カタログ# FC-131-2002</td><td></td></tr><tr><td>イルミナXTインデックスキット v2 セットC (96インデックス)</td>イル<td>ミナ</td><td>カタログ# FC-131-2003</td><td></td></tr><tr><td>イルミナXTインデックスキット v2 セットD (96インデックス)</td><td>イルミナ</td><td>Cat# FC-131-2004</td><td></td></tr><tr><td>エキソヌクレアーゼ ラムダ (5 U/&mu;l)</td><td>New England BioLabs</td><td>Cat# M0262S</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc block</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat# 553142</td><td></td></tr><tr><td>Myelin removal beads</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>Cat# 130-096-433</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Sample Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles)</td><td>Illumina</td><td>Cat# 20024907</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 70011044</td><td></td></tr><tr><td>PCRClean DX beads</td><td>Aline Biosciences</td><td>Cat# C-1003-50</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# P3566</td><td>染色: 1:1000</td></tr><tr><td>量子ビット dsDNA HS アッセイキット</td><td>Thermal Fisher Scientific</td><td>Cat# Q32851</td><td></td></tr><tr><td>ラットモノクローナル抗マウス/ヒト CD11b, Brilliant Violet 421 (クローン M1/70)</td><td>BioLegend</td>の<td>猫#101236;RRID: AB_11203704</td><td>染色: 1:300</td></tr><tr><td>ラットモノクローナル抗マウス CD45, PE/Cy7 (クローン 30-F11)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 25-0451-82;RRID: AB_469625</td><td>染色: 1:300</td></tr><tr><td>Recombinant RNase Inhibitor</td><td>Takara Bio</td><td>Cat# 2313B</td><td></td></tr><tr><td>SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/&mu;l)</td><td>Clontech</td><td>Cat# 639538</td><td>5x First Strand buffer</td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 &mu;M ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3'</td><td></td><td></td><td>(Picelli et al., 2014)</td></tr><tr><td>Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3'</td><td></td><td></td><td>(Picelli et al., 2014)</td></tr><tr><td>TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" は forribobases で、"+" は LNA 塩基用)(</td><td></td><td></td><td>Picelli et al., 2014)</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS緩衝液</td><td></td><td></td><td>レシピ:滅菌ろ過された1% FBS、2 mM EDTA、25 mM HEPES含有1X PBS</td></tr><tr><td>MCS緩衝液</td><td></td><td></td><td>レシピ:滅菌ろ過された0.5% BSA、2 mM EDTA含有1X PBS</td></tr><tr><td>Medium A</td><td></td><td></td><td>レシピ:15 mM HEPES、0.5% グルコース含有、フェノールレッド</td></tr><tr><td><およびストロング>プレート</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>384ウェル Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific</td><td>VWR</td><td>89005-556</td><td></td></tr><tr><td>ハードシェル 96-well PCR プレート</td><td>バイオ・ラッド</td><td>HSP9631</td><td></td></tr><tr><td>Others</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 鉗子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Dounce ホモジナイザー, 2 ml</td><td>ウィートン</td><td></td><td></td>357422</tr><tr><td>大型空捺</td>カラム <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>大型セレクションカラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS セパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>RNAzap</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>ストレーナー(70 &mu;m)</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSAria_II_cell_sorter_brochure.pdf" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>フラグメントアナライザー</td><td>Agilent</td><td>5300</td><td></td></tr><tr><td>Mosquito HTS ナノリットルピペッティングロボット</td><td>TTP Labtech</td><td><a href="https://www.ttplabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hts/" target="_blank">https://www.ttplabtech.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 蛍光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Q33226</td><td></td></tr></tbody></table>

ディープシングルセルrnaシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

中枢神経系の常駐マクロファージとして、ミクログリアは脳の発達と恒常性を積極的に制御し、その機能不全がヒト疾患を駆動する可能性がある。恒静性ミクログリアの分子シグネチャや、環境刺激に応じた遺伝子発現の変化を明らかにするために、かなりの進歩が見られた。単一細胞ゲノム方法論の出現と成熟により、異種ミクログリアは、異なる発達および病理学的条件において果たす多様な役割の根底にある可能性がますます認識されています。このような不均一性のさらなる解剖は、目的の所定の領域からミクログリアを効率的に分離することによって達成され、続いて個々の細胞の敏感なプロファイリングが行われる。ここでは、単一の成人マウス脳半球における異なる脳領域からのミクログリアの迅速な分離のための詳細なプロトコルを提供する。また、プレートベースのディープシングルセルRNAシーケンシングにこれらのソートミクログリアを使用する方法も示します。この方法の適応性を他のシナリオに議論し、大規模な研究に対応するためのシステム改善のためのガイドラインを提供する。

このプロトコルは、1人の成人の浸透した脳半球において異なる脳領域からミクログリアを分離およびソートする方法を記述し、続いてscRNA-seqを行う。私たちは、単一の細胞懸濁液を作成するために、またミクログリアを豊かにするための最初のステップとして、ドーニングを使用しています。不十分または過度の実行は、収量を減少させます。さらに、大人のマウスの脳はミエリンの高レベルを含み、適切に除去されない場合は、並べ替え効率と収量を減らすこともできます。そこで、抗体染色を行う前に、トリパンブルーと血球計を用いて顕微鏡下で細胞懸濁液を調べ、ミエリン除去の収率、細胞生存率及び有効性(ステップ4.9)を推定した(図1)。この時点での総細胞数は、皮質の場合は 30,000 を超え、他の組織の場合は 5,000 を超える必要があります。細胞の90%以上は、ミエリンの破片をほとんど持って生きられるはずです。
私たちは、典型的にはCD45低およびCD11b陽性であるミクログリア(または骨髄細胞)をソートするためにFACSマシンを使用します。少なくとも皮...

成体マウス脳半球の異なる解剖領域からミクログリアを分離するためのプロトコルを提供し、続いて全長転写物の深い単一細胞RNAシーケンシングのための半自動化ライブラリ製剤を提供する。この方法は、健康と疾患におけるミクログリアの機能的不均一性を解明するのに役立ちます。

ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

この方法は、単一細胞レベルでのミクログリア遺伝子発現の公平な捕捉を可能にし、健康で病気の脳におけるミクログリアの分子不均一性を解明するのに役立つ。この技術の主な利点は、異なる脳領域からのミクログリアの迅速な分離のための詳細な手順を提供し、効率的に深いシーケンシングのための単一細胞RA6ライブラリの再生ベースを生成する方法を示しています。この手順を開始するには、テキストプロトコルに概説されているとおりに必要なすべてのバッファとソリューションを準備し、氷の上で冷やします。マウスを安楽死させ、首を切った後、小さなはさみを使って頭の皮膚を切り開いて下の頭蓋骨を露出させます。次に、矢状縫合糸、ラムドイド型縫合糸、および冠状縫合糸を切断する。鉗子を使用して組織を損傷することなく頭頂骨と足間骨の両側を引き離し、慎重に脳を中程度のAを含む解剖ペトリ皿に移動させます。小脳と皮質葉と脳幹を分離するために55番鉗子を使用してください。その後、55番鉗子を使用して、海馬と線条体を皮質から慎重に解剖し、各組織を別々のコレクションペトリ皿に移します。まず、カミソリの刃を使用して、各脳領域を1立方ミリメートル未満の細かい部分に切り刻みます。先端を切り落とした1ミリリットルのピペットを使用して、組織片を冷やされたDounceホモジナイザーに移します。目に見える塊がなくなるまで、6〜10フルストロークでDounceホモジナイザーのピストンをゆっくりとねじることによって組織を均質化します。次いで、解約した組織を70マイクロメートルのストレーナーを通して50ミリリットルの管に移す。各Dounceホモジナイザーとピストンを合計6ミリリットルの冷媒Aでリンスし、遠心分離のために15ミリリットルのチューブにリンスを移します。遠心分離機単細胞懸濁液は400g、摂氏4度で5分間、5時に休憩を取る。3ミリリットルのMCSを備えた磁気セパレータで、1つの大きな枯渇カラムと3つの大きな選択カラムをリンスします。組織サンプルの遠心分離が完了すると、ピペットを出してペレットを乱すことなく上清を捨てます。RNase阻害剤を含むMCSバッファ内の細胞を再中断します。皮質および小脳からの再懸濁細胞を含む各チューブにミエリン除去ビーズの100マイクロリットルを加え、海馬および線条体から再懸濁細胞を含む各チューブに50マイクロリットルのミエリン除去ビーズを加える。氷上のチューブを10分間インキュベートします。この後、皮質細胞を含むチューブにMCSを加え、その体積を最大2ミリリットルにし、残りのチューブに1ミリリットルまでの体積を持ち込みます。カラムがすすいバッファーの空になったら、2 ミリリットルの皮質細胞を大きな枯渇カラムに、互いのセル懸濁液を 1 ミリリットルずつ別々の大きい選択列にロードします。次に、大きな枯渇カラムを

isolation-region-specific-microglia-from-one-adult-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

マウス脳の特定の領域におけるRNA発現プロファイリングには、正確で再現性のある組織採取戦略が必要です。ここでは、冠状断による脳切断と組織コーラーを用いたマイクロダイセクションの両方を併用するプロトコルについて説明します。得られたサンプルから抽出した全RNAの収量と品質により、本手法の有用性が確認されています。...

トータルRNAの単離およびダウンストリーム次世代シーケンシングと遺伝子発現プロファイリングのための離散マウスの脳領域のマイクロダイセクションのための非レーザーキャプチャー顕微鏡のアプローチ

このビデオは、成体マウスの脳の皮質からミクログリアを分離する技術を示しています。まず、皮質はセグメンテーションと均質化を受けてニューロンや他のグリア細胞を除去し、ミクログリアを維持します。その後、細胞懸濁液を抗ミエリン磁性マイクロビーズと磁界に曝露し、ミクログリアと骨髄細胞をミエリン破片とミエリンを含む細胞から効果的に分離します。...

成体マウス脳の皮質からのミクログリアの分離

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

ここでは、マウスCNSからの複数のグリア細胞集団のin...

複数の中枢神経系領域からのマウスグリアの解剖と分離

このプロトコルは、マウス上頸部および星状神経節の解剖、細胞解離、凍結保存、核単離、ハッシュタグバーコーディングなど、単一核シーケンシングのための詳細で低入力のサンプル調製について説明しています。...

単一核RNAシーケンシングのためのマウス交感神経節のバーコード化抗体による低入力核単離および多重化

ここでは、柱状磁気活性化細胞選別を利用して、脱髄疾患の動物モデルにおける原発性ミクログリアを単離および精製するためのプロトコルを提示する。...

脱髄の動物モデルにおける磁気活性化細胞選別によるマウス原発性ミクログリアの単離

これまでのところ、すべての主要な中枢神経系常在細胞タイプを同じマウスから同時に単離するためのプロトコルは、満たされていない需要です。プロトコルはneuroinflammationの間に複雑な細胞ネットワークを調査し、同時に必須のマウス数を減らすために素朴で、実験的な自己免疫の脳脊髄炎のマウスで適当なプロシージャを示す。...

成体自己免疫性脳脊髄炎マウスからの主要な中枢神経系常在細胞型の同時単離

このプロトコルはRNAの分析および細胞培養のようなそれに続く適用を促進する大人のマウス脊髄からの浄化されたastrocytesそしてミクログリアの隔離を概説する。これには、単離された細胞の品質と収量の両方を向上させるように設計された詳細な細胞解離方法と手順が含まれています。...

成体マウス脊髄からの純粋なアストロサイトおよびミクログリアの単離(Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord for the In Vitro Assays and Transcriptomic Studies)

私たちは、磁気活性化セルソーティング(MACS)を使用して、マウスの視床下部(または同等の小さな脳構造)からミクログリア細胞を比較的短時間で単離するためのプロトコルについて説明します。MACSで選別された視床下部ミクログリアは、 ex vivo 分析に使用でき、 in vitro...

磁気活性化細胞選別による灌流したばかりの成体マウス脳からの視床下部ミクログリアの単離  

本プロトコルは、成体マウスから初代海馬ミクログリアを単離し精製する方法を説明し、続いて、これらの急性に単離された細胞の全細胞パッチクランプ記録を実施するための指示が続きます。...

成体マウスからの海馬ミクログリアの単離と全細胞パッチクランプ記録

このプロトコルは、フローサイトメトリーとシングルセルRNAシーケンシングを組み合わせて、出生後早期マウス脳の小脳におけるミクログリア細胞の状態を単離し、特徴付けます。酵素解離、パーコール遠心分離、免疫染色を使用してミクログリアの不均一性を明らかにし、小脳の発達と疾患におけるミクログリアの役割の理解を深めます。...

出生後早期マウス脳発生におけるミクログリア活性化を特徴付けるためのフローサイトメトリーと単一細胞解析

学ぶ 成人マウス脳半球から領域特異的ミクログリアを分離し、ディープシングルセルRNAシーケンシングで遺伝子発現を解析する方法。神経変性疾患におけるミクログリアの機能的多様性を解明する。

ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

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