ラットにおける円周食道再建のための組織工学型移植片
2020年2月10日
食道再建は困難な処置であり、食道粘膜や筋肉の再生を可能にし、人工移植として移植できる組織工学的食道の開発が必要である。ここでは、足場製造、バイオリアクター栽培、各種外科技術など、人工食道を生成するためのプロトコルを紹介します。
経周食道修復は、ラットモデルでは技術的に困難であり、食道吻合筋漏れのない食道粘膜や筋肉の再生を可能にする組織操作食道の開発が必要です。移植後の唾液漏れを最小限に抑えるために、内ナノファイバーと外側3Dプリンティングストランドを組み合わせて、2層状の管状足場をパイロットモデルとして実装しました。従来の標準的食道再建は、広範囲の合併症および罹患率に関連している。
したがって、食道組織工学は、ネイティブの患者食道モデルを開発するための有望な代替戦略である可能性があります。ハイブリッド足場、バイオリアクター栽培、および経口栄養システムの組み合わせは、その連続的な機械的圧力と同様の汚染された環境を有する任意のシステムに適用することができる。まず、紫外線への1時間の暴露、エタノールへの10分間の浸漬、PBSでの3回のスケッシュで3Dプリント食道足場を殺菌することから始めます。
最後の洗浄の後、2層状の管状足場を非接着型の24ウェル組織培養プレートに入れ、足場の内面に成長培地を加えた基基膜マトリックスのミリリットル当たり6つの脂肪由来ヒト間葉幹細胞に10回10回を加える。細胞種管状足場をバイオリアクターの培養室のアクリルホルダーにしっかりと固定し、500ミリリットルの成長培地をチャンバーに加えるために、脈動性流動バイオリアクターシステムを使用します。次に、5%の二酸化炭素を含む湿気のある雰囲気下で、流れ誘発せん断応力の1センチメートル/1ダインを適用する。
5日後、LIVE/DEAD Viabilityアッセイキットを使用して、標準的なプロトコルに従って足場の内面の細胞応答を決定し、共焦点顕微鏡で細胞を画像化します。手術を開始する前に、麻酔ラットのペダル反射に対する応答の欠如を確認し、動物を無菌ドレープの上のスペイン位置に置きます。バリカンを使用して外科部位から毛髪を取り除き、露出した皮膚をシーケンシャルΒDINEおよび70%エタノールスクラブで消毒する。
Tチューブの配置のために、ラットの腹部に中線の皮膚と筋肉の切開を行い、メスの刃を使用して前胃壁に3ミリメートルのオリフィスを作成します。シリコーンTチューブの先端を欠損部位に挿入して胃壁に固定し、チューブを胃筋組織に慎重に縫合します。腹壁を4-0 VICRYL縫合で縫合する。
慎重に首の後ろに皮下トンネルを通って埋め込まれたTチューブの遠位端を挿入し、血管カテーテルを使用してヘパリンキャップをTチューブの端に接続して、胃の内容物が後方に流れないようにします。キャップが所定の位置にある場合は、4-0ポリグラクチン縫合糸を使用して腹部の皮膚のすべての層を閉じ、完全な再発まで監視してラットを代謝ケージに入れます。Tチューブの配置の1週間後に、デモンストレーションのようにラットを手術用に準備する。
ラットを顕微鏡下に置き、露出した感染した皮膚に前中央分離帯の頸部切開を行う。ストラップの筋肉を分離して気管食道構造を露出させます。食道の左側を気管から分離します。
食道の上部を甲状腺から慎重に分離し、手術用はさみを使用して、食道のすべての層を含む5ミリメートルの全周欠損を作成する。次に、上部食道残骸と足場の右下垂部マージンと足場の間に9-0の縫合糸を挿入し、上食道残骸と足場の間で右から左に縫合を続け、遠位食道欠損の上端に微小吻合を作り出す。次に、下食道残骸の上マージンと同様にして足場を吻合する。
アナストモーゼが完成したら、移植部位の上に周囲の甲状腺フラップを置き、移植片への血管供給と安定した維持を確保する。次に、皮下筋と皮膚組織を4-0 VICRYL縫合糸で縫い合わせ、完全な再発までモニタリングを行う赤外線ウォーミングデバイス上の代謝ケージにラットを入れます。注入によって足場の内壁に均等に適用した後、ヒト間葉系幹細胞埋め込み基質マトリックスは、走査型電子顕微鏡法で評価される予想される間葉系幹細胞形態を示す。
示されているように完全な周回食道欠損を有するラットへの食道移植後、移植片は、移植部位への安定した固定および血管供給のために甲状腺フラップで覆われる。食道移植ラットは処置後約9日まで340グラムのままで、その時点で動物は様々な原因のために体重が急速に減少し、15日目までに死亡する。ほとんどのラットは毛玉によって引き起こされる非食道閉塞を発症するが、全体的に穿孔、瘻孔による吻合漏れ、精巣の蓄積、膿瘍形成、または周囲の軟部組織壊死の総証拠はない。
移植部位の再上皮化はケラチンの免疫蛍光染色によって確認でき、再生コラーゲン層とエラスチン繊維はマッソンのトリクローム染色によって明確に観察することができる。食道筋層の再生は、デスミン免疫体系化学分析によって評価される豊富な新生血管化によっても証明される。この手順の成功は、食道再建中に栄養を提供するために首の後ろの固定を介してTチューブの安定した維持に依存しています。
この手順に典型的な初期死亡率を克服するために、臓器不同または早期血管化技術を食道移植後に適用して、機能的食道再建を助けることができる。
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概要
食道再建は複雑な術式であり、効果的な再生には組織工学的な食道の手法を確立することが極めて重要です。本記事では、スキャフォールドの作製と手術技法に焦点を当てた、人工食道作製のプロトコルを提示します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 組織工学
- 再生医療
- 外科的手法
背景
- 食道の円周方向の修復は技術的に困難です。
- 標準的な食道再建術は合併症の発生率が高くなっています。
- 組織工学的な解決策により、より良好な結果が得られる可能性があります。
- ハイブリッドスキャホールドは食道の再生をサポートできます。
研究目的
- 合併症を最小限に抑えた組織工学的食道を開発すること。
- 食道修復のための2層構造スキャフォールドモデルを実装すること。
- 食道組織の再生を促進する方法を探索すること。
使用方法
- ナノファイバーと3Dプリンティングを用いた二層構造の管状スキャフォールドの作製。
- 移植後の唾液漏出を減少させるための微小血管吻合。
- 組織成長を支援するためのバイオリアクター培養。
- UV光とエタノールを用いたスキャフォールドの滅菌。
主な結果
- ハイブリッドスキャフォールドは、食道組織の再生を効果的にサポートします。
- 微小血管吻合術により、リーク（漏出）が最小限に抑えられていることが観察されました。
- モデルにおいて、経口栄養システムの導入に成功しました。
- 汚染環境における適用の可能性が示されました。
結論
- 組織工学による食道は、臨床応用の可能性を示している。
- ハイブリッドスキャフォールドを用いることで、手術成績を大幅に向上させることができる。
- 手法および材料を最適化するために、さらなる研究が必要である。
よくある質問
業界における重要性
組織工学的食道移植片は、吻合部漏出や上皮化不全により従来の治療法では失敗率が高いという、周方向欠損修復における再生医療の重要な未充足ニーズに対応するものです。本ラットモデルでは、ポリウレタンナノファイバー、3Dプリントポリカプロラクトン、間葉系幹細胞のバイオリアクターによる事前コンディショニング、および血管柄付き皮弁による被覆を組み合わせたハイブリッドスキャフォールド戦略により、粘膜および筋肉の再生を促進します。このアプローチは、より大規模なモデルへのスケールアップやIND申請に向けた研究に移行する前に、食道組織工学戦略のリスクを低減させるための前臨床プラットフォームを提供します。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期発見とターゲット検証
- 科学的価値： 機械的に活性な管腔環境において、間葉系幹細胞のパラクリン効果が上皮および平滑筋の再生に及ぼす影響を解析することを可能にする。
- 実用的価値： スキャフォールドの構造と細胞播種密度を標準化し、移植片の統合と組織層形成の再現性のある評価を実現する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： バイオマーカーを用いた移植効率の評価に向けて、定量的組織学的エンドポイント（ケラチン陽性上皮、デスミン陽性筋肉、エラスチン沈着、CD31陽性新生血管）を算出する。
- 実用的価値： 生理的に適切なせん断応力下で、幹細胞を播種したスキャフォールドをプレコンディショニングするための標準化された灌流バイオリアクタープロトコルを確立する。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：蠕動力の影響を受ける汚染された高可動環境において、移植片の生存率を向上させる戦略として、血管柄付き皮弁による補強を検証する。
- 運用的価値：食道再建モデルにおける早期合併症を軽減するための周術期ケアの一環として、一時的胃瘻による栄養サポートの有効性を検証する。
パイプラインおよびワークフローへの統合
本研究は、スキャフォールド設計と細胞コンディショニングがリード候補の選択に寄与し、移植結果が中空器官再生における血管化グラフト戦略のゴー/ノーゴー（継続か中止か）の決定を導くという、基盤研究から前臨床研究への連続的なプロセスに位置づけられます。
- 探索生物学：スキャホールド組成やバイオリアクターによるコンディショニングなどの制御変数を通じて、動的な管腔環境における幹細胞介在性の組織再生のメカニズム的なリスク低減を支援します。
- スクリーニング：定量的かつマルチプレックスな組織学的リードアウトを提供し、スキャホールドのデザインや細胞投与量レジメンの並行比較を可能にします。
- 分析：機能的なグラフト開存性と相関する、ストローマおよび上皮の再生指標（エラスチン繊維密度、ケラチン被覆率、筋肉層の厚さ）を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：外科的吻合、フラップ被覆、栄養サポートなど、食道再建における重要なトランスレーショナル変数を組み込むことで、ベンチから大型動物研究への連続性をモデル化します。
- 企業的な再利用：スキャホールド材料、細胞型、バイオリアクターパラメータを他の管状臓器（例：気管、尿管）の再建に適応させることができるモジュール式プラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 学術的価値：系統特異的マーカーの時空間的な追跡を可能にすることで、管状器官の再生時における上皮と筋肉のクロストークに関するメカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 実用的価値：GMP準拠の細胞処理ワークフローと互換性のある、滅菌可能な標準化されたスキャフォールド形式を提供する。
- 戦略的価値：血管柄付き皮弁またはオルガノイド増強戦略が、術後2週間以上の移植片生存率に与える影響を定量化し、リスク調整済みの投資判断に寄与する。
- ポートフォリオへの影響：定義された術後間隔における組織学的成熟度および新生血管形成に基づき、食道再生アプローチの早期段階での選別（トリアージ）を可能にする。
実施上の考慮事項
- スキャフォールド（足場）の作製、幹細胞のハンドリング、および拍動流バイオリアクターの操作に関する専門知識が必要です。
- 構造的および細胞的な検証のため、3Dプリンティング、エレクトロスピンニング、および共焦点顕微鏡へのアクセスに依存します。
- 術者間で、外科的吻合、フラップ採取、および胃ろうチューブ留置の標準化されたプロトコルが必要です。
- ラットからより大型のモデルへ移行する際は、種特有の治癒キネティクスおよび免疫応答の違いを考慮しなければなりません。
- 食道以外の合併症（例：栄養不足、毛球症による閉塞）による術後早期死亡が制限要因となっており、周術期ケアモデルの改善の必要性が浮き彫りになっています。
