Name: 正確な細胞表現と正確なタンパク質局在化のための細菌細胞の三次元イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: 学ぶ 細菌細胞の三次元イメージング手法。E. coliの形状再構成とタンパク質局在解析を行い、細菌形態学の理解を深める。このプロトコルは標準的な顕微鏡とMATLABスクリプトを使用する。

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ジェフリー・グエンとジョシュア・シャヴィッツがこの方法の開発を支援してくれたことに感謝します。 資金調達: RMM - NIH F32 GM103290-01A1, BPB - グレン老化研究と国立科学財団の研究のためのグレンセンター PHY-1734030.

1. サンプル調製
<ol><li>細胞質蛍光タンパク質6を発現するように設計するか、膜色素5を用いて、イメージング用に大腸菌蛍光を作る。他の細菌種は、大腸菌の代わりに使用することができます。<ol>
<li>細胞質mCherry蛍光タンパク質をコードするプラスミドを用いてエレクトロポレーションを介して細胞を形質転換する。 注:の他の色の異なる蛍光タンパク質を使用することができる。</li>
		<li>37°Cで適切な抗生物質でLBプレート上の形質転換体を成長させます。単一のコロニーを取得し、顕微鏡検査によって陽性クローンを同定する。顕微鏡の下に赤く見える抗生物質耐性コロニーには、mCherryを運ぶプラスミドが含まれている。</li>
	</ol>
</li>
	<li>LB液体媒体中の一晩培養物の2mLを、振とうインキュベーターで37°Cの適切な抗生物質で成長させる。プレートのコロニーまたは少量の冷凍庫ストックを接種品として使用します。 注:実験に選択した細菌細胞に必要な媒体を使用します。</li>
	<li>一晩培養1:1,000を新鮮なLB媒体の5mLにサブカルチャーし、3-4時間の振とうインキュベーターで細胞を37°Cで指数位相まで成長させ、細胞のOD600を測定して指数位相に入っていることを確認する(すなわち.、OD600 = 0.2−0.4)。 注:イメージングは、行われている実験に応じて任意の成長段階で行うことができる。</li>
</ol>2. スライドの準備
注:自己蛍光の少ないメディアを使用することが重要です。自己蛍光が低い任意の媒体を使用することができます。この実験では、1%アガロースM63最小限のメディアパッドとVaLaP19によるシールが3Dで細胞を画像化するために必要とされる。
<ol><li>
最小限のメディアの20 mLでアガロースの1%溶液を準備します。
	<ol>
<li>アガロースが完全に溶解し、溶液が明確に表示されるまで溶液をマイクロ波。</li>
		<li>溶液は、使用する準備ができるまで60°水浴に保管してください。 注:この溶液は、必要に応じて固化して溶融することも、必要に応じて溶融する少量に引用することもできる。複数の使用後、メディアが変色し、交換する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>80-100°Cのホットプレート上の溶融VaLaPシーラント。 注:VaLaPを調製し、シーラントとして使用し、80−100°Cのホットプレート上のビーカーにそれぞれ50gの石油ゼリー、ラノリン、パラフィンを一緒に溶かすことによって使用する。この大量のVaLaPは室温で無期限に保存することができ、>500スライドで十分です。>100 °Cで加熱すると劣化し、色が暗くなります。</li>
	<li>スライドの反対側の端に、20 mm x 20 mm のカバースリップを 3 つずつ 2 つ積み重ねます(合計 6 枚のカバースリップ)。</li>
	<li>アガロースパッド溶液のピペット200μLをスライドに。 注:工学的蛍光染色を使用しない場合は、この工程の前に膜色素をアガロースパッド溶液に添加してもよい。水に染料を再スペンドし、アガロースパッド溶液の1 mLに染料を5μg/mLの最終濃度に加えます。</li>
	<li>すぐにしっかりとカバースリップのスタックの上に2番目のスライドを置いて寒天を平らにし、室温で1分間固まらせます。</li>
	<li>上部スライドから慎重にスライドします。</li>
	<li>200°Lピペット先端の大きな端を使用して、スライド上のゲル(直径約5mm)から個々のパッドを切り取り、不正なゲルまたは不要なゲルを廃棄します。 注:複数の株または条件をイメージングする場合は、それぞれに個別のパッドが必要になります。1 つのひずみをイメージする場合は、カバースリップをサポートするために 3-4 パッドを作成します。</li>
	<li>ピペット細胞は、細胞の塊を破壊し、培養がよく混合されていることを確認するために、複数回上下に細胞。ピペット1μLのステップ1.3からパッド上へ。 注:細胞形状の再構成には、他の細胞に触れていない個々の細胞が必要です。定常相または高細胞密度培養物を使用する場合は、パッド上に配置する前にサンプルを1:10に希釈する必要がある場合があります。</li>
	<li>サンプル空気を5~10分間乾燥させてください。液体が残っている場合、細胞は液体内を移動し、画像化することはできません。</li>
	<li>パッドの上部にカバースリップを置きます。</li>
	<li>綿棒でカバースリップの縁を軽くブラッシングして、溶かしたVaLaPでカバースリップを密封します。目的が触れるカバースリップの上部から離してください。VaLaPは数秒で硬化し、サンプルを密封します。</li>
	<li>すぐにサンプルをイメージします。 注:サンプルは、スライドの準備が完了したらすぐに画像化する必要があります。細胞はパッド上で成長することができ、それらが再構成を分割する場合、より困難になります。</li>
</ol>3. イメージング要件
<ol><li>z または顕微鏡の集束軸が 50 nm 未満の正確な動きを行うことができることを確認します。一般的な電動フォーカスデバイスではこの精度を提供できないため、研究グレードの顕微鏡で入手可能なz piezoステージ(材料表を参照)を使用してください。 注:ナイキスト・シャノンのサンプリング基準20を仮定すると、1つは、最小の目的のステップサイズ、または2倍の目的の空間周波数を0.5倍に移動する能力を持っている必要があります。このプロトコルで必要な 100 nm ステップでは、精度が 50 nm 以下のステージが必要です。</li>
	<li>
顕微鏡に1.45の最小開口(NA)の100倍の目標が含まれていることを確認します。
	<ol>
<li>200 ~ 400 の異なるセルの Z スタックを収集して、下流アプリケーションに十分なセルが得られるようにします。 注:必要なセルの数は、対象のサンプルの基になる変動性によって異なります。この時点で収集された細胞の中には、再構成手順を通じてそれを作らないものがあります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>二次蛍光チャネル(タンパク質、代謝標識など)を測定する場合は、Zスタックが形状チャネルに使用される設定と一致していることを確認します。</li>
</ol>4. イメージング
<ol><li>密閉されたスライドを顕微鏡に挿入し、顕微鏡室がサンプル調製室とは異なる温度にある可能性があるため、周囲と温度を平衡化するために5分間座るようにします。</li>
	<li>
試料の蛍光Zスタックを取る。 注: Z スタックは、被写界深度よりも短い Z 間隔でサンプルを完全にカバーする必要があります。1.45 NA 100xの目的および約1μmの厚い大腸菌細胞の場合、ステップあたり100 nmで40ステップがうまく機能します。表面に完全に平らに置かっていない大きな細胞や細胞の場合は、50以上のステップが必要な場合があります。十分な手順を含め、サンプルが上下に完全にぼやけているようにします。<ol>
<li>顕微鏡に関連付けられたソフトウェア(「材料表」を参照)を使用して、顕微鏡を制御します。</li>
		<li>顕微鏡の焦点の車輪を使用して細胞の中央に焦点を当てる。[ND取得]で[Z] ボックスをオンにして Z スタックを取得します。[ホーム]ボタンをクリックして、セルの中央を開始点として設定します。ステップサイズを0.1μmに設定し、[範囲]を4μmに設定します。</li>
		<li>ラムダウィンドウの下の蛍光チャンネルを、画像化する蛍光分子の設定に設定します。この実験ではGFPおよびmCherryを用いた。 注:追加の蛍光チャネルの 3D 分布が必要な場合は、2 番目のカラー チャネルで同じステップ サイズと範囲を持つ追加の Z スタックを使用します。この実験では、細胞質mCherryを用いて細胞形状を決定し、MreB-GFPを第2のカラーチャネル21として用いた。</li>
		<li>切り替える前に、各カラー チャンネルで完全な Z スタックを使用できるように、実験の順序がラムダ (z シリーズ) に設定されていることを確認します。</li>
		<li>[今すぐ実行]をクリックしてイメージの取得を開始し、一方または両方の z スタックが完了したファイルを保存します。</li>
		<li>パッド上の新しい領域に移動し、手順 4.2.2 から 4.2.5 を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 細胞再建
<ol><li>個々のセルをトリミングし、ファイルごとに 1 つのセルしか存在するように、イメージを積み重ねられた tiff ファイルとして保存します。このセルが他のセルから十分に分離されていることを確認します (つまり、ぼかし関数の全角半最大値の約 5 倍を xy 単位で指定します)。 注:これは、自由に利用できる画像解析ソフトウェアを使用して行うことができます(材料表を参照)。<ol>
<li>個々のセルの周囲にボックスを描画し、そのセル 2x をチャネルごとに 1 回複製します。[ハイパースタックの重複] ボックスがオンになっていることを確認し、チャネルを 1 または 2 に変更して、スライスに z スタック全体が含まれていることを確認します。 注:細胞の形状のみを画像化し、追加の蛍光タンパク質をイメージングしない場合は、1つのチャネルのみが存在します。</li>
		<li>両方のスタックが使用可能になったら、イメージ |スタック |ツール |画像を最初にタンパク質チャネルと組み合わせ、形状チャネルを第2に連結する。</li>
		<li>新しいイメージを tiff ファイルとして保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>サブ回折限定蛍光ビーズ22を用いて顕微鏡のぼかし機能を測定する。これは、顕微鏡および顕微鏡の目的ごとに行う必要がありますが、目的のサンプルをイメージングする前または後に行うことができます。
	<ol>
<li>利用可能なソフトウェアを使用して手動介入を行う複数の独立したビーズを平均化します(材料表を参照)。 注:最終製品は、目的のサンプルと同じ xyz 間隔を持つぼかし関数の 3D イメージである必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>使用可能なソフトウェアを使用して、前方畳み込みセル形状再構成スクリプトを実行します。これらのスクリプトの最新バージョンは、https://github.com/PrincetonUniversity/shae-cellshape-publicから自由にダウンロードできます。
	<ol>
<li>トリミングされたイメージとshae-cellshape-public/exampleData_tri からセルシェイプ_settings_tri.txtファイルを含むフォルダをデスクトップ上のフォルダに作成します。</li>
		<li>セル図形を編集して、目的の実験に適した設定を行います。この実験では、設定ファイルに次の行が含まれています。 nm_per_pixel 70 Zスケール 0.65 スタック_zサイズ 41 スタック t サイズ 1 Fstack_z_size 41 Fstack_t_size 1 スタック-セペレーション_nm 100 Fstack_seperation_nm 100 psfScript -999 osuPSF20180726 グラデーション 1 注:このテキスト ファイルはセクションに編成され、各セクションは独自の変数に解析されます。設定の多くは実験から実験に変更する必要はありませんが、Z スタックのサイズ (形状の場合はstack_z_size、対象のタンパク質の場合は Fstack_z_size)、zスタックの間隔(stack_seperation_ ) を確認する必要があります。nm, Fstack_seperation_nm), 顕微鏡の相対的な焦点シフト (Z_scale)23, xy (nm_per_pixel) のピクセルサイズと、顕微鏡のぼかし関数をロードするスクリプトの名前 (psfScript)は実験と一致します。図形チャネルが細胞化的に塗りつぶされている場合はグラデーションフィールドを 1 に設定し、膜染色されたオブジェクトの場合は 0 に設定する必要があります。</li>
		<li>文字列をフォルダの場所に続けて開始するセルの数と実行するセルの数を指定して、セルシェイプ_detector3dConvTriFolder関数 (shae-cellshape-public/CellShapeDetectorTri/) を実行します。 注:入力の例は次のようになります: Cell_shape_detector3dConvTriFolder (「トリミングされた画像を含むフォルダーへのパス」、フォルダー内のインデックスの開始、セルの数)。一般的なセルは、再構築が収束して終了するまでに 5 ~ 20 分かかる場合があります。</li>
	</ol></li>
	<li>統計的分析にセルを使用する前に、セルの再構成をスクリーニングして正しいことを確認します。
	<ol>
<li>ScreenFits (shae-cellshape-public/shae-fitViewerGui/) を実行して、個々のセルの再構成を視覚的にスクリーニングします。</li>
		<li>グラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) が開いたら [フォルダーの選択] ボタンをクリックし、手順 5.3 で作成した再構築データ ファイル (TRI.mat) を含むフォルダーを選択します。</li>
		<li>セルの再構築の横にあるボックスを選択します (図 3)。これは、穴のあるセル、平らな側面、または分岐が出てくるように見えます。これにより、ファイル名に 'FLAG' が追加され、ダウンストリーム分析から除外できます。 注:再構築されたセルは、元の画像と比較できます。これは、細胞がさまざまな異種の図形の集団から来る場合に特に重要です。</li>
	</ol></li>
	<li>エンリッチメントSmoothingSpline(shae-cellshape-public/)を実行して、表面のガウス曲率の関数として目的のタンパク質の相対濃度の濃縮プロファイルを作成します。
	<ol>
<li>手順 5.3.3 で作成した TRI.mat ファイルを含む各フォルダを選択します。</li>
		<li>新しく作成した (5.5.1) curve.mat ファイルを選択します。 注:5.5.1 で選択したフォルダごとに curve.mat ファイルが作成されます。すべてのエンリッチメントプロファイルが1つのグラフに表示されます。フォルダごとに 5.5 を実行するよりも個々のグラフが必要な場合。 注:蛍光タンパク質の正確な幾何学的局在化に加えて、オブジェクト4の数、サイズ、および向きをカウントするなど、二次チャネルからのデータを分析する他の多くの方法があります。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

このプロトコルの重要なステップは、高品質の画像の取得です。セルを適切に再構築するには、セルの上下に十分なぼかしが必要です。したがって、取得した Z スタックは十分な距離をカバーすることが不可欠です。画像取得中に実行されるステップ数は、ひずみごとに調整できます。たとえば、rodZ用に削除された大腸菌細胞は広く、より多くのステップを必要とするため、野生型のセルよりも距離が長くなります。画像取得中にサンプルがドリフトした場合、再構成に大きな誤差が発生する可能性があります。したがって、Zスタック取得時のドリフトを避けるために、イメージング前に顕微鏡でスライドを熱平衡状態にすることが重要です。細胞は、自己蛍光の少ないパッド上で画像化する必要があります。一般的なLB培地に見られるような媒体成分は、細胞を再構成しようとする際に問題を引き起こす可能性のある自己蛍光を有する。再構成プロセスは各細胞に対して独立して行われるため、イメージングパッド上の細胞の密度は重要です。細胞が少なすぎると十分な数の細胞の画像を得るのに必要な時間が長くなり、細胞が多すぎると、個々の細胞を簡単に作り出すには密度が高すぎるイメージング場が生まれます。すべてのセルが正しく再構築されるわけではないため、取得ステップ中に余分なセルを画像化し、統計分析を進める前にすべての出力をスクリーニングする必要があります(図3)。
この方法の制限の多くは技術的です。使用する顕微鏡では、細菌のサイズスケールで光学的な断面を可能にするため、開口数が高い目的(通常は>1.4)が必要です。さらに、顕微鏡はZ方向に小さく、精密なステップを取ることができるピエゾ段階を装備する必要がある。さらに、必要ありませんが、画像解析ソフトウェアを実行するための高スループットの計算リソースへのアクセスは、セルを再構築する処理時間を短縮するため、強くお勧めします。
この方法の概念的な制限の 1 つは、画像の信号対雑音比に対する再構成の滑らかさを重み付けするための正しいエネルギースケールを選択する必要がなされるということです。パラメータの選択を検証するには、透過型電子顕微鏡(TEM)や原子間力顕微鏡(AFM)などの独立した方法を使用して、細胞のサイズと形状を測定する必要があります。原理の証明として、細胞の3D再構成は、Z精度(<50 nm)をテストするためにAFMまたはTEMグリッド上で行われ、Xy精度(<30nm)3をテストしました。このような相関アプローチは、時間とコストがかかります。より簡単なアプローチは、野生型細胞や1μm球形ビーズなどの標準サンプルを画像化することです。再構成の直径と球数は、再構成に使用されるサイズとエネルギースケールが正しいことを確認するために使用することができます。
蛍光顕微鏡画像から高解像度の空間情報を抽出しようとする方法はこれだけではありません。多くのレビュー記事は、超分解能顕微鏡24、25の分野における最近の進歩について説明しています。デコンボリューション顕微鏡26、紡糸ディスク共焦点顕微鏡27、画素再割当28、および構造化照明顕微鏡(SIM)29などの分解能向上技術は、分解能を向上させようとする。顕微鏡で取得した画像。これらのメソッドは、提示されたアプローチと互換性がありません。最近、この方法は、入力9としてSIMベースの画像を可能にするように適応されました.フォワード畳み込み法は、デコンボリューション顕微鏡との基礎の一部を共有していますが、出力は全く異なります。デコンボリューション顕微鏡などのアプローチは画像の解像度を向上させようとしますが、このアプローチは画像を生成するのではなく、約50nmの精度で細胞形状を再構築します。まばらに標識されたサンプルに基づく単一分子活性制御顕微鏡技術は、この方法よりもさらに高いレベルの空間精度を提供することができる。多くの場合、これらの単一分子アプローチは蛍光構造の最適化を必要とし、長い取得時間を必要とし、ライブサンプルや動的サンプルでは使用が困難です。これらの各メソッドには、このメソッドにははない 1 つ以上の注意事項が付属しています。例えば、ディスク共焦点顕微鏡を紡ぎることによって宣伝される利点は、平面光からあまりない細菌細胞の単層には適用可能ではない。さらに、この方法は、特殊な蛍光色素を必要とせずに正確な3D細胞形状とタンパク質局在化を取得するためのパイプラインを提供します。この方法は、最小限のハードウェア要件(すなわち、z piezo、高NA目標)を有し、時間当たり数十枚の画像しか必要とせず、動的な3D構造6を簡単に調査することができます。
3D構造における細菌細胞の組織化を研究するアプローチが増えています。これらには、概念的に高品質を利用するこれに類似したアプローチが含まれます, 3D蛍光画像30,31,32.このアプローチは、十分に分離された細胞を必要とし、細胞幾何学に関する事前の仮定を行いません。しかし、緻密な細胞凝集体またはバイオフィルムに移動するために、細胞は棒状であると仮定される。この低解像度のビューは、バイオフィルム内の細胞の高密度化は、特定の因子の細胞内局在の分析を防ぐが、細胞のパッキング配置を調査することができます。
将来的には、単一分子と広視野アプローチをこの3D再構成技術と統合する枠組みを開発することは興味深いかもしれません。さらに、より密な細胞クラスターの再構成を可能にするために、マシンビジョンセグメンテーションツール32を用いたこの前方畳み込みアプローチを含め得る。
細胞が特定の形に進化した理由は、細胞が住んでいる複雑な環境を反映しなければならない複雑な問題です。細胞形状の進化と機能を理解するには、これらの形状を正確かつ正確に測定する必要があります。

すべてのタイプのセルは、特定の機能の形状を調節します。例えば、ニューロンは血液細胞とは異なる形状であり、異なる機能を有する。同様に、細菌細胞は様々な形状と大きさで来るが、これらの形状の目的は必ずしも1、2を知っているわけではない。従って、細菌細胞の形状を正確に決定することが重要である。概説された方法は、ほとんどの生きているまたは固定された細菌細胞の3D分析に適したデータを収集する簡単に実装された方法を示しています。
説明した方法により、サンプルの3D細胞形状を正確に表現し、これらの形状内のタンパク質を正確に局在させるために、細菌細胞の3D画像を採取することができます。従来の顕微鏡技術は2D画像を撮影し、大腸菌の変異体やビブリオコレラやヘリコバクターなどの湾曲した細菌など、異常または非対称的な形状を持つ細胞を研究する際に問題となるピロリ.高解像度の 3D イメージがこのメソッドへの重要な入力ですが、このメソッドは解像度が強化されたイメージを返しません。むしろ、この方法は、アクティブ輪郭と顕微鏡3の見かけ上のぼかし関数を用いた前方畳み込みアルゴリズムを用いて、細胞の3D表面座標と形状を再構築する(図1)。大腸菌4、5、6、7、V.コレラ8の新規会陰性元素CrvA、および述剤における細菌アクチンホモログムレBの研究に使用されているヘリコバクター・ピロリ9におけるバトフィリンCcmA (図2)。
タンパク質の局在化は、その機能に関する洞察を与えることができます。例えば、細胞分裂に関与するタンパク質は、通常、中間セル10、11に局在する。高スループットの研究は、その機能12への洞察を得ることを期待して、細菌のすべてのタンパク質を局在化するために行われています。残念ながら、これらの研究は2Dイメージングと1Dまたは2D分析で行われ、細胞幾何学的特徴への局在化など、タンパク質の局在化の特定の側面を測定することは不可能でした。
例えば、MreBは、多くの細菌のロッド形状に必要な動的タンパク質であり、細胞壁合成の局在化を指示することによって機能すると仮定され、その局在化は細胞壁合成7、13の局在化を反映する。複数の種からのMreBは幾何学的濃縮を示す4,6,7,14,15.MreBなどの動的表面ポリマーは、表面の幾何学的形状を時間平均濃縮プロファイル16と結合させることができ、膜17への結合に関連するエネルギーを最小化することによって特定の形状に向けることができるかもしれない。MreB ではねじれ、バンドル、曲げ、ダイナミクスの重要性は完全には解決されていませんが、サーフェスの両方の主曲率を正確に測定するには、セルの完全な 3D 表現が必要であることに注意してください。したがって、タンパク質が局在する曲率を最も正確に測定するには、2Dイメージングではなく3Dを使用することが優先されます。3Dイメージングは、2Dでは測定できない曲率を計算的に推定する必要がなくなり、非対称セル18では正確ではないかもしれない推定値である。
細胞の2Dイメージングはより高速であり、多くの後像化計算作業を必要としませんが、3Dイメージングは、細胞のより正確な表現だけでなく、2Dで測定できない曲率などの表面特徴を測定する機能を提供します。そのため、3Dイメージングの普及に伴い、細胞形状やタンパク質の局在化に関する新たな知見が可能になります。

<table><tbody><tr><td>50 nm蛍光ビーズ</td><td>Invitrogen</td><td>F8795</td><td>これらは、顕微鏡のぼやけ機能を測定するために使用されます</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>綿棒</td><td>ピューリタンメディカルプロダクツカンパニーLLC</td><td>S304659</td><td>VaLaP</td></tr><tr><td>カバースリップVWR</td><td></td><td>16004-302</td><td></td></tr><tr><td>フィ</td><td>ジーImageJ</td><td>https://fiji.sc</td><td>細胞のクロップに使用</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>LST3166</td><td>膜染料 細胞の染色に使用</td></tr><tr><td>ホイヘンス ソフトウェア</td><td>サイエンティフィック ボリューム イメージング</td><td>ホイヘンス エッセンシャルまたはプロフェッショナル</td><td>顕微鏡のぼやけた機能を測定するために使用</td></tr><tr><td>ラノリン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>L7387</td><td>パラフィンとワセリンを組み合わせて VaLaP</td></tr><tr><td>LB 成長培地</td><td>BD Difco</td><td></td><td></td>DF0446173</tr><tr><td>M63 中</td><td>US 生物学的</td><td>M1015</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>フォワードコンボリューションスクリプトの実行に必要</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャー</td><td>12-550-133</td><td></td></tr><tr><td>NIS エレメント</td><td>Nkon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラフィン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>327212</td><td></td></tr><tr><td>ワセリン</td><td>同等</td><td>49035-038-27</td><td></td></tr><tr><td>ピエゾZステージ</td><td>ニコン</td><td>77011589</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ -p200</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0730</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ - p10</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3730</td><td></td></tr></tbody></table>

正確な細胞表現と正確なタンパク質局在化のための細菌細胞の三次元イメージング

Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

細菌の形は生理学にとって重要である。細胞運動性、沈殿、バイオフィルム産生などの細胞生理学の多くの側面は、細胞形状の影響を受ける可能性があります。細菌細胞は3次元(3D)物体であるが、そのように扱われることはめったにない。ほとんどの顕微鏡技術は、実際の3D細胞形状およびタンパク質の局在化に関するデータの損失につながる2次元(2D)画像をもたらす。ガウス曲率(2 つの主曲率の積)などの特定の形状パラメータは、2D イメージが両方の主曲率を測定しないため、3D でのみ測定できます。さらに、湾曲した細胞の取り付けおよび2Dイメージング時にすべての細胞が平らに横たわっているわけではないが、これらの細胞の形状を正確に表さない場合がある。3Dでタンパク質の局在化を正確に測定することは、タンパク質の空間的調節と機能を決定するのに役立ちます。顕微鏡のぼかし機能を利用して3D細胞形状を再構築し、タンパク質を正確に局在させる前方畳み込み技術が開発されました。ここで、3Dにおける細菌の生細胞イメージングのためのサンプルを調製および取り付けするためのプロトコルについて、正確な細胞形状を再構築し、タンパク質を局在化させる。この方法は、簡単なサンプル調製、蛍光画像取得、MATLABベースの画像処理に基づいています。多くの高品質の蛍光顕微鏡は、これらの測定を取るために単純に変更することができます。これらのセルの再構築は計算負荷が高く、必要ありませんが、高スループットの計算リソースへのアクセスをお勧めします。この方法は、複数の細菌種および変異体、蛍光イメージングモダリティ、および顕微鏡メーカーに正常に適用されています。

細菌は、自然界の機能を決定する可能性のある形状やサイズの多種多様で来る1.この手順の結果は、画像の Z スタックの前方畳み込みからのセルの正確な 3D 表現です (図 1)。この方法は、曲がった細胞(図2)を扱う場合、または異常な形状の細胞(図4A)を扱う場合に特に重要であり、2D表現は細胞の曲率を正確に反映していない。前方畳み込み法(図1A)を使用するには、細胞が末梢染色されるか、または細胞質染色を有する必要がある(図2B左対右)。
図 4は、セル内の MreB ローカリゼーションを示しています。GFP融合は、野生型および変異型大腸菌細胞4の両方におけるその正確な局在を研究するために、細菌アクチンタンパク質MreB21に対して行われた。MreBは膜に関連しているため、細胞内での位置を忠実に再現するために3Dイメージングが必要です。これらの測定を3Dで行うことで、野生型細胞とrodZ変異細胞の形状を再構築することができました(図4A)。MreBの局在化は、小さなガウス曲率(3Dでしか測定できない幾何学的特徴)で、RodZ依存的に濃縮されることを示した(図4B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60350/60350fig1.jpg"> 図1:前方畳み込み法は、細胞形状の予備知識を持たない細胞を再構成する。(A)この方法の最終出力は、顕微鏡の較正されたぼかし関数と試験形状を比較することによって導出される3D細胞再構成である。これは、観測された3D画像が仮説と一致するまで、観測されたZスタックと比較される。ここに示すイメージは、1 つのC. クレセントラスセルの再構成のレンダリングです。(B) 再構成パイプラインは、観測された画像スタックに基づいてサーフェス要素の推定位置を繰り出して更新します。メソッドの完全なアルゴリズムの詳細については、グエン3を参照してください。(C) 再構築パイプラインは、セルの形状に関する事前の知識を持たない状態で開始し、観測された Z スタックに一致するようにサーフェス頂点の位置と数を更新します。3D再構成中の30ステップ毎の代表的な画像は、V.コレラ細胞の3つの異なる角度から示されています。このシェイプのサーフェス位置が更新され、シミュレートされたスタックと観測されたスタックの差が最小限に抑えられます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60350/60350fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60350/60350fig2.jpg"> 図2:3つの異なる形状細菌種の代表的な3D再構成。三次元再構成は、膜染色された細胞(左)または細胞質蛍光色素(右)で満たされた細胞から作ることができる。開始セルの形状および曲率は重要ではなく、曲がった棒、ねじれた棒、またはまっすぐな棒が全て正確に再構成することができるので。再構築されたサーフェスは、サーフェスのローカルガウス曲率に基づいて色分けされます。スケール バー = 1 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60350/60350fig2large.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60350/60350fig3a.jpg"> 図 3: 再構築が失敗する理由は複数ある場合があります。再構成アルゴリズムが妥当な結果に収束するように、セルをスクリーニングする必要があります。左=代表的な野生型(上)とrodZ変異型(下)品質管理に合格した大腸菌細胞。右 = 適切な再構築に失敗し、品質管理に合格しなかったセル。失敗した収束の5つのクラスが示されている:(i)トリミング領域の端に近すぎて鋭い境界に近すぎる細胞、(ii)別のセルに近すぎる細胞、(iii)ディボットを産生した細胞、(iv)初期sを超えて進まない細胞ターティングポイント、および(v)他の未知のエラー。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60350/60350fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60350/60350fig4.jpg"> 図4:特定の細胞形状に対するタンパク質の局在を示す代表的なデータ。(A)ガウス曲率及びMreB蛍光強度を有する野生型及びrodZ大腸菌細胞の三次元再構成細胞を示す。スケールバー = 1 μm. (B) 野生型およびrodZ 大腸菌細胞からの MreB の濃縮プロット。値 &gt;1 は、セルの均一なカバレッジに対するこれらのセル領域からの MreB の枯渇を示します。シェーディング領域は、平均の平均ブートストラップ信頼区間±90%を示します。各ひずみの曲線は 3 次スムージング スプラインであり、p &gt; 5 x 10-3の極端な曲率の確率しきい値を使用して切り捨てられます。この図は(ブラットンら)から変更されています。4.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60350/60350fig4large.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。</a>

このプロトコルは、生きた3次元イメージングのための細菌サンプルを調製し、マウントする方法と、それらの画像から大腸菌の三次元形状を再構築する方法を説明します。

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...

細菌は非常に小さいので、人々はしばしば彼らが3次元の物体であることを忘れます。当社のプロトコルは、平らな細胞と湾曲した細胞の両方の形状の正確な再構築を可能にします。このプロトコルは、標準的な顕微鏡にわずかな変更を必要とし、MATLABスクリプトですぐに利用できます。実験を開始する前に、単一のガラス顕微鏡スライドの反対側の端に3つの20 x 20ミリメートルのカバースリップのそれぞれに2つのスタックを配置します。ピペット200マイクロリットルのアガロースパッド溶液をスライドに、即座にしっかりとカバースリップのスタックに2番目のスライドを置き、アガロースを平らにします。アガロースが室温で約1分間固化させた後、上のスライドから慎重にスライドし、200マイクロリットルピペットチップの大きな端を使用して、ゲルから直径5ミリメートルのパッドを切り取ります。すべてのパッドがピペットを得られた場合、大腸菌細胞培養は、細胞塊を破壊し、各パッドに1マイクロリットルのサブ培養を加える前に細胞が均質に分布していることを確認するために複数回培養した。サンプルを5〜10分間空気乾燥させた後、パッドにカバースリップを置く前に、液滴がパッドに完全に吸収されたことを確認します。次に、綿棒を使用してカバースリップの端の周りに適切なシーラントを優しく磨き、シーラントをカバースリップの上部から遠ざけるように注意してください。カバースリップを密封した直後にスライドを顕微鏡のステージに置き、5分間の熱平衡の後、顕微鏡のフォーカスホイールを使用して細胞の中央に焦点を合わせます。ND取得の下の関連する顕微鏡ソフトウェアで、Zスタックを取得するためにZボックスをチェックし、ホームボタンをクリックしてセルの中央を開始点として設定します。ステップサイズを0.1マイクロメートル、レンジを4マイクロメートルに設定し、ZデバイスがPiezoステージに設定されていることを確認します。セルの上下に十分なぼかしが存在し、セルが背景とほとんど区別できないようにすることが重要です。ラムダウィンドウの下の蛍光チャネルを、画像化される蛍光分子の設定に設定し、実験の順序がλに設定されていることを確認して、各カラーチャンネルで完全なZスタックを取得してから切り替えます。次に、[今すぐ実行] をクリックして、画像の取得を開始します。すべての画像が取得されると、適切な画像解析ソフトウェアプログラムでファイルを開きます。個々のセルの周囲にボックスを描画し、そのセルをチャネルごとに 1 回 2 回複製し、[ハイパースタックを複製] チェックボックスがオンになっていることを確認し、チャネルを 1 つまたは 2 つに変更します。両方のスタックが使用可能になったら、[イメージ]、[スタック]、[ツール]、および [連結] を選択して、イメージを結合します。タンパク質チャネルを最初に、形状チャネルを2番目に使用します。新しいイメージを TIFF ファイルとして保存した後、トリミングされたイメージとcell_shape_settings_triを含むデスクトップ上のフォルダ内にフォルダを作成します。shae-cellshape-public exampleData_triからの txt ファイル。cell_shape_settings_triを編集します。txt ファイルを使用して、目的の実験に適した設定を設定します。Cell_shape_detector3dConvTriFolder関数を実行し、フォルダーの場所に文字列を指定し、その後に開始するセルの数と実行するセルの数を指定します。セルが正しく再構築されたことを確認するには、ScreenFits を実行します。グラフィカル ユーザー インターフェイスが開いたら、フォルダーの選択 ボタンをクリックし、個々 のセルの再構成を視覚的にスクリーニングする再構築データ ファイルを含むフォルダーを選択します。不整形に見えるセル、または完全なカバレッジが不足しているセルの場合は、名前にフラグを付ける再構築の横にあるボックスを選択し、下流の分析から除外できるようにします。富化スモーシングスプラインを実行して、表面におけるガウス曲率の関数として目的のタンパク質の相対的な濃度の濃縮プロファイルを作成します。次に、作成した TRI を使用して各フォルダを選択します。をクリックし、新しく作成したカーブ マット ファイルを選択します。この方法は、2D表現として曲線または異常な形状の細胞を扱う場合に特に有用であり、細胞の曲率を正確に反映することができない。本実験では、細菌性アクチンタンパク質MreBに対する緑色蛍光融合タンパク質を生成し、野生型および変異型の両方の大腸菌細胞におけるアクチンタンパク質の正確な局在化を研究した。これらの測定を3Dキャプチャ画像で行うことで、野生型とrodZ変異型細胞の両方の形状を再構築することができました。MreBの局在化は、rodZに依存する方法で3Dでしか測定できない幾何学的特徴である小さなガウス曲率で濃縮されると判断された。Z スタックの大きさが十分に大きいため、セルが上下にぼやけていて、セルが互いに十分に間隔を置くようにしてください。3Dでタンパク質の幾何学的局在を測定する方法を示していますが、タグタンパク質アセンブリのサイズなど、このデータから他の情報を計算することができます。

three-dimensional-imaging-bacterial-cells-for-accurate-cellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Bratton, B. P., 他、『 細菌細胞の三次元イメージングによる正確な細胞表象とタンパク質局在化のための研究』。 J. Vis. Exp.

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我々は、細菌のFtsZ-リングの構造、組織、細胞分裂に不可欠な装置を検査する、超解像イメージング法を説明します。この方法は、光活​​性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）画像の定量分析に基づいており、他の細菌の細胞骨格タンパク質に適用することができます。...

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正確な細胞表現と正確なタンパク質局在化のための細菌細胞の三次元イメージング

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