Name: 鉄制限性抗酸菌による細胞外小胞の単離と特徴付け (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学ぼう、Mycobacterium tuberculosisを低鉄条件下で培養し、細胞外小胞を単離・精製する方法。密度勾配遠心による精製と生化学的解析のプロトコルを解説し、抗酸菌の病原因子研究に活用できます。

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我々は、ナノ粒子追跡分析を行うための抗MEV抗セラとナヴニート・ドグラを共有してくれたラファエル・プラドス=ロサレスに感謝しています。

1. 鉄枯渇定義媒体の調製
<ol><li>KH2PO4の5g、L-アスパラギン5g、グリセロール20mL、脱イオン水2gをプラスチック容器に900mLで溶解して1Lの最小培地(MM)を調製する。鉄の汚染を防ぐためにガラスを避けてください。pHを5 N NaOHで6.8に調整し、体積を水で1Lに調整します。</li>
	<li>50gの金属キレート樹脂(MCR)を加え、磁気攪拌バーを4°Cで24時間軽く攪拌します。プラスチック受信機で0.22μmフィルターユニットを通してろ過することにより、MCRを殺菌し、取り外します。ろ過を加速し、フィルターの詰まりを防ぐために、濾過前に約30分間樹脂堆積物を入れましょう。 注:この培地は、原子吸光分析法により決定される2μM未満の残留鉄を含む。</li>
	<li>サプリメント MM の ZnCl2,MgSO4の 40 mg/L , MnSO4の 0.1 mg/L .別途、脱イオン水中の各金属サプリメントの濃縮株(1,000x)を調製し、MM補充前に濾過により殺菌する。鉄枯渇、金属補充MMは、ここで低鉄MM(LIMM)と呼ばれる。</li>
	<li>10 mM HClに溶解したFeCl3の50 mMストックから、LIMMの1L(50μM最終濃度)に1mLを加えて、高鉄MM(HIMM)を調製します。</li>
</ol>2. 鉄制限条件下での菌菌の増殖
<ol><li>Mtbの凍結した15%グリセロールストックの50μLを解凍し、10%ADNエンリッチメント(5g/Lアルブミン、2g/Lデキストロース、および0.85 g/L塩化ナトリウム、0.2%グリセロールおよび0.05%Tween-80)10を補った寒天プレートをストリーク。コロニーが見えるまで37°Cでプレートをインキュベートします。</li>
	<li>ADN濃縮を補足したマイコバクテリアブロス培地(材料表)の2mL中のMtb10の単一コロニーを接種する。37°Cで攪拌を伴うインキュベート。</li>
	<li>Mtb培養物を後期対数期(OD540は~0.8)まで成長させる。これを確認するには、分光光度計を用いてOD540を測定する。</li>
	<li>0.2%グリセロール、0.05%トゥイーン-80、およびADNを補充したマイコバクテリア寒天プレート(材料表)に後期対数培養物の200μLを広げます。少なくとも5枚のプレートを接種する。細菌の増殖がコンフルエント層として見えるまで、プレートを37°Cでインキュベートします。Mtbの場合、この処理には約 1 週間かかります。</li>
	<li>LIMMで無菌綿棒を濡らします。この綿棒を使用して寒天プレートから細菌を収集し、LIMMの100 mLを接種し、約1.0のOD540で濃縮細菌懸濁液を調製します。</li>
	<li>この懸濁液をLIMMで1Lに10回希釈し、2本の2L滅菌ペットボトルに分け、それぞれ500mLの培養物を含む。</li>
	<li>2 mL の培養物を取り出し、5 mL 培養管に移します。10%vol/volタイロキサポリの10°Lを加えます。</li>
	<li>培養物を37°Cで14日間培養する。</li>
</ol>3. MEVのコレクション
<ol><li>採取時の2mL培養物のOD540を測定する。ADNと0.05%Tween-80で寒天プレート上の各希釈の培養およびプレート100°Lの1:10シリアル希釈を行います。</li>
	<li>培養物を5本の225mL円錐円管に移し、遠心分離機を2,850 x gで20°Cで7分間移動します。</li>
	<li>50 mLピペットで培養上清を収集し、0.22μmフィルターユニットを通して殺菌します。</li>
</ol>4. MEVの分離
<ol><li>4°Cに入れた攪拌セル限外濾過システムに濾液を移し、100kDaカットオフ膜を通して<50 psiの濃縮物を〜50mLに濾過します。</li>
	<li>濃縮培養物を15,000xgで4°Cで15分間遠心分離し、上清を回収する。 </li>
	<li>ポリカーボネート超遠心分離管中の培養濾液を100,000 x gで4°Cで2時間分遠心分離する。</li>
	<li>穏やかなピペットによって無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の合計1 mLで膜状ペレットを再スレド。</li>
	<li>ステップ4.4で得られたペレット懸濁液の0.5 mLを60%のジオオキサノール溶液の1.5 mLで混合し、最終的なイオジキサノール濃度45%重量/vol.を生み出し、この混合物を13mm x 51mmポリプロピレン薄壁の薄い層状の超セントリフュージチューブの底部に塗布する。</li>
	<li>MEV-iodixanol 45%懸濁液を1mL40%、35%、30%、25%、20%(PBSのvol/vol)と1mLのPBSを上部に重ね合えます。</li>
	<li>4 °Cで18時間のための100,000 x gで遠心分離機。</li>
	<li>1 mL ハミルトンシリンジを使用して、上から始まる 1 mL 密度勾配分を収集します。</li>
	<li>収集した各画分をPBSで20mLに希釈し、遠心分離機を100,000 x gで4°Cで2時間希釈します。</li>
	<li>上清を取り外し、0.5 mLのPBSでペレットをサスペンドします。このペレットは4°Cで保管してください。</li>
</ol>5. MEVの定量化
<ol><li>ブラッドフォードアッセイ(材料表)によって各画分のタンパク質濃度を測定します。</li>
	<li>
膜脂質分析を実行します。
	<ol>
<li>蛍光膜プローブ1-(4-トリメチルアンモニウムフェニル)-6-フェニル-1,3,3,5-ヘキサトリエンp-トルエンスルホン酸塩(TMA-DPH)を用いて各勾画の10μLを96ウェルブラックのPBSの最終濃度1μg/mLでインキュベートするプレート。</li>
		<li>プレートを33°Cで20分間インキュベートします。</li>
		<li>360 nm励起および430 nmの放出で蛍光を測定する。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. MEVの定性分析
<ol><li>
タンパク質電気泳動を行う。
	<ol>
<li>16 μLの MEV サンプルを 16 μL に混合し、5x サンプルローディング バッファー (10% w/v SDS、10 mM ジチオトライトール、20% v/v グリセロール 0.2 M Tris-HCl、pH 6.8 0.05% w/v ブロモフェノール ブルー) を 5 5 5 m でサンプルバッファーで加熱します。</li>
		<li>10%トリス/グリシンSDS-ポリアクリルアミドゲル11にロードし、青色染料前面がゲルの底部に達するまで、ランニングバッファ(25 mMトリスベース、190 mMグリシン、0.1%SDS)で10V/cmで実行します。</li>
		<li>超高感度タンパク質染色液でゲルを染色します (材料表)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ドットブロットを実行します。
	<ol>
<li>約0.5μg/μLの濃度を持つMEVサスペンションの2μLをロードし、ニトロセルロース膜上に2倍のシリアル希釈をロードし、メーカーの指示に従ってドットブロットのプロセスを行います。</li>
		<li>一次抗体として1:5,000の希釈でMEVの調製に対してマウスで上げられた抗血清を使用し、二次抗体として1:10,000希釈でホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)に結合したヤギ抗マウスを使用する。適切なHRP基板ブロッティング検出試薬とイメージングシステムを用いて抗原抗体複合体を検出します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
負の染色と電子顕微鏡を行います。
	<ol>
<li>250 μLのMEVを0.1 Mカコダイレートで0.1 Mカコダイレートで2%のカコダイレートで2時間固定し、4%ホルムアルデヒド、1%グルタルアルデヒド、0.1%PBSで一晩インキュベートします。</li>
		<li>固定サンプルを2%の四酸化オスミウムで90分間染色します。</li>
		<li>試料をエタノールで連続的に脱水し、スパーのエポキシ樹脂に埋め込みます。</li>
		<li>透過型電子顕微鏡でMEVを観察します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).</li>
<li>Gupta, S., Rodriguez, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+extracellular+vesicles+and+host+pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions.</a> Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).</li>
<li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Membrane+Vesicles+Mediate+the+Release+of+Mycobacterium+tuberculosis+Lipoglycans+and+Lipoproteins+from+Infected+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages.</a> Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).</li>
<li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).</li>
<li>Rath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+vesiculogenesis+and+immunomodulation+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).</li>
<li>White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Pst%2FSenX3-RegX3+Regulates+Membrane+Vesicle+Production+Independently+of+ESX-5+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity.</a> mBio. 9, pii 00778(2018).</li>
<li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes%3A+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731(2017).</li>
<li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+Mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquistion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion.</a> Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).</li>
<li>Sanders, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+Laboratory+Techniques%3A+Plating+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> Journal of Visualized Experiments. 63, e3064(2012).</li>
<li>Harlow, E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Antibodies.+A+laboratory+manual%22">Antibodies. A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1988).</li>
<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).</li>
</ol>

著者は利害の対立を持っていない。

真核細胞由来エキソソームを精製する複数の方法が開発された12.対照的に、細菌由来EV7を精製するための有効な方法に関する情報は限られています。Mtb由来のEVの効率的な分離は、この病原性マイコバクテリウムの成長における本質的な困難を考慮する必要があります。Mtbは長い分割時間(〜24時間)を有し、バイオセーフティレベル3(BSL-3)条件で扱われるべきである。したがって、MEV分離方法の効率を最適化することが重要である。マイコバクテリアは、粗MEV製剤を凝集して容易に汚染する糖脂質やその他の疎水性分子を培地に放出するので、生化学的および機能的研究を行う前にMEVを精製し、検証することが重要です。Mtbが鉄制限の条件下でMEVの放出を強化することを実証した以前の観測に基づいて、鉄制限された抗酸菌からのEV精製のためのプロトコルが確立されました。また、非毒性M.スメグマティスも低鉄条件に応答してEVの放出を増加させることも確認されている(データは示されていない)。したがって、BSL-2条件でこの細菌からEVを浄化するために同じプ...

マイコバクテリア細胞外小胞(MEV)は、膜結合ナノ粒子であり、60−300nmの大きさで、速く成長する抗酸菌1によって自然に放出される。病原性マイコバクテリアによって放出されるMEVは、免疫学的に活性なタンパク質、脂質、および糖脂質を介して宿主と相互作用するメカニズムを構成し、濃縮および保護された方法で分泌される2、3、4である。MEVを特徴付け、その生体発生と機能を理解するためには、小胞の浄化と検証の厳格かつ効率的な方法が不可欠です。これまで、MEVは鉄分が豊富な培地1、5、6、7、8で増殖したマイコバクテリアの培養濾液から単離されてきた。
しかし、以前の研究は、鉄の制限がMtbの小胞放出を大きく刺激することを実証し、おそらくMEV9で分泌されるシデラクチを介して鉄を捕捉する。高鉄培地で培養したMtbからMEVを分離する手順は説明されているが、低鉄培養物からMEVを得るための効率的な方法論は報告されていない。したがって、この方法の目的は、低鉄培養物から得られたMEVを単離、精製、定量し、生化学的および機能的アッセイやマイコバクテリアにおける小胞産生の遺伝的決定要因の分析に使用することです。

<table><tbody><tr><td>アミコン攪拌セル モデル108</td><td>EMD ミリポア</td><td>UFSC40001</td><td>細胞限外ろ過システム</td></tr><tr><td>BD ポリプロピレン 225 mL コニカルチューブ</td><td>フィッシャー</td><td>05-538-61</td><td>コニカル遠心チューブ</td></tr><tr><td>バイオマックス 100 kDa カットオフ限外ろ過膜</td><td>EMD ミリポア</td><td>PBHK07610</td><td>限外ろ過膜</td></tr><tr><td>Chelex-100 樹脂</td><td>バイオ・ラッド</td><td>142-2842</td><td>金属キレート樹脂</td></tr><tr><td>ミドルブルック 7H10 寒天</td><td>BD Difco</td><td>262710</td><td>マイコバクテリア寒天プレート</td></tr><tr><td>ミドルブルック 7H9 ブロス</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td>マイコバクテリアブロス ミディアム</td></tr><tr><td>ニトロセルロースブロッティングメンブレン</td><td>GE ヘルスケア</td><td>10600001</td><td>ブロッティングメンブレン</td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>ヨウオジキサノール</td></tr><tr><td>ポリカーボネート超遠心分離チューブ 25 mm x 89 mm</td><td>ベックマン・コールター</td><td>355618</td><td>ポリカーボネート超遠心分離チューブ 25 mm x 89 mm</td></tr><tr><td>ポリプロピレン薄肉遠心チューブ 13 mm x 15 mm</td><td>ベックマン・コールター</td><td>344059</td><td>ポリプロピレン薄肉遠心チューブ 13 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>タンパク質アッセイ色素</td><td>BioRad</td><td>5000006</td><td>Bradford タンパク質染色</td></tr><tr><td>SYPRO ルビー</td><td>分子プローブ</td><td>S12000</td><td>超高感度蛋白質の汚れ</td></tr><tr><td>TMA-DPH</td><td>の分子調査</td><td>T204</td><td>1-(4-トリメチルアンモニウムフェニル)-6-フェニル-1,3,5-ヘキサトリエンp-トルエンスルホン酸塩</td></tr><tr><td>真空ろ過フラスコ</td><td>CellPro</td><td>V50022</td><td>フィルターユニット</td></tr></tbody></table>

鉄制限性抗酸菌による細胞外小胞の単離と特徴付け

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

ヒト結核の原因物質である結核菌(Mtb)を含む抗酸菌は、免疫学的に活性な分子を含む細胞外小胞(EV)を自然放出する。小胞生体形成の分子機構、小胞の含有量、および病原体宿主界面におけるその機能に関する知識は非常に限られている。これらの質問に対処するには、EVの分離、精製、検証のための厳格な手順が必要です。以前は、結核が鉄制限にさらされたとき、小胞産生が増強され、宿主環境でMtbが遭遇した状態であることが判明した。ここでは、鉄欠乏性抗酸菌からEVを分離および精製するための完全で詳細なプロトコルです。定量的および定性的な方法が適用され、精製された EV が検証されます。

MEVは密度勾配の差動沈下により精製した(図1、図2)。記載された条件下で、MEVは主に勾配画分3(F3)で分離され、25%のジオオキサンに相当する。この結論は、タンパク質、膜脂質、無傷MEVの顕微鏡的可視化、ナノ粒子サイズ分布、および抗小胞抗血清による陽性反応性の検出に基づいている(図2、図3)。コロニー形成単位に正規化されたタンパク質および脂質濃度(CfUs)は、高鉄条件に対する低鉄におけるMEV収率の約8倍の増加を示した(図3)。1つの代表的な実験の結果が提示されますが、これはMEVの複数の(&gt;10)分離に基づいて非常に再現可能な結果です。この方法により1Lの低鉄培養物から得られた純粋なMEV収率は約500μgのタンパク質であった。
<...

結核菌は、低鉄条件に応答して細胞外小胞の産生および放出の増加を示す。本研究では、鉄欠乏症に反応して放出されるマイコバクテリア細胞外小胞の精製および特性評価のための低鉄条件および特性評価のための方法を生成するためのプロトコルを詳しく説明する。

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

この方法は、厳格な低鉄条件下で結核菌を培養し、低鉄培養液から小胞膜を浄化することを可能にする。鉄の制限は膜小胞の産生を刺激することが知られているので、このプロトコルは、さらに生化学的または機能的なアッセイに利用することができる純粋な膜小胞の高い豊富さを生み出す。我々は、マイコバクテリウムスメグマティス、非毒性株を使用してプロトコルを実証する場合、このプロトコルは、結核菌、悪質株を使用してBSL-2施設に従うことができます。まず、5グラムのリン酸モノカリウム、5グラムのL-アスパラギン、20ミリリットルのグリセロール、900ミリリットルの脱イオン水に2グラムのデキストロースをプラスチック容器に溶解させることで、最小限の培地を1リットル用意します。5つの通常の水酸化ナトリウムでpHを6.8に調整し、脱イオン水で1リットルに音量を調整します。その後、50グラムの金属キレート樹脂を加え、摂氏4度で24時間磁気攪拌棒を使用して穏やかに攪拌します。翌日、撹拌を停止し、樹脂を約30分間沈下します。プラスチック製のレシーバで22ミクロンのフィルターユニットを濾過して、残りの樹脂を溶液から殺菌して除去します。今, サプリメントの最小培地を含む 0.5 塩化亜鉛のリットル当たりミリグラム, 40 硫酸マグネシウムのリットル当たり 40 ミリグラム, マンガン硫酸のリットルあたり 0.1 ミリグラム.ADN濃縮を加えたマイコバクテリアブロス培地の2ミリリットルでMTBの単一コロニーを接種する。摂氏37度で撹拌してインキュベートする。目に見える成長がある場合、培養液を2ミリリットル抽出し、分光光度計上でOD 540を測定する。OD 540が、対数後期相を示す0.8に達したときにインキュベーションを停止します。0.2グリセロール、0.5%Tween 80、およびADNを加えたマイコバクテリア寒天プレートに対数後期培養200マイクロリットルを広げます。少なくとも5枚のプレートを接種する。プレートを摂氏37度でインキュベートします。そして1週間後、細菌の増殖はコンフルエント層として見える。その後、低鉄の最小限の媒体で滅菌綿棒を湿まします。寒天プレートから細菌を収集するために、この綿棒を使用してください。チューブ内の低鉄最小培地の100ミリリットルで細菌を接種します。1のOD 540で懸濁液を調製するのに十分な細菌を集める。低鉄の最低媒体で懸濁液を10倍から1リットルに希釈し、2つの無菌ペットボトルに分けます。次に、培養物2ミリリットルを5ミリリットル培養管に移す。ボリュームタイロキサポールで10%の体積の10マイクロリットルを追加します。14日間摂氏37度で培養します。20°Cで7分間2,850回gで5つの225ミリリットル円錐形遠心分離管と遠心分離機に培養を移します。50ミリリットルのピペットで培養上清を収集し、0.22ミクロンのフィルターを通してそれを殺菌するフィルター。MEVを分離するには、培養液を摂氏4度に置かれた攪拌細胞限外濾過システムに移し、100キロダルトンカットオフ膜を通して50未満のPSIの圧力で濃縮物を濾過する。次に、濃縮培養液を摂氏4度で15分間15分間濾液し、ポリカーボネート超遠心チューブに上清を集める。上清を摂氏4度で2時間100,000倍に遠心する。その後、上清を取り除き、穏やかなピペット処理によって滅菌PBSの合計1ミリリットルで膜状ペレットを再懸濁する。ポリプロピレン薄壁の超遠心チューブの底に60%iodiキサノール溶液の1.5ミリリットルとペレット懸濁液の0.5ミリリットルを混合します。このMVEイオディアノール45%懸濁液を40%35%30%25%と20%のiodiキサノール溶液と1ミリリットルのPBSを上部に重ね合わせてください。摂氏4度で18時間100,000倍gの遠心分離機。次に、1ミリリットルのハミルトンシリンジを使用して、上から始まる1ミリリットル密度の勾配分を収集する。各収集した分率をPBSと遠心分離機で20ミリリットルに希釈し、100,000倍gで摂氏4度で2時間希釈します。上清を取り除き、PBSの0.5ミリリットルで再懸濁します。チューブは摂氏4度で保管してください。膜脂質分析を行うために、各勾配分率の10マイクロリットルを蛍光膜プローブTMA-DPHと組み合わせ、96ウェルブラックプレートの各ウェルにPBSの50マイクロリットルで1ミリリットル当たり1マイクログラムの最終濃度で結合します。プレートを摂氏33度で20分間インキュベートします。励起用360ナノメートル、発光用430ナノメートルで蛍光を測定します。このプロトコルでは、MEVは、密度勾配における微分沈下によって精製された。記載の条件下で、MEVは、25%iodiキサノールに対応する勾配画分3で大部分分離された。ベシクル関連タンパク質は、ドットブロット分析で示した画分3に濃縮した。また、分画3およびナノ粒子分析でMEVの存在を確認した陰性染色は、MEVのサイズが約100ナノメートルであることを示した。コロニー形成単位に正規化されたタンパク質および脂質濃度は、鉄条件の高さに対して低鉄でのMEV収量の約8倍の増加を示した。ドットブロット分析は、鉄の十分なMTB培養よりも鉄限定MTB培養からの密度勾配画分におけるMEV関連マーカーからのより強いシグナルを示した。鉄の限られた条件を保証し、リポタンパク質凝集体と膜小胞の汚染を防ぐために、最小限の媒体の調製のための指示に従ってください。この方法で精製されたマイコバクテリア膜小胞は、生化学的特性評価および機能解析に使用することができる。

isolation-characterization-extracellular-vesicles-produced-iron

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Gupta、S.、 et al。鉄制限性抗酸菌により産生される細胞外小胞の単離と特性化 J. Vis. 経験。 (2019年)このビデオでは、結 核菌...

鉄制限条件下での結核菌の培養

出典: Gupta、S.、Marcela Rodriguez、G.鉄限定抗酸菌によって産生される細胞外小胞の単離と特性評価。 J. Vis. 経験。 (2019年)このビデオは、宿主環境を模倣した鉄制限条件下で培養された 結核菌 からの細胞外小胞(EV)の段階的な単離を示しています。EV...

結核菌からのシデロフォア含有細胞外小胞の単離

出典: ワトソン、DC、 et.al。大腸菌と他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離と精製 J. Vis. 経験。 (2021年)このビデオは、遺伝子組み換え細菌の外膜に由来する細胞外小胞(EV)の単離と濃縮を示しています。このプロセスには、細菌を培養して EV...

細菌からの外膜由来細胞外小胞の単離と濃縮

このビデオでは、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)に基づいて、脳の免疫細胞であるミクログリアに由来する細胞外小胞またはEVを分離する方法について説明しています。EVは、免疫応答を調節するメディエーターを送達する分子貨物として機能します。したがって、単離されたEVは、ニューロン免疫応答中のミクログリア-ニューロンクロストークを研究するためのin...

SEC法によるミクログリア由来の細胞外小胞の単離:ミクログリア馴化培養培地から細胞外小胞を単離する技術

このビデオでは、結核菌(Mtb)の培養濾液から細菌の細胞外小胞(EV)を精製するためのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)技術を示しています。この手法では、多孔質樹脂充填カラムを使用して、EVの精製画分を取得します。多孔質粒子は、より小さなタンパク質が細孔に侵入するのを選択的に許可し、溶出を遅らせます。同時に、EVはサイズが大きいため、毛穴に入るのが排除され、最初に溶出されます。...

マイコバクテリア細胞外小胞を精製するためのサイズ排除クロマトグラフィー技術

血液中に存在する細胞外小胞は、さまざまな疾患の新規バイオマーカーとして提案されています。ここでは、末梢血サンプルから大きな原形質膜由来の微小胞を単離し、その後の従来のフローサイトメトリーとウェスタンブロッティングによる分析のためのプロトコルを紹介します。...

末梢血からの微小胞の単離とキャラクタリゼーション

本プロトコールは、シアノバクテリア培養物からの細胞外小胞の単離、濃縮、および特性評価に関する詳細な説明を提供する。異なるスケールの培養物から小胞を精製するためのアプローチ、方法論間のトレードオフ、およびフィールドサンプルを扱うための考慮事項についても議論する。...

シアノバクテリア細胞外小胞の単離と特性評価

このプロトコールは、サイズ排除クロマトグラフィー、培養上清から 結核菌 群細胞外小胞を富化するための容易で再現性のある技術を記載する。...

結核 菌サイズ排除クロマトグラフィーによる細胞外小胞濃縮

提案されたプロトコルには、細胞培養上清から細胞外小胞を単離する際にエンドトキシンによる汚染を回避する方法と、それらを適切に評価する方法に関するガイドラインが含まれています。...

がん細胞株由来の低エンドトキシン含量細胞外小胞の単離

このプロトコルでは、マイコバクテリウム・スメグマティス(Msm)の軸種培養からの天然マイコバクテリア細胞外小胞(mEV)の濃縮と、mCherry(赤色蛍光レポーター)含有組換えMsmEVsの設計と濃縮方法について詳しく説明します。最後に、結核菌のEsxAタンパク質を含むMsmEVを濃縮することで、新しいアプローチを検証します。...

マイコバクテリアの天然および組換え細胞外小胞の濃縮

このプロトコルは、酵素的消化およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、マウスの骨格筋および骨髄から小さな細胞外小胞を分離し、構造的に複雑で収量の少ない組織から小胞富集部分を再現可能にして下流の分子解析を可能にします。...

サイズ排除クロマトグラフィーによるマウス骨格筋および骨髄からの小さな細胞外小胞の単離

学ぼう、Mycobacterium tuberculosisを低鉄条件下で培養し、細胞外小胞を単離・精製する方法。密度勾配遠心による精製と生化学的解析のプロトコルを解説し、抗酸菌の病原因子研究に活用できます。

鉄制限性抗酸菌による細胞外小胞の単離と特徴付け

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