Name: 患者由来膵管腺癌オルガノイドモデルの単離と特徴付け (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学ぶ患者由来膵管腺癌オルガノイドの単離と培養法。腫瘍異質性を反映する3次元モデルを構築し、薬剤応答解析や個別化医療への応用を可能にする実験手法を解説します。

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UCサンディエゴムーアズがんセンターバイオリポジトリと組織技術共有リソース、ローリー研究所のメンバー、および外科腫瘍学部門のUCサンディエゴ外科部門のサポートに感謝しています。AMLは、NIH CA155620、SU2C CRUKルストガルテン財団膵臓がんドリームチーム賞(SU2C-AACR-DT-20-16)、膵臓癌を治すための基金への寄付者によって寛大にサポートされています。

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</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

ここでは、患者由来PDACオルガノイドを分離、拡張、特徴付けするための現在のプロトコルを提示する。オルガノイド培養の確立に関する現在の成功率は70%を超えています。したがって、これらの方法はまだ完成されておらず、時間の経過とともに改善と進化が期待されています。PDACは腫瘍性細胞性が低いため、サンプルサイズに対して重要な考慮事項を考慮する必要があります。その結果、小さな標本は腫瘍細胞をほとんど含んでおらず、ほんの一握りのオルガノイドしか生成しません。さらに、多くの患者は、外科的介入15の前に化学療法および/または化学放射線ベースのネオアジュバント治療を受ける。治療が特定の患者に対して有効である場合、腫瘍組織は生存可能な細胞を欠いている可能性がある。これらの方法の初期最適化には化学ナイーブ患者サンプルの取得が好ましいが、これは必ずしも可能ではない。興味深いことに、腫瘍組織の外科的除去後の虚血時間は、サンプルが24時間以内に処理される限り、オルガノイド単離を成功させるための主要な基準ではないことがわかりました。
膵管腺癌は、強い脱形成反応...

膵管腺癌(PDAC)は、ほとんどの患者における後期診断、有効な治療法の欠如、および結果として10%1未満のままである低5年全体生存率を特徴とする致死性疾患である。患者のわずか20%が治癒外科的介入に適した局所疾患と診断される2、3.残りの患者は、典型的には、患者4、5の少数派に有効である化学療法剤の組み合わせで治療される。これらの差し迫った臨床ニーズに対応するために、研究者は早期発見戦略とより効果的な治療法の開発に積極的に取り組んでいます。重要な発見の臨床翻訳を加速するために、科学者は遺伝子操作されたマウスモデル、患者由来の異種移植片、単層細胞ライン、および、最近ではオルガノイドモデル6を採用している。
未変形前駆細胞の増殖を刺激する増殖因子およびWnt-リガンド豊富な条件を用いた三次元上皮オルガノイド培養は、まずマウス腸7について説明し、正常ヒト膵臓組織8に迅速に適応した。正常な乳管組織に加えて、オルガノイド方法論は、ヒトPDAC8の単離、膨張、および研究を可能にする。重要なことに、この方法は、外科検体からのオルガノイドの確立、ならびに細かいおよびコア針生検を支持し、研究者が疾患9、10のすべての段階を研究することを可能にする。興味深いことに、患者由来のオルガノイドは、よく記述された腫瘍転写サブタイプを要約し、精密医療プラットフォーム9、11の開発を可能にし得る。
PDACのための現在のオルガノイドプロトコルは、化学ナイーブ患者9からの患者サンプルの70%以上の正常な拡張を可能にする。ここでは、患者由来のPDACオルガノイドを単離、拡張、および特徴付けるために、当社の研究室で採用されている標準的な方法を提示します。他のPDACオルガノイド方法論は、12、13に記載されているが、これらの方法の比較は徹底的に行われていない。この技術は比較的新しく、急速に進歩しているので、これらのプロトコルは進化し続け、改善されることを期待しています。しかし、組織の取り扱いとオルガノイド培養の原理は引き続き有用であろう。

<table><tbody><tr><td>12チャンネルピペット(p20、p100、またはp200)チップ</td><td></td><td></td><td></td>付き</tr><tr><td>12ウェルプレート</td><td>オリンパス</td><td>25-106</td><td></td></tr><tr><td>15 ml LoBindコニカルチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>EP0030122208</td><td></td></tr><tr><td>15 mlチューブ ローテーターおよび/またはニューテーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 >C CO2インキュベーター37</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&deg;Cウォーターバス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>384ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>4588</td><td>超低アタッチメント、黒色、光学的にクリア</td></tr><tr><td>A 83-01</td><td>TOCRIS</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>ADV DMEM</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>アニマルフリー 組換えヒト EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>自動セルカウンター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27サプリメント</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>細胞回収溶液</td><td>コーニング</td><td>354253</td>試薬<td>は、基底膜抽出物を4°Cで解重合します。C</td></tr><tr><td>CellTiterGlow</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td>発光細胞生存試薬</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマ</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>コンピュータ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>StemCELL Tech</td><td>07930</td><td>細胞凍結液</td></tr><tr><td>Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells</td><td>Trevigen</td><td>3710-001-K</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>薬剤プリンター</td><td>Tecan</td><td>D300e</td><td>これは、私たちが研究室で使用する薬剤プリンターです</td></tr><tr><td>Excel</td><td>データ分析用</td>Excel <td></td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>G-418</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>ガストリンI.(ヒト)</td><td>TOCRIS</td><td>3006</td><td></td></tr><tr><td>ジェントルコラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼ</td><td>STEMCELL Tech</td><td>7919</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td> サー<td>モフィッシャー</td><td>35050061</td>グル<td>タミン溶液</td></tr><tr><td>GraphPad プリズム</td><td></td><td></td><td>データ解析用</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>層流組織培養フード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ルミノメーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Wnt-3A 発現細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>MACS 組織保存ソリューション</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-100-008</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル マトリックス</td><td>コーニング</td><td>356230</td><td>基底膜抽出物 (BME)、成長因子減少</td></tr><tr><td>氏 フロスティ 凍結容器</td><td>サーモフィッシャー</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>シグマ</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>シグマ</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>p1000 チップ</td><td></td><td></td><td></td>付き</tr><tr><td>ピペット p200 チップ</td><td></td><td></td><td></td>付きピペット</tr><tr><td>PBS</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ThermoFisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>急流フィルターユニット (0.2 & micro;m)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>121-0020</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ディスポーザブルメス、#10 ブレード</td><td>VWR</td><td>89176-380</td><td></td></tr><tr><td>組織培養遠心分離機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織培養ディッシュ 10 cm</td><td>オリンパス</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>TRIZol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td>酸フェノール溶液</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>ThermoFisher</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>ThermoFisher</td><td>R25001</td><td></td></tr></tbody></table>

患者由来膵管腺癌オルガノイドモデルの単離と特徴付け

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

膵管腺癌(PDAC)は、最も致死的な悪性腫瘍の一つである。近年、この疾患の3次元(3D)モデリングを可能にする次世代オルガノイド培養法が挙げられている。患者由来オルガノイド(PDO)モデルは、外科検体および小さな生検の両方から単離し、培養中に急速に形成することができる。重要なことに、オルガノイドモデルは、患者の腫瘍で検出された病原性遺伝子変化を保持し、患者の治療応答を予測するので、翻訳研究を可能にする。ここでは、3D、マトリックス埋め込み、オルガノイドモデルを研究するために組織培養ワークフローを適応するための包括的なプロトコルを提供します。原発性PDACオルガノイドの分離と伝播に関する方法と考慮事項について詳しく説明します。さらに、実験室でオルガノイドメディアがどのように調製され、品質を制御しているかを説明します。最後に、核酸(DNAおよびRNA)の単離、薬物検査などのオルガノイドモデルの下流特性評価のためのアッセイについて説明します。重要なことは、研究室でオルガノイド方法論を実装するための重要な考慮事項を提供することです。

PDACからのオルガノイドの分離に関連する課題を例示するために、小さな低細胞腫瘍サンプルから患者由来オルガノイド培養物の確立を示す。最初のめっき後、図1に示すように、ウェルごとに少数のオルガノイドしか見えなかった。オルガノイドは、2週間のスパンにわたって大きく成長させられ、より堅牢な文化を確立するために、我々のプロトコルに従って通過させられました(図1)。後期一次単離物で観察されたより大きな嚢胞性オルガノイドは、ステップ2.13で説明したように、氷冷BMEとオルガノイドの混合中に容易に小さな断片に分解されることに注意することが重要である。
ファーマコタイピングプロトコルの結果を実証するために、このプロトコルに記載されているように、確立され、急速に成長している代表的なPDACオルガノイドから単一細胞を調製した。1,000個の生存可能な細胞をウェル当たりにめっきし、細胞傷害性化学療法剤、ゲムシタビンおよびパクリタキセルがドーサドー化される前に24時間以上回収させた。1...

膵管腺癌の患者由来オルガノイド培養は、高忠実度で上皮腫瘍細胞コンパートメントを表す急速に確立された3次元モデルであり、この致死性悪性腫瘍に対する翻訳研究を可能にする。ここでは、オルガノイドを確立し、伝播する方法を詳細に提供するとともに、これらのモデルを用いて関連する生物学的アッセイを行う方法を提供する。

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

患者由来のオルガノイドモデルは、この疾患の遺伝的および表現型異質性を反映した膵臓癌を研究するための強力かつ迅速なツールであるため、この方法は重要である。この技術の主な利点は、オルガノイドは限られた量の癌から高い成功率で単離することができ、下流の分析のためにインビトロで急速に拡大することができるということです。細胞毒性薬に対するオルガノイドの反応を研究することは、腫瘍が治療に耐性になる理由を理解し、より効果的な治療戦略を定義するのに役立つかもしれません。この手順を開始するには、調製した12ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。無菌セルリフターを使用して、底面を削らないようにしながら、完全な媒体に浮遊するように、地下膜エキスドームをそっと持ち上げます。P1000ピペットを使用して、BMEドームとメディアを慎重に15ミリリットルの円錐チューブに移します。オルガノイド含有ウェルごとにこのステップを繰り返します。1ミリリットルの冷たい基底培地で収穫したウェルをそっと洗い、オルガノイドを含むチューブに移します。溶液とオルガノイドをP1000ピペットで十分に混合し、200倍gで5分間スピンダウンします。懸濁液中のオルガノイドとオルガノイドペレットを含むBMEの層がチューブの下部に現れます。上清を慎重に除去し、BMEとオルガノイド層の損失を避けてください。チューブを氷の上に置きます。チューブに氷冷細胞回収液の10ミリリットルを追加し、完全に反転によって混合.反転によって3分ごとに混合しながら、氷の上で30分間インキュベートします。この後、200回gで5分間遠心分離する。BME層がなくなっている間、オルガノイドペレットは明らかであるべきです。BME層のサイズは小さくても目に見える場合は、摂氏4度でさらに30分間インキュベートし、遠心分離を繰り返します。BMEを脱重化したら、オルガノイドペレットを残したまま細胞回収液を除去する。オルガノイドを10ミリリットルの基底培地で洗浄し、反転と混合します。200回gで5分間遠心分離機を取り出し、オルガノイドペレットを氷の上に5分間置きます。必要に応じて、単一の細胞製剤が望ましい場合、30マイクロリットルのDNAse I溶液を添加したトリプシンをオルガノイドに加える。この酵素反応を摂氏37度でインキュベートし、2分ごとに最大10分間穏やかな反転を混合します。ブライトフィールド顕微鏡を使用して、単一細胞の解離が成功したことを監視し、確認します。酵素反応を止めるには、氷冷基底培地を10ミリリットル加え、200倍gで5分間スピンダウンします。その後、上清を取り除く。穏やかな反転と混合することにより、基底培地の10ミリリットルで細胞を洗浄します。5分間200回gで再び遠心分離機。上清を取り除き、この洗浄と遠心分離プロセスをもう一度繰り返

isolation-characterization-patient-derived-pancreatic-ductal

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

マウス由来膵管腺癌細胞株の超音波誘導移植のためのプロトコルを原在腫瘍部位に直接記載する。このアプローチは、注射の2〜4週間以内に超音波スキャンによって検出可能な膵臓腫瘍をもたらし、外科的整形トピック移植と比較して腹壁の腫瘍細胞播種の割合を有意に減少させた。...

マウス膵管腺癌の超音波誘導矯正着移植

このプロトコルは、正形外科膵腫瘍の外科的生成と、新たに単離されたマウス膵腫瘍の急速な消化について説明する。消化後、生存可能な免疫細胞集団は、フローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン検出のためのT細胞のex生体内刺激を含むさらなる下流分析に使用することができる。...

直交トピック膵腫瘍の生成と腫瘍浸潤T細胞細胞傷害のEx生体内特性評価

インビトロスクリーニングのために患者由来の異種移植片(PDX)を使用してオルガノイドを作成する方法が記載され、インビボ/インビトロモデルのペアが一致する結果となる。PDX腫瘍は、機械的または酵素的に小片に収穫/処理され、その後、元のPDXに対して通過し、凍結保存され、特徴付けられる腫瘍オルガノイドを成長させるCleversの方法が続いた。...

がん薬理学研究のためのPDXとPDX由来オルガノイドのインビボ/インビトロ患者由来モデルペアの作成

このプロトコルは、器官型スライス培養物(OTSC)の調製を説明しています。この技術により、無傷の多細胞組織の ex vivo...

原発性膵臓癌および転移における腫瘍微小環境の前臨床モデルとしての器官型スライス培養

このプロトコルは、中処理から高スループットのオルガノイド薬物スクリーニングのための半自動化された方法と、顕微鏡に依存しない自動画像分析ソフトウェアを説明し、マルチパラメトリックの単一オルガノイド薬物反応を定量化および視覚化して、腫瘍内の不均一性をキャプチャします。...

バルクおよび単一オルガノイド分析のための広視野生細胞イメージングを用いたマルチパラメトリック腫瘍オルガノイド薬物スクリーニング(英語)

患者由来の乳房腫瘍切除術または正常な乳房組織からヒト乳房オルガノイドを確立するための詳細なプロトコルがここに提供される。このプロトコルは、ヒト患者由来の乳房オルガノイドを培養、凍結、解凍するための包括的なステップバイステップの手順を提供します。...

患者由来乳房オルガノイドの確立と培養

腫瘍オルガノイドは、がん研究と個別化医療へのアプローチに革命をもたらしました。これらは、臨床的に関連性のある腫瘍モデルであり、研究者は診療所で腫瘍の一歩先を行くことができます。このプロトコルは、新鮮な膵臓腫瘍組織サンプルおよび膵臓腺癌起源の患者由来の異種移植片から腫瘍オルガノイドを確立します。...

膵臓癌由来腫瘍オルガノイドおよび線維芽細胞の新鮮組織からの樹立

本プロトコルは、膵管腺癌(PDAC)および正常な膵管上皮細胞を人工多能性幹細胞(iPS細胞)に再プログラミングすることを記述する。レンチウイルスの調製から安定なiPS細胞株の樹立まで、最適化された詳細な手順を段階的に提供します。...

膵管腺癌の多能性へのリプログラミング

ここでは、新鮮なメラノーマ組織から解離細胞懸濁液を培養することにより、メラノーマ患者由来のオルガノイドを生成するプロトコルを紹介します。これらのオルガノイドは 、in vitro で患者特異的な腫瘍を忠実に再現し、腫瘍免疫抑制メカニズム、薬物スクリーニング、薬剤耐性メカニズム、およびがんサーベイランスアプローチを探索するための革新的なアプローチを提供します。...

メラノーマ患者由来オルガノイドモデルによる治療機会の解明

前立腺がんの不均一性と治療抵抗性は依然として課題です。主要な親腫瘍の特徴を保持する患者由来オルガノイド(PDO)を生成するためのプロトコルについて説明します。この標準化されたモデルは、薬物スクリーニングと精密医療の進歩をサポートします。...

患者由来前立腺癌オルガノイドの確立と維持:詳細な実験プロトコル

学ぶ患者由来膵管腺癌オルガノイドの単離と培養法。腫瘍異質性を反映する3次元モデルを構築し、薬剤応答解析や個別化医療への応用を可能にする実験手法を解説します。

患者由来膵管腺癌オルガノイドモデルの単離と特徴付け

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