Name: 複合薬物注入と電気生理学のためのマイクロインジェクストローデシステム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学ぶ マイクロインジェクストロードシステムを用いた複合薬物注入と電気生理学の手法。マカク類の前頭眼野でGABAアゴニストの可逆的失活を実現し、覚醒行動動物での神経活動と薬物効果の長期的研究に応用可能です。

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この研究は、国立衛生研究所(NIH)からの資金援助、EY026924およびEY014800(B.N.)、失明防止研究からの無制限の助成金、ニューヨーク、ニューヨーク、ニューヨーク、眼科視覚科学科、大学への資金提供によって支えられたユタ州の、ヘンリー・サミュエリ工科大学とカリフォルニア大学アーバイン校電気工学科がR.E.に提供したスタートアップ資金。この方法は、ヌドゥースト&ムーア2011、神経科学メソッドのジャーナルに掲載されたティリン・ムーア博士の研究室で開発された同様の方法の以前のレポートに基づいています。著者たちは、原稿に関する彼女のコメントにケルシー・クラーク博士に感謝します。

実験手順は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイドと神経科学ガイドラインと政策のための協会に従いました.実験および行動手順のためのプロトコルは、ユタ大学の動物ケアと使用委員会によって承認されました.
1. 刺激と記録のためのマイクロインジェクドの構築(図1a)
<ol><li>カニューレとプローブの長さを測定します(この例ではナノセンサー)。プローブは、カニューレ先端から突出する長さ(プローブ設計に応じて)に約2cmを加えた長さによってカニューレよりも長くなければなりません。</li>
	<li>拡大鏡または顕微鏡(約10倍倍)の下で、カニューレにプローブをロードします。可能であれば、プローブの先端を保護するためにバックローディングが望ましいです。 注:手動で実行するこの手順は困難です。実際の実験プローブを試す前に、虫眼鏡の下でマイクロ電極を使用して練習することをお勧めします。</li>
	<li>
カニューレ(プローブを含む)を上部フェルール、T接合、および底面フェルールに通します。
	<ol>
<li>プローブがアタッチメントのない単一のワイヤである場合は、それをカウラにバックロードし、アセンブリを下部フェルールからTジャンクションに挿入します。カニューレの上部(フラットエンド側)は、Tジャンクションの中央に配置する必要がありますが、上部フェルール内には配置しないでください。実験プローブまたはバイオセンサーは、トップフェルールの上部に突出する必要があります。 注:カスタムメイドのフェルールは、マイクロドリルビットを使用してフェルールプラグに穴を開け、カニューレをT接合部に締め付けるために必要な直径に基づいて穴の大きさを作ることもできます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フェルールレンチを使用して、Tジャンクションの上部と下部のフェルールを締めます。締め過ぎないでください。小さなチューブを追加して、トップフェルール内の電極支持体を強化することができます。</li>
	<li>プローブの仕様に従って、各プローブ端子(信号、グラウンドなど)に金色のピンをはんだ付けします。</li>
	<li>プローブとカニューレの相対位置を調整します。プローブがカニューレから突出している距離を倍率で測定し、上端から手動で調整します(プローブはフェルール内で自由にスライドできます)。</li>
	<li>金ピンとトップフェルールの間にエポキシ接着剤を加えて、プローブをフェルールに取り付けます。</li>
	<li>上部のフェルールを外して、カニューレ内のプローブを引き込みます。プローブが拡大の下でカニューレ内に完全に入っていることを視覚的に確認します。</li>
	<li>インジェクトローデをマイクロドライブに取り付けます。</li>
</ol>2. 薬物注入用マイクロインジェクストローデの構築 (図1b)
<ol><li>フェルールを使用して、カニューレの「ノンベブル」またはフラットエンドをT接合部の底部に取り付けます。フェルールレンチを使用して、フェルールを締めます。</li>
	<li>標準のフェルールを通してT接合部の上部に小さな毛細管チューブ(〜1.5cm)を取り付けます。フェルールレンチで締めます。</li>
	<li>毛細管、T接合、カニューレおよび対応するフェルールを通してマイクロ電極をバックロードします。</li>
	<li>電極のバックエンドがキャピラリーチューブの背面から1cm未満に突出し、電極の先端が底面の所望の距離でカニューレから突出していることを確認します。電極位置は上端から手動で調節することができる。</li>
	<li>マイクロ電極端子に金ピンはんだ付けする。</li>
	<li>金ピンとトップフェルールの間にエポキシ接着剤を加えて、マイクロ電極をフェルールに取り付けます。</li>
	<li>上部のフェルールを外して、カニューレ内のプローブを引き込みます。マイクロ電極がカニューレに完全に引き込まれたことを視覚的に確認します。</li>
</ol>3. マイクロ流体回路の構築(図2)
<ol><li>安定した表面にブレッドボードを置きます。2 つの 3 方向バルブをブレッドボードの最も長い側面に平行に配置し、1 つのポート (常に開いているポート) を互いに向けて約 6 in にします。ネジを使用して、バルブをブレッドボードに固定します。</li>
	<li>バルブの横に定規を配置します(キャピラリーチューブ内の流体の動きを測定および追跡します)。</li>
	<li>1:1の低粘度オイルと食品着色(マーカー)の混合物をガスタイトシリンジにロードし、マーカーポンプに入れます。キャピラリーチューブを1つカットし、標準のフェルールとルアーロックコネクタを使用して、入力バルブのポートの1つにシリンジを接続します。これが「マーカーライン」です。</li>
	<li>「定規線」の毛細管の短い部分をカットします。標準のフェルールを使用して、バルブの前面ポートに締め付けます。</li>
	<li>2つの長いキャピラリーチューブをカットして、出力バルブをマイクロインジェロードに接続し、ドラッグポンプを入力バルブに接続します(標準フェルールを使用)。 注:これらの2つの線の長さは、実験的なセットアップに依存し、1つは注入装置から動物に到達するのに十分な長さでなければならない、もう1つはドラッグポンプから入力バルブに到達する必要があります。切断石を使用して毛細管チューブをカットします。</li>
</ol>4. マイクロインジェクトをマイクロドライブに取り付ける (図 3)
<ol><li>取り付け前に、マイクロ電極/実験プローブがカニューレに引き込まれていることを確認してください。 注:ガイドチューブはマイクロドライブの位置にある必要があります。</li>
	<li>カスタムメイドのアダプターをマイクロインジェロードに取り付けます。</li>
	<li>マイクロインジェクドをガイドチューブに通してトップロードし、ネジを使用してアダプターに固定します。</li>
	<li>マイクロインジェクドがガイドチューブから突出するマイクロドライブ位置(深さ)を測定し、約1cm後退して挿入の準備をします。</li>
	<li>マイクロインフュージョン実験では、「脳線」をマイクロインジェクストローデの未使用のT接合開口部に接続します。標準的なフェルールを使用し、フェルールレンチで締めます。</li>
</ol>5. マイクロ流体システムのフラッシングと調製
<ol><li>マイクロインジェクトローデを廃棄物ビーカーの上に置きます。</li>
	<li>クロルヘキシジン(例えば、ノルバサン;20 g/Lで溶解)を1mLのガス密注射器に入れ、ドラッグポンプに入れます。液体がバルブを通ってバルブラインに向かい、「脳ライン」を出すようにバルブの流れ方向を回します。</li>
	<li>低流量(50~200°L/分)を使用してクロルヘキシジンで回路を10分間フラッシュし、手順5.2~5.3を滅菌生理食塩水と空気で繰り返します。 注:この段階でリークをチェックすることが重要です。ジャンクションで糸くずのないワイプを穏やかに塗布し、フェルールを通して液体の漏れを明らかにするのに役立ちます。</li>
	<li>500°Lのガスタイトな注射器に薬物をロードし、空気を圧縮し、ドラッグポンプに入れます。マイクロインジェクストローデから数滴が流れるまで50μL/分で流れます。</li>
	<li>ガイドチューブをクロルヘキシジン(20g/Lで溶解)に15分間浸します。</li>
	<li>出力バルブの方向を「フラッシングライン」に向けます。ルーラーラインに色と油の明確なエッジが観察されるまでマーカーポンプを進めます。2つの水溶性材料を混合し、それらの間の鋭いエッジを失わないように、薬物と色の間に常に油があることを確認してください。このオイル/染料ラインの開始位置をマークします(テープまたはマーカーを使用)。</li>
	<li>出力バルブの方向を脳線に向けます。</li>
</ol>6. 記録または注入実験の実行
注:動物の取り扱い手順は、実験や実験によって異なります。以下のステップは、必要な外科的セットアップと硬を露出させるための準備が行われた後に行われる。実験に続いて、必要なすべての術後のステップは、制度的に承認されたプロトコルに従って実行されなければなりません。
<ol><li>マイクロドライブを記録室に取り付けます。ガイドチューブを下げてデュラを貫通します。 注:ガイドチューブは、皮質を損傷しないように、デュラ以上に浸透してはいけません。</li>
	<li>マイクロインジェクドを脳内の記録/注射のために部位の約2mm上に下げる。</li>
	<li>上部フェルール(突出マイクロ電極/バイオセンサー)を締め、金ピンを記録システムに接続します。マイクロインジェクストローデを標的部位に進め続ける。 注:マイクロ電極がカニューレを超えて延びる距離を計算に含めるのを忘れないでください。</li>
	<li>注入実験では、手動マイクロシリンジポンプを使用して、オイルのカラムを3分ごとに1cm(~60 nL/分)移動させます。目的のボリュームが注入されたら、出力バルブをフラッシュラインに向かって切り替えます。 注:注入される体積は、標的とするモデル種および脳領域に基づいて変化する。流量が速いと神経組織に損傷を与える可能性があります。</li>
	<li>実験が完了したら、ガイドチューブ内にマイクロインジェクトを引き込みます(プローブを突き出したままにします)。次に、フラッシュするマイクロドライブを取り外します。ステップ 5.1~5.5の説明に従ってマイクロ流体システムをフラッシュします。をクリックして再利用の準備をします。 注:私たちの経験では、マイクロインジェロードは、適切な注意を払えば、いくつかの用途のために持続します。電気生理学的記録の質は注入の機能より速く落ちる。</li>
</ol>

<ol><li>Chen, L. T. L., Goffart, L., Sparks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+constructing+microinjectrodes+for+reversible+inactivation+in+behaving+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for constructing microinjectrodes for reversible inactivation in behaving monkeys.</a> Journal of Neuroscience Methods. 107 (1-2), 81-85 (2001).</li>
<li>Crist, C. F., Yamasaki, D. S. G., Komatsu, H., Wurtz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+grid+system+and+a+microsyringe+for+single+cell+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A grid system and a microsyringe for single cell recording.</a> Journal of Neuroscience Methods. 26 (2), 117-122 (1988).</li>
<li>Noudoost, B., Moore, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+microinjectrode+system+for+use+in+behaving+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys.</a> Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 218-223 (2011).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+simultaneous+recording+of+electrophysiological+activities+and+dopamine+overflow+in+the+deep+brain+nuclei+of+a+non-human+primate+with+Parkinson%27s+disease+using+nano-based+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystems+%26+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">Real-time simultaneous recording of electrophysiological activities and dopamine overflow in the deep brain nuclei of a non-human primate with Parkinson's disease using nano-based microelectrode arrays.</a> Microsystems & Nanoengineering. 4, (2018).</li>
<li>Altuna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SU-8+based+microprobes+for+simultaneous+neural+depth+recording+and+drug+delivery+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">SU-8 based microprobes for simultaneous neural depth recording and drug delivery in the brain.</a> Lab on a Chip. 13 (7), 1422-1430 (2013).</li>
<li>Noudoost, B., Clark, K. L., Moore, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Distinct+Contribution+of+the+Frontal+Eye+Field+to+the+Visual+Representation+of+Saccadic+Targets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Distinct Contribution of the Frontal Eye Field to the Visual Representation of Saccadic Targets.</a> Journal of Neuroscience. 34 (10), 3687-3698 (2014).</li>
<li>Rajalingham, R., DiCarlo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+Inactivation+of+Different+Millimeter-Scale+Regions+of+Primate+IT+Results+in+Different+Patterns+of+Core+Object+Recognition+Deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reversible Inactivation of Different Millimeter-Scale Regions of Primate IT Results in Different Patterns of Core Object Recognition Deficits.</a> Neuron. 102 (2), 493(2019).</li>
<li>Katz, L. N., Ates, J. L. Y., Pillow, J. W., Huk, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociated+functional+significance+of+decision-related+activity+in+the+primate+dorsal+stream%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dissociated functional significance of decision-related activity in the primate dorsal stream.</a> Nature. 535 (7611), 285(2016).</li>
<li>Esfandyarpour, R., Esfandyarpour, H., Javanmard, M., Harris, J. S., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedle+biosensor%3A+A+method+for+direct+label-free+real+time+protein+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B-Chemical%22%5BJournal%5D)">Microneedle biosensor: A method for direct label-free real time protein detection.</a> Sensors and Actuators B-Chemical. 177, 848-855 (2013).</li>
<li>Esfandyarpour, R., Yang, L., Koochak, Z., Harris, J. S., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoelectronic+three-dimensional+%283D%29+nanotip+sensing+array+for+real-time%2C+sensitive%2C+label-free+sequence+specific+detection+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Nanoelectronic three-dimensional (3D) nanotip sensing array for real-time, sensitive, label-free sequence specific detection of nucleic acids.</a> Biomedical Microdevices. 18 (1), (2016).</li>
<li>Bahmani, Z., Daliri, M. R., Merrikhi, Y., Clark, K., Noudoost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+Memory+Enhances+Cortical+Representations+via+Spatially+Specific+Coordination+of+Spike+Times%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Working Memory Enhances Cortical Representations via Spatially Specific Coordination of Spike Times.</a> Neuron. 97 (4), 967-979 (2018).</li>
<li>Veith, V. K., Quigley, C., Treue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pressure+Injection+System+for+Investigating+the+Neuropharmacology+of+Information+Processing+in+Awake+Behaving+Macaque+Monkey+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%3A+Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Pressure Injection System for Investigating the Neuropharmacology of Information Processing in Awake Behaving Macaque Monkey Cortex.</a> JoVE: Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).</li>
</ol>

いくつかの方法は、現在、同時薬物送達と電気生理学を行うために利用可能です。当社のシステムは、独立して、または薬物注入と組み合わせて記録に使用する柔軟性を有し、ナノセンサーやマイクロ電極などの脆弱な実験プローブを、デュラ・マターおよび神経組織を介して損傷から保護する能力を有することを目的としています。システムは肉眼で薬物注入容積の精密制御を可能にする(私たちの実験室3の前の研究で示される17 nLの精密)。
より小さい直径12の圧力注入のためのより専門的なシステムがある。これらのシステムでは複数の記録サイトが可能ですが、システムの制御に必要なソフトウェアとハードウェアの複雑なセットアップは、各コンポーネントのコストが高く、まだ大規模に製品化されていない実験プローブとのインタフェースの柔軟性が低くなります。さらに、当社の注入は慢性インプラントを必要とせず、化学的および電気生理学的信号を測定するバイオセンサーと互換性があり、これらの応答に対する局所的な薬物注入の効果を測定する可能性を有する薬物を注入することができるという大きな柔軟性を提供します。
この設計により、プローブの構造の損傷を避けるために、試験的なプローブをデュラ浸透後に突出させることができます。この特徴は、装置の多機能性を可能にし、ナノメートルスケールナノセンサ10などの任意の実験プローブの損傷を危険にさらすことなく硬部に浸透することを可能にする。しかしながら、突出し可能な長さの制限があり、フェルールの回転数によって制限され、標準フェルールに対して〜1mmに制限される。小さなカニューレの直径(228μm)による組織損傷は最小限です。
我々が示した実験では、このシステムは、FEFの可逆的な不活性化のためのムシモールの制御された送達を行うために使用され、同時に電気刺激または細胞外記録(単一ニューロン、局所電位)を用いて電極。FEFのこの実験は、不活性化の前にサッカデベクターを確認するためにFEFの微小刺激を必要とし、可逆的なFEF不活性化中にワーキングメモリを研究するために薬物が注入された。同じ単離された単一ニューロンからの記録が薬物注射の前後に維持される可能性は低い;しかし、注入前後の局所的な電位を記録することができました。ここでは、注射、記録、電気刺激を組み合わせた実験を示す。
いったんセットアップされると、この方法は非常に信頼性が高く、堅牢です。しかし、小さなチューブやポート内の小分子(例えば塩)の沈殿により、マイクロ流体を障害物や漏れのない状態に保つために、各実験の後に徹底的なフラッシングが必要です。回路全体のシンプルさにより、各コンポーネントを個別に交換してトラブルシューティングを容易にします。
この方法は、非ヒト霊長類のFEF領域で実証されたが、この原理は、げっ歯類の大きさ以上の種において、電気刺激、記録、薬物注入のいくつかの組み合わせが望まれる他の脳領域に適用することができる。

電気生理学および薬物注射法は、神経細胞の活動と行動を研究するために広く使用されています, 生体内で, げっ歯類や霊長類で.過去30年間にわたり、初期の注射モデルの改良は、より正確で侵襲性の低い技術を可能にし、特定の脳部位1、2、3で同時記録および薬物注入を可能にした。特に霊長類の場合、高度な訓練を受けた動物を必要とする高度な認知機能の研究にこの技術を使用する場合、組織損傷を最小限に抑えて少量を正確に送り出す能力が重要です。最近の進歩は、移植されたプローブ4を用いた刺激と組み合わせた慢性電気生理学的および化学的測定を含み、そして、結合された記録およびマイクロ流体薬物送達は、最近げっ歯類5で試験的に試験されている。ここで説明する注射システムは、電気生理学的記録、刺激、および正確な薬物送達を可能にし、それはすでに複数の霊長類実験室6、7、8で正常に実施されている。
ナノセンサ9、10などの繊細で特殊なセンサの利用可能性の向上は、脆弱なナノスケールデバイスやマイクロ電極チップを損なうことなく、デュラマターを介してプローブを得るための信頼性の高い方法を必要とします。
容易に入手できる低コストのコンポーネントを使用してこれらの方法を組み合わせる技術的な課題を克服し、(i) のような脆弱な実験プローブを配置する機能の2つの主要な機能を容易にするマイクロインジェクストローデシステムを設計しました。マイクロ電極またはナノセンサは、デュラマターおよび神経組織を介して、任意の損傷から保護される。この機能により、カニューレを神経組織を通るガイドとして使用して送達される標的の場所に実験プローブを配置することができる。(ii) マイクロ電極を用いて電気生理学的記録と電気刺激と薬物注入を組み合わせた実験を行う能力。
当社のシステムは、薬物送達(マイクロインフュージョン用のシステムを使用する場合)の両方を機能し、マイクロ電極またはナノセンサ(デュラを通過する場合と、両方を通過する場合)の追加保護を提供するカニューレと一緒に、duraを貫通するガイドチューブを使用しています神経組織)。このシステムは、安価で見つけやすい広く市販されているコンポーネントで簡単に構築することができます。小径カニューレ(外径OD=235μm、内径ID=108μm)を使用することで浸透ダメージを最小限に抑えます。
ここでは、マイクロインジェドロードの構築とマイクロ流体システムの構成に関するステップバイステップの手順を紹介します。マイクロインジェクドロードの使用に必要なステップについて、薬物注入用のマイクロ流体システムに独立して、または結合して説明します。同様のアプローチは、ナノセンサ9、10などの任意の脆弱な実験プローブで適用することができる。プローブは、カニューレに前面または背面にロードすることができ(設計に応じて)、硬孔および神経組織を貫通する際の損傷から保護される。ヒト以外の霊長類を用いた生体内実験のサンプルデータを提供し、タングステンマイクロ電極を用いて電気刺激を行い、その後前眼科(FEF)にムシモールを注入し、動物が記憶誘導サッカデ(MGS)タスクを行った。

<table><tbody><tr><td>3ポート手動バルブ</td><td>LabSmith</td><td>手動3ポートセレクターバルブ(MV201-C360)</td><td><a href="https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26">https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26</a</td></tr><tr><td>>Cannulae</td><td>Vita Needle Company</td><td>304 ステンレス鋼管、外径 228&mu;m、内径165&mu;m</td><td><a href="https://www.vitaneedle.com/assets/files/Vita_Needle_Master_Tubing_Gauge_Chart.pdf">Vitaニードルマスターチューブゲージチャート</a></td></tr><tr><td>劈開石</td><td>モレックス</td><td>劈開石1 "×1"(部品番号1068680064)</td><td>毛細管チューブを劈開する方法に従うことを強くお勧めします:https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf</td></tr><tr><td>クロレキシジンジアセテート</td><td>ウォルマート</td><td>ノルバサン溶液消毒剤(AAP311)</td><td>マイクロ流体回路フラッシングに使用され、20 g / Lで溶解</td></tr><tr><td>カスタムアダプター</td><td>カスタムプロバイダー</td><td>-</td><td>マイクロインジェクターを油圧マイクロドライブに接続するためのカスタム機械加工アダプター</td></tr><tr><td>ドライバー</td><td></td><td>LabSmith T7 ブレッドボードネジを取り付けるためのTORXドライバー(LS-TORXドライバー)</td><td><a href="https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25">https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25</a</td></tr><tr><td>>エポキシ接着剤</td><td>LabSmith</td>金属<td>とプラスチックの接着用の2液型高強度エポキシ接着剤(LS-EPOXY)</td><td><a href="https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24">https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#。XO8t89NKh24</a></td></tr><tr><td>Ferrule</td><td>LabSmith</td><td>ワンピース フィッティング (C360-100) キャピラリー接続用、スルーホール 360&mu;m ODキャピラリー</td><td><a href="https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24">https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24</a></td></tr><tr><td>フェルールプラグ</td><td>LabSmith</td>ワン<td>ピースプラグ(C360-101)は、任意の-C360ポート</td><td><a href="https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#で使用できます。XNYFl9NKh24">https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24</a></td></tr><tr><td>フェルールレンチ</td><td>LabSmith</td><td>1/8" 一体型金具・プラグ取り付け用六角レンチ (LS-HEX 1/8" 六角レンチ)</td><td><a href="https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24">https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24</a></td></tr><tr><td>ガスタイトシリンジ</td><td>ハミルトン社</td><td>500&mu;L ガスタイトシリンジ モデル 1750 (81220) および 1mL ガスタイトシリンジ モデル 1001 (81320)</td><td><a href="https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top">https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top</a></td></tr><tr><td>金ピン</td><td>Aim-Cambridge</td><td>オス金メッキ圧着コネクタピン (40-9856M)</td><td><a href="https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html">https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html</a></td></tr><tr><td>糸くずの出ないワイプ</td><td>キンバリー・クラーク</td><td>キムテック・サイエンス・キムワイプ デリケート・タスク</td><td>糸くずの出ないワイプで、システム内の漏れを特定するために使用</td></tr><tr><td>液体食品着色料</td><td>マコーミック・アンド・カンパニー</td><td>水性、黒色液体食品着色料(52100581873)</td><td><a href="https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color">https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color</a></td></tr><tr><td>低粘度油</td><td>Clearco Products Co.</td><td>純粋なシリコーン流体オクタメチルトリシロキサン、粘度1cSt、25°C;C (PSF-1cSt)</td><td><a href="http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html">http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html</a></td></tr><tr><td>ルアーロックコネクタ</td><td>LabSmith</td><td>ルアーロックアダプタ (C360-300)、ルアーロックシリンジを360&muに接続するためのメスフィッティング。m キャピラリーチューブ</td><td><a href="https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24">https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24</a></td></tr><tr><td>マイクロドリルビット</td><td>グレインジャー</td><td>マイクロドリルビット、0.23mm (414H85)</td><td><a href="https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits">https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits</a></td></tr><tr><td>マイクロ電極</td><td>FHC</td><td>金属微小電極、タングステン、エポキシ絶縁体</td><td><a href="https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes">https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes</a></td></tr><tr><td>油圧マイクロマニピュレーター</td><td>成重グループ</td><td>ガイドチューブ付油圧マイクロマニピュレーター(MO-96)</td><td><a href="http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html">http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html</a></td></tr><tr><td>Polymicro キャピラリーチューブ</td><td>Molex</td><td>Polymicro フレキシブルフューズドシリカキャピラリーチューブ (TSP150375)、外径 375&micro;m、内径150&マイクロ;m</td><td><a href="https://www.molex.com/webdocs/datasheets/pdf/en-us/1068150024_CAPILLARY_TUBING.pdf">Polymicroキャピラリーチューブ</a></td></tr><tr><td>プログラマブルシリンジポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td>標準注入/引き出しポンプ、プログラマブル(70-2213)</td><td><a href="https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html">https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html</a></td></tr><tr><td>定規</td><td>エンパイア</td><td>ステンレス鋼6 "硬定規(27303)</td><td><a href="http://www.empirelevel.com/rulers.php">http://www.empirelevel.com/rulers.php< / a></td></tr><tr><td>ネジセット</td><td>LabSmith</td><td>バルブ取り付けネジセット(LS-SCREWS .25)、ねじ山形成ネジ(2-28 x 1/4 ")からバルブをブレッドボードに取り付け</td><td>ます<a href="https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24">https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24</a></td></tr><tr><td>Standard Breadboard</td><td>LabSmith</td><td>4" x 6" プラットフォーム (LS600)、0.25" 穴間隔で流体回路</td><td>を取り付けることができます<a href="https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24">https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24</a></td></tr><tr><td>滅菌生理食塩水(塩化ナトリウム)0.9%</td><td>バク</td><td>スター0.9%塩化ナトリウム</td>滅菌滅菌静脈<td>内注入</td></tr><tr><td>滅菌シリンジフィルター</td><td>ミリポア</td>シグマ<td>ミリポアシグマ&trade;Millex&trade;-GP滅菌シリンジフィルター、PESメンブレン付き(SLGPM33RS)</td><td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs">https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs</a></td></tr><tr><td>Stoelting手動マイクロシリンジポンプ</td><td>Stoelting社</td><td>手動注入/撤退ポンプ (51222)</td><td><a href="https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html">https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html</a></td></tr><tr><td>T接合</td><td>LabSmith</td><td>インターコネクト ティー (C360-203) フローストリームを組み合わせるため、360&mu で使用します。m ODキャピラリーチューブ</td><td><a href="https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24">https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24</a></td></tr></tbody></table>

複合薬物注入と電気生理学のためのマイクロインジェクストローデシステム

Microinjectrode System for Combined Drug Infusion and Electrophysiology

このマイクロインジェクストローデシステムは、薬物注入、電気生理学、マイクロ電極やナノセンサーなどの実験プローブの送達と検索のために設計されており、覚醒中の繰り返し使用に最適化され、動物を振る舞います。マイクロインジェクストローデシステムは、複数の目的のために構成することができます:(1)それ以外の場合は、デュラマターを貫通するにはあまりにも脆弱であろう実験プローブの配置のためのカニューレの簡単な配置、(2)薬物のマイクロ流体注入、いずれかの実験プローブを含むカニューレ(すなわち、マイクロ電極、ナノセンサ)に独立または結合する。このプロトコルでは、マイクロインジェクドの段階的な構築、マイクロ流体成分への結合、および生体内でのシステム使用のためのプロトコルを説明する。このシステムのマイクロ流体部品は、最小限の浸透ダメージで、ナノリットルスケールでボリュームの配信を可能にします。薬物注入は、目覚めのマイクロ電極やナノセンサーなどの実験プローブと独立して、または同時に行うことができ、動物を振る舞う。このシステムの応用は、皮質の電気的活動および行動に対する薬物の影響の測定から、プローブまたはナノセンサー測定に基づく行動性能の文脈における皮質の特定の領域の機能の理解に至る。このシステムの機能の一部を実証するために、作業メモリタスク中に黄腸マカクにおける前眼場(FEF)の可逆的不活性化のためのムスシモール注入の例を提示する。

前眼球場(FEF)の可逆的不活性化のためのGABAaアゴニスト(ムスシモール)の注射を行い、動物は記憶誘導サッカデタスク11を行った。このタスクでは、動物が固定し、周辺の視覚ターゲットが提示される。動物は、目標の位置を記憶しながら固定を維持し、固定ポイントが消えると、報酬を受け取るために記憶された場所にサッカディック目の動きを実行します。マイクロインジェロードは、図1bの指示に従って構築されました。実験例の注入量は850nLであった。ムシモール注入に対する様々な場所および時間におけるメモリ誘導サッカデ(MGS)タスクの動作性能を図4に示す。最大のパフォーマンス欠損は、2~3時間の注入後に観察された。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60365/60365fig1a.jpg"> 図1:マイクロインジェクストローデの段階的な製造。(a)マイクロ流体システムに依存しない使用のための構成。カニューレおよびプローブは、プローブの先端が所望の長さ(例えば、150μm)で突出できることを確認するために測定される。プローブはカニューレに前面にロードされます。カニューレはTジャンクションを通過し、下側に取り付けられ、Tジャンクションの中央に平らな端点が付いています。プローブのバックエンドは、トップフェルールを通って継続します。マイクロインジェクストローデは、各プローブ端子の金色のピンをはんだ付けし、それらの間に接着剤を追加して安定性を高めます。集録システムへの接続は、プローブの設計によって異なります。この例では、プローブは3つのリードを持つナノセンサです。(b)マイクロ流体システムで使用するための構成。マイクロインジェクストローデをマイクロ流体系に結合するために、T接合部の上部には毛細管チューブが使用される。プローブは、前面または背面にロードできます。マイクロ流体ラインは、3番目のTジャンクション開口部に差し込されます。この例では、マイクロ電極を使用しました。上部のフェルールを締めてマイクロ電極が突出したカニューレの先端のズーム画像を参照してください。建設で使用される品目のリストについては、材料表を参照してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60365/60365fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60365/60365fig2a.jpg"> 図2:マイクロ流体システム2バルブ構成により、マイクロインジェロードに向かう流れ方向、またはトラブルシューティング用のフラッシングラインに向かう流れ方向を制御できます。この回路は、キャピラリーチューブと標準フェルールを使用して接続された2つの3ポートバルブに依存しています。ガスタイトな注射器は、注入薬とマーカーを運び、注入するために使用されます。プログラム可能な注射器ポンプはシステムの自動フラッシュおよび薬物の負荷を可能にする。手動マイクロシリンジポンプは制御された注入および視覚化を可能にする。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60365/60365fig2alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60365/60365fig3.jpg"> 図3:注入能力の有無にかかわらず、油圧マイクロドライブへのマイクロインジェクドの取り付けステップ4.1:カスタムメイドのアダプタは、マイクロインジェクドをマイクロドライブに取り付けることを可能にします。1 本のネジでアダプタをマイクロドライブに取り付けます。2本のねじはアダプターにマイクロインジェクサンドを固定する。上部フェルールは、マイクロドライブのガイドチューブにマイクロインジェクトロードをロードする際にマイクロ電極/実験プローブの先端を保護するために、少なくとも2ターンはねじで外す必要があります。ステップ4.3:上からガイドチューブにマイクロインジェクトロードを挿入します。ステップ4.4:マイクロインフュージョンを行う場合は、プラスチックフェルールを使用して第3のT接合開口部に薬物ラインを差し込みます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60365/60365fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60365/60365fig4a.jpg"> 図4:FEFにおけるムシモール注入中のメモリ誘導サッカデタスク(a)マイクロインジェロードを右半球、FEF領域に配置した。(b) 8 つのターゲットが周辺に配置される MGS タスク中の動作パフォーマンス。MGSタスクの4ブロックを、注射前後3回で実行しました。極プロットは、固定点(極プロット上の角度)に対して異なる位置のパフォーマンス(偏心)を各時間(色)で示します。射出後の左視覚ヘミフィールド2時間で性能が明らかに低下した(青い痕跡、極プロットの左半分)。(c)FEFにおける8つの周辺記憶位置(左)およびムシモール注射後(右、1および3時間のポスト注入)に対するサッカデトレース。左視覚ヘミフィールド(極プロットの左半分)のサッカデ精度は、ムシモール注射後に減少した。視野角 (dva) の度単位でスケールします。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60365/60365fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

電気生理学用に設計されたマイクロインジェクストローデシステムと、オプションの薬物注入による実験プローブ(ナノセンサ、マイクロ電極)の送達を支援します。広く利用可能なマイクロ流体成分は、プローブを含むカニューレに結合される。マイクロインジェクストロード構築のためのステップバイステッププロトコルが含まれており、マカク皮質におけるムスシモール注入中の結果が含まれています。

This microinjectrode system is designed for drug infusion, electrophysiology, and delivery and retrieval of experimental probes, such as microelectrodes ...

このマイクロインジェクトロドシステムは、薬物注入、電気生理学、およびマイクロ電極およびナノセンサーなどの実験用プローブの送達および検索のために設計されている。それは周囲のティッシュにマイナーな浸透の損傷を伴う動物を振る舞う目を覚ますの繰り返し使用のために最大限に活用される。マイクロインジェクトロデシステムは、複数の目的のために構成することができます。1つ目は、硬膜に浸透するには壊れやすすぎる実験プローブの配置のためのカニューレの簡単な配置です。第二は、実験的プローブを含むカニューレに独立してまたは結合された薬物のマイクロ流体注入である。システムのマイクロ流体コンポーネントは、ナノリットルスケールでの体積の配信を可能にします。カニューレとナノセンサプローブまたはマイクロ電極の長さを測定します。プローブは、カニューレ先端から約1センチメートルを差し出す長さによってカニューレよりも長くなければなりません。拡大鏡の下で、プローブの先端を保護するために、プローブを背面からカニューレにロードします。プローブを含むカニューレを底面フェルールのT接合部に挿入します。カニューレの上部の平らな端を T ジャンクションの中央に配置します。カニューレを介してジャンクションをブロックしないように、ジャンクションをジャンクションに引き込み、締め付けます。マイクロ電極の上部にチューブを取り付けます。バックは、毛細管、T接合、カニューレ、および対応するフェルールを介してマイクロ電極をロードします。所望の長さでマイクロ電極を切り取り、端を削り取ります。電極の後端がキャピラリーチューブの背面から1センチメートル未満に突き出ていて、電極の先端が下側の所望の距離でカニューレから突き出ているか確認してください。マイクロ電極端子を金ピンに入れ、金ピンをマイクロ電極端子にはんだ付けします。金ピンと上部フェルールの間にエポキシ接着剤を加え、マイクロ電極をフェルールに取り付けます。エポキシが硬化した後、好ましくは24時間以上、マイクロ電極がカニューレの内側に完全に後退することを確認するために、上部フェルールを緩める。マイクロ流体回路を構築するには、広い基板を安定した面に置きます。2つの3方向バルブを、1つのポートが互いに向き合って約12センチメートル離れた広いボードの最も長い側面に平行に置きます。広い板にバルブを固定し、定規ラインのためのキャピラリーチューブの別の10センチメートルをカットし、その間にそれを置くためにネジを使用してください。標準的なフェルールを使用して、バルブの向き合うポートにチューブを締めます。キャピラリーチューブを10~20センチカットし、標準のフェルールとLuerロックコネクタを使用して、注射器のチューブを入力バルブのポートの1つに接続します。小さな毛管を切り、フラッシュラインとして出力バルブに接続します。出力バルブをマイクロインジェクトロデに接続するために、100センチメートルの周りにキャピラリーチューブの2つの長い部分をカットします。薬物ポンプとマーカーポンプを入力バルブに接続します。まず、マイクロ電極実験プローブがカニューレに引き込まれるようにします。ねじを使用してマイクロインジェクトロダにカスタムメイドのアダプタを取り付けるには、ガイドチューブを通してマイクロインジェクトロデをトップロードし、一対のネジを使用してカスタムメイドのマイクロドライブアダプタに固定します。マイクロインジェクトロドがガイドチューブから突き出ているマイクロドライブ位置の深さを測定し、それを1センチメートル引き込んで挿入の準備をします。マイクロインフュージョン実験では、マイクロインジェクトロデの未使用のT接合口に脳線を接続します。標準的なフェルールを使用し、フェルールレンチで締めます。上フェルールも締め付けされていることを確認してください。次に、マイクロドライブをビーカーの上に置きます。1ミリリットルガスタイトシリンジに1リットル当たり20グラムでクロルヘキシジンをロードし、薬物ポンプに入れる。バルブの流れ方向を回し、流体が薬物ポンプから入力バルブを通って出力バルブに、そして脳ラインを出るように、毎分50〜200マイクロリットルの低流量を設定します。回路をクロルヘキシジンで10分以上洗い流します。滅菌生理水で洗い流しを繰り返し、空気で洗い流します。ジャンクションでリントフリーワイプを静かに塗布して、フェルールを通して液体漏れを明らかにします。最も重要なステップは、注入ロードとマイクロ流体回路の組み立てが漏れなくかどうかを確認することです。500マイクロリットルガスタイトな注射器に薬物をロードし、空気を圧縮し、薬物ポンプに入れる。毎分50マイクロリットルに流れを調整し、マイクロインジェクトロドに数滴が残るまで液体を移動させます。その後、1リットル当たり20グラムの濃度でガイドチューブをクロルヘキシジンに15分間浸す。出力バルブの方向をフラッシングラインに向けて回し、マーカーポンプが進む際にマーカーを変位させ、定規線に色と油の明確なエッジが観察されるまで回転させます。2つの水溶性材料を混合し、それらの間の鋭いエッジを失わないように、薬物と色の間に常に油があることを確認してください。このオイル染料ラインの開始位置をマークします。必要な実験のセットアップ後、上部フェルールを緩めることによってカニューレにマイクロ電極を引き込みます。マイクロドライブを記録チャンバーに取り付け、ガイドチューブを下げて硬膜に浸透させます。次に、脳内にある記録部位の約2ミリメートル上にマイクロインジェクロードを下げる。上部フェルールを締め、ゴールドピンを記録システムに接続します。マイクロインジェクトロデを標的部位に進め続ける。次に、出力バルブを脳線に切り替えます。注入実験のために、手動マイクロシリンジポンプを使用して、毎分0.5センチメートルの油柱を移動させます。目的のボリュームが注入されたら、出力バルブをフラッシュラインに向かって切り替えます。本研究では、動物が記憶誘導サッカデタスクを終了している間、右半球FEF領域を通るGABA Aアゴニストの注射が前頭眼球の可逆的な不活性化のために行われた。極プロットは、固定点に対する異なる位置の偏心のパフォーマンスを示します。注射の2時間後に左視ヘミフィールドで明らかにパフォーマンスが低下した。FEFにおけるムシモール注入前後の8つの周辺メモリの場所のサッカデトレースをここに示す。左視ヘミフィールドのサッカデ精度は、ムシモール注射後に低下した。セットアップが完了すると、この方法は非常に信頼性が高く、堅牢です。しかし、チューブやポート内の小分子の沈殿により、マイクロ流体に障害物や漏出を防ぐためには、各使用前と実験後に徹底的な洗浄が必要です。この方法は非ヒト霊長類の前眼球で実証されたが、この原理は、げっ歯類の大きさ以上の種で電気刺激、記録、薬物注射のいくつかの組み合わせが望まれる他の脳領域に適用することができる。当社のシステムは、独立して、または薬物注射と組み合わせて記録するために使用される柔軟性を有し、その小さなカニューレ径による最小限の組織損傷で硬膜および神経組織を介して損傷から保護された壊れやすい実験プローブを正確に配置する能力を有する。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

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複合薬物注入と電気生理学のためのマイクロインジェクストローデシステム

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