複合薬物注入と電気生理学のためのマイクロインジェクストローデシステム

このマイクロインジェクトロドシステムは、薬物注入、電気生理学、およびマイクロ電極およびナノセンサーなどの実験用プローブの送達および検索のために設計されている。それは周囲のティッシュにマイナーな浸透の損傷を伴う動物を振る舞う目を覚ますの繰り返し使用のために最大限に活用される。マイクロインジェクトロデシステムは、複数の目的のために構成することができます。

1つ目は、硬膜に浸透するには壊れやすすぎる実験プローブの配置のためのカニューレの簡単な配置です。第二は、実験的プローブを含むカニューレに独立してまたは結合された薬物のマイクロ流体注入である。システムのマイクロ流体コンポーネントは、ナノリットルスケールでの体積の配信を可能にします。

カニューレとナノセンサプローブまたはマイクロ電極の長さを測定します。プローブは、カニューレ先端から約1センチメートルを差し出す長さによってカニューレよりも長くなければなりません。拡大鏡の下で、プローブの先端を保護するために、プローブを背面からカニューレにロードします。

プローブを含むカニューレを底面フェルールのT接合部に挿入します。カニューレの上部の平らな端を T ジャンクションの中央に配置します。カニューレを介してジャンクションをブロックしないように、ジャンクションをジャンクションに引き込み、締め付けます。

マイクロ電極の上部にチューブを取り付けます。バックは、毛細管、T接合、カニューレ、および対応するフェルールを介してマイクロ電極をロードします。所望の長さでマイクロ電極を切り取り、端を削り取ります。

電極の後端がキャピラリーチューブの背面から1センチメートル未満に突き出ていて、電極の先端が下側の所望の距離でカニューレから突き出ているか確認してください。マイクロ電極端子を金ピンに入れ、金ピンをマイクロ電極端子にはんだ付けします。金ピンと上部フェルールの間にエポキシ接着剤を加え、マイクロ電極をフェルールに取り付けます。

エポキシが硬化した後、好ましくは24時間以上、マイクロ電極がカニューレの内側に完全に後退することを確認するために、上部フェルールを緩める。マイクロ流体回路を構築するには、広い基板を安定した面に置きます。2つの3方向バルブを、1つのポートが互いに向き合って約12センチメートル離れた広いボードの最も長い側面に平行に置きます。

広い板にバルブを固定し、定規ラインのためのキャピラリーチューブの別の10センチメートルをカットし、その間にそれを置くためにネジを使用してください。標準的なフェルールを使用して、バルブの向き合うポートにチューブを締めます。キャピラリーチューブを10~20センチカットし、標準のフェルールとLuerロックコネクタを使用して、注射器のチューブを入力バルブのポートの1つに接続します。

小さな毛管を切り、フラッシュラインとして出力バルブに接続します。出力バルブをマイクロインジェクトロデに接続するために、100センチメートルの周りにキャピラリーチューブの2つの長い部分をカットします。薬物ポンプとマーカーポンプを入力バルブに接続します。

まず、マイクロ電極実験プローブがカニューレに引き込まれるようにします。ねじを使用してマイクロインジェクトロダにカスタムメイドのアダプタを取り付けるには、ガイドチューブを通してマイクロインジェクトロデをトップロードし、一対のネジを使用してカスタムメイドのマイクロドライブアダプタに固定します。マイクロインジェクトロドがガイドチューブから突き出ているマイクロドライブ位置の深さを測定し、それを1センチメートル引き込んで挿入の準備をします。

マイクロインフュージョン実験では、マイクロインジェクトロデの未使用のT接合口に脳線を接続します。標準的なフェルールを使用し、フェルールレンチで締めます。上フェルールも締め付けされていることを確認してください。

次に、マイクロドライブをビーカーの上に置きます。1ミリリットルガスタイトシリンジに1リットル当たり20グラムでクロルヘキシジンをロードし、薬物ポンプに入れる。バルブの流れ方向を回し、流体が薬物ポンプから入力バルブを通って出力バルブに、そして脳ラインを出るように、毎分50〜200マイクロリットルの低流量を設定します。

回路をクロルヘキシジンで10分以上洗い流します。滅菌生理水で洗い流しを繰り返し、空気で洗い流します。ジャンクションでリントフリーワイプを静かに塗布して、フェルールを通して液体漏れを明らかにします。

最も重要なステップは、注入ロードとマイクロ流体回路の組み立てが漏れなくかどうかを確認することです。500マイクロリットルガスタイトな注射器に薬物をロードし、空気を圧縮し、薬物ポンプに入れる。毎分50マイクロリットルに流れを調整し、マイクロインジェクトロドに数滴が残るまで液体を移動させます。

その後、1リットル当たり20グラムの濃度でガイドチューブをクロルヘキシジンに15分間浸す。出力バルブの方向をフラッシングラインに向けて回し、マーカーポンプが進む際にマーカーを変位させ、定規線に色と油の明確なエッジが観察されるまで回転させます。2つの水溶性材料を混合し、それらの間の鋭いエッジを失わないように、薬物と色の間に常に油があることを確認してください。

このオイル染料ラインの開始位置をマークします。必要な実験のセットアップ後、上部フェルールを緩めることによってカニューレにマイクロ電極を引き込みます。マイクロドライブを記録チャンバーに取り付け、ガイドチューブを下げて硬膜に浸透させます。

次に、脳内にある記録部位の約2ミリメートル上にマイクロインジェクロードを下げる。上部フェルールを締め、ゴールドピンを記録システムに接続します。マイクロインジェクトロデを標的部位に進め続ける。

次に、出力バルブを脳線に切り替えます。注入実験のために、手動マイクロシリンジポンプを使用して、毎分0.5センチメートルの油柱を移動させます。目的のボリュームが注入されたら、出力バルブをフラッシュラインに向かって切り替えます。

本研究では、動物が記憶誘導サッカデタスクを終了している間、右半球FEF領域を通るGABA Aアゴニストの注射が前頭眼球の可逆的な不活性化のために行われた。極プロットは、固定点に対する異なる位置の偏心のパフォーマンスを示します。注射の2時間後に左視ヘミフィールドで明らかにパフォーマンスが低下した。

FEFにおけるムシモール注入前後の8つの周辺メモリの場所のサッカデトレースをここに示す。左視ヘミフィールドのサッカデ精度は、ムシモール注射後に低下した。セットアップが完了すると、この方法は非常に信頼性が高く、堅牢です。

しかし、チューブやポート内の小分子の沈殿により、マイクロ流体に障害物や漏出を防ぐためには、各使用前と実験後に徹底的な洗浄が必要です。この方法は非ヒト霊長類の前眼球で実証されたが、この原理は、げっ歯類の大きさ以上の種で電気刺激、記録、薬物注射のいくつかの組み合わせが望まれる他の脳領域に適用することができる。当社のシステムは、独立して、または薬物注射と組み合わせて記録するために使用される柔軟性を有し、その小さなカニューレ径による最小限の組織損傷で硬膜および神経組織を介して損傷から保護された壊れやすい実験プローブを正確に配置する能力を有する。