Name: 多細胞ヒト初等子宮内膜オルガノイドの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぶ多細胞ヒト初等子宮内膜オルガノイドの生成法。上皮細胞と間質細胞を含む3D構造で、ホルモン応答や子宮内膜がんのリスク因子を研究する生理学的モデルとして薬剤スクリーニングに応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究は、NIEHS/NIH/NCATS UG3助成金(ES029073)とノースウェスタンファインバーグ医学部ブリッジ基金(JJK)が資金提供を受けました。パラフィン埋め込みのための固定オルガノイドを処理するためのノースウェスタン病理学コア施設を認めたい。ウッドラフ、バーデット、アーバネックのラボを含むUG3チーム全体に対して、洞察に満ちたディスカッションとコラボレーションを行いたいと思います。

子宮内膜サンプルは、ノースウェスタン大学プレンティス女性病院で良性子宮状態のための日常的な子宮摘出術を受けている閉経前の女性から採取された。書面による同意は、研究に含まれるすべての女性から得られた。
1. アガロース金型の調製
<ol><li>細胞の単離を開始する前に、鋳造し、メーカーの指示に従ってオルガノイドを収容するために1.5%アガロースマイクロ金型(材料のテーブル)を平衡化します。</li>
</ol>2. 子宮内膜オルガノイドの生成
<ol><li>一次間質および上皮細胞の収穫
	<ol>
<li>無菌技術を用いてバイオセーフティキャビネット内で、酵素溶液(2.5mg/mLコラゲナーゼI+0.1mg/mL DNase I 10mLのディスパーゼ[500単位])を37°Cで調製し、0.2μmシリンジフィルターを用いて溶液を15mLに無菌フィルターします。</li>
		<li>無菌技術を用いたバイオセーフティキャビネットでは、子宮生検や軟体組織から子宮内膜をこすり落とし、フードの下の軟体組織をメスで非常に小さな部分にします。 注:少なくとも20mm x 10 mm x 1 mmである子宮内膜組織は、十分な数のオルガノイドを生成するために必要とされる。</li>
		<li>15 mL円錐管で酵素溶液にみじん切り組織を入れます。キャップを閉じ、汚染を防ぐためにワックスフィルム(材料のテーブル)でトップを包みます。</li>
		<li>水浴またはインキュベーターにティッシュを入れて37 °Cで30分間、穏やかな揺れ(80−100 rpm)を入れます。</li>
		<li>50 mL円錐管に20 μmセルストレーナーの上に100 μmセルストレーナーを積み重ねます。2つのストレーナーを通して溶液を濾過し、ハンクのバランス塩溶液(HBSS;)の10 mLで15 mL円錐管をすすいでください。材料の表)すべての細胞が集められていることを確認するためにストレーナーを通して洗浄を置きます。 注:フロースルー液体には、間質細胞と赤血球(合計約20mL)が含まれています。上皮細胞は20 μmストレーナー上に集される。未消化組織の塊は100 μmのストレーナーの上に残る。未消化組織をバイオハザード廃棄物容器に捨てます。</li>
		<li>ステップ2.1.5から新しい50 mL円錐管に20 μmセルストレーナーを反転し、1%のペン/ストレップで補充されたオルガノイド培地(材料の表)の20 mLでストレーナーから上皮細胞を洗い流します。</li>
		<li>5分間500 x gでステップ2.1.5および2.1.6から円錐形の管を遠心分離する。</li>
		<li>採取した間質細胞を用いて、上清を除去し、赤血球リシスバッファーの10mLでペレットを再中断する。 37 °C で 10~15 分間インキュベートし、円錐管を 500 x gで 5 分間遠心分離し、上清を取り除き、オルガノイド媒体の 200-300 μL でペレットを再中断します (詳細については、ステップ 2.2.2 を参照)。</li>
		<li>採取した上皮細胞を使用して、上清を取り出し、100 μLのオルガノイド培地で再中断する(詳細についてはステップ2.2.2を参照)。</li>
	</ol></li>
	<li>シードセル
	<ol>
<li>24ウェルプレートのウェル(1金型1個)の井戸で1.5%のアガロース型を平衡化した後、アガロースカビの外側にオルガノイド培地を取り除き、組織培養プレートを傾けて、アガロース皿の細胞播種室からの培地も可能にする。慎重に取り外します。</li>
		<li>顕微鏡下で上皮(ステップ2.1.9から)と間質(ステップ2.1.8から)細胞懸濁液を見ます。 上皮または間質細胞懸濁液に一度に100 μLのオルガノイド培地を追加し、懸濁液の密度がほぼ等しくなるようにします。 注:上皮細胞は一緒に集まり、単一細胞懸濁液に上皮細胞を消化/トリプシン化することはお勧めできません。</li>
		<li>間質細胞の1部を上皮細胞の3部を体積で組み合わせます。</li>
		<li>アガロース金型の細胞播種室への結合細胞懸濁液のピペット50μL(60,000細胞)。</li>
		<li>アガロース型が細胞で満たされたら、24ウェルプレートの井戸に400μLの新鮮なオルガノイド培地を慎重に加えます。 注:培地はアガロース皿の表面のすぐ下に達し、細胞が金型から浮かび上がらない。2−3日後、細胞は沈着し、オルガノイドを形成し始める。</li>
		<li>オルガノイド培地を500μLで2日おきに変化します。</li>
		<li>2-3日後, 上皮および間質細胞の組織を促進するために0.1 nMエストラジオール(E)および0.8 nMテストステロン(T)を補充されたものに培地を変更します。 注:上皮細胞と間質細胞の組織はホルモンの有無にかかわらず起こりうるが、より多くのオルガノイドはホルモンの存在下で組織化される。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 実験用子宮内膜オルガノイドの採取
注:実験が行われた後、子宮内膜オルガノイドは組織学またはRNA分析のために処理することができる。次のステップは、オルガノイドを処理する方法を説明する。
<ol><li>
組織
	<ol>
<li>リン酸緩衝生理食べ物(PBS)に1.5%アガロースを沸騰させることで溶解します。液体アガロースを約50°Cに冷却します。</li>
		<li>解剖顕微鏡の下で、24ウェルプレートを傾け、慎重にアガロースカビの外側から媒体をピペット。オルガノイドを破壊しないように、アガロースカビの内部から慎重に媒体をピペット。</li>
		<li>解剖顕微鏡の下で、慎重にアガロース皿のチャンバーに暖かい(50°C)1.5%アガロースのピペット70-75 μL。オルガノイドの邪魔にならないように注意してください。</li>
		<li>4°Cで5分間冷まします。</li>
		<li>24ウェルプレートの各ウェルに4%パラホルムアルデヒド(PFA)を加え、オルガノイドを含む密封されたアガロースカビ全体を4°Cで一晩固定します。次いで、パラフィン埋め込み処理の準備ができるまで、4°Cで70%エタノールに保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA分離
	<ol>
<li>解剖顕微鏡の下で、24ウェルプレートを傾け、慎重にアガロースカビのチャンバーから媒体をピペット。</li>
		<li>新鮮なオルガノイド培地の1mLをアガロース型に直接ピペットし、オルガノイドをマイクロウェルから洗い流します。あまりにも多くの気泡を作成しないように注意してください。</li>
		<li>ステップ 3.2.2 から同じ媒体でピペッティングをもう一度繰り返します。</li>
		<li>オルガノイドを含むすべての培地を収集します。オルガノイドを収集し、RNA抽出に進むために最高速度で遠心分離機。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocrine+and+paracrine+control+of+menstruation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The endocrine and paracrine control of menstruation.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidualization+of+the+human+endometrium%3A+mechanisms%2C+functions%2C+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+decidualization+of+the+human+endometrium+in+reproductive+health+and+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure.</a> Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiproliferative+action+of+progesterone+in+uterine+epithelium+is+mediated+by+Hand2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2.</a> Science. 331 (6019), 912-916 (2011).</li>
<li>Wetendorf, M., DeMayo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progesterone+receptor+regulates+implantation%2C+decidualization%2C+and+glandular+development+via+a+complex+paracrine+signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).</li>
<li>Turco, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+hormone-responsive+organoid+cultures+of+human+endometrium+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium.</a> Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).</li>
<li>Kurita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+progesterone+receptors+mediate+the+inhibitory+effects+of+progesterone+on+estrogen-induced+uterine+epithelial+cell+deoxyribonucleic+acid+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis.</a> Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).</li>
<li>Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+action+in+endometrial+cancer%2C+endometriosis%2C+uterine+fibroids%2C+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer.</a> Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).</li>
<li>Bui, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+serum+testosterone+during+the+menstrual+cycle+evaluated+by+daily+measurements+with+an+ID-LC-MS%2FMS+method+and+a+2nd+generation+automated+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay.</a> Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).</li>
<li>Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+endometrial+organoids+respond+to+excess+androgens+associated+with+polycystic+ovarian+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

外因性足場材料を用いずに子宮内膜の上皮細胞と間質細胞からなるヒト子宮内膜オルガノイドを生成した。原発性子宮内膜上皮細胞がオルガノイド6、7を形成できることが既に示されているが、これらの細胞はマウス肉腫細胞によって分泌されるタンパク質のゼラチン状マトリックスに埋め込まれた(材料の表を参照)。球状構造を形成する。また、子宮内膜間質細胞は存在しなかった。我々は、子宮内膜組織の必須支持成分である我々のシステムの間質細胞が、細胞型間で上皮細胞が付着しパラクリンシグナル伝達を行うための足場を提供したと推測する。間質細胞の周りの上皮細胞の組織は、生理学的手がかりを提供した2つの細胞タイプ間の活発な相互作用を示した。子宮内膜のホルモン応答は、上皮細胞と間質細胞4,8,9間のパラクリン相互作用に依存するとして、私たちの多...

ヒト子宮内膜は子宮腔を直線し、移植中に胚の最初の接触として機能する。子宮内膜は、ルミナルおよび腺上皮細胞、支持性間質線維芽細胞、内皮細胞および免疫細胞から構成される。一緒に, これらの細胞タイプは、性ステロイドホルモン1に最も応答性の組織の一つである子宮内膜組織を構成します。.各月経周期の間に起こる変化は顕著です。子宮内膜の適切な成長および改造は、胚移植が起こることを可能にするために必要とされる。エストロゲンおよびプロゲステロンに対する異常な応答は、妊娠の確立を可能にしない難治性子宮内膜をもたらし、子宮内膜新生物を含む疾患をもたらす可能性さえある。
子宮内膜で起こるホルモン応答および本質的な変化を研究するために、手術中または子宮内膜生検中に患者から取り除かれた子宮内膜組織からの細胞は、細胞培養において伝播されている。子宮内膜間質細胞は、好ましく増殖し、容易に伝播し、プロゲステロンによって誘導される分化のプロセスは、インビトロで要約することができる。その結果、この分化プロセスの間に多くのことが学び、デシデュアル化2、3と呼ばれる。しかし、子宮内膜の他の主要な細胞型は、発光および腺上皮細胞は、従来の単層と同様に成長せず、極性を失い、老化し、増殖性が限られている。その結果、ヒト子宮内膜における生物学およびその役割についてはあまり知られていない。多くの新生物が上皮細胞に由来するにつれて、過形成または癌細胞への形質転換に関連するメカニズムは完全に定義されたままである。さらに、研究は、ホルモン応答が子宮内膜4、5の上皮細胞と間質細胞との間の親密なパラクリン作用を伴うことを確立した。
近年、子宮内膜上皮細胞の3次元(3D)オルガノイド培養が、子宮内膜組織から形成されたオルガノイドの最初の報告である2つの独立した基6,7によって確立された。これらのオルガノイドは、タンパク質マトリックス(材料の表)内に埋め込まれた子宮内膜上皮細胞から構成され、子宮内膜子宮内膜の重要なホルモン応答性コンパートメント、間質線維芽細胞を含んでいなかった。マトリックスタンパク質はロットごとに異なり、組織内で必ずしも発生しないシグナル伝達経路を引き起こす可能性があるため、マトリックスタンパク質を子宮内膜の成分に置き換えるのが理想的です。本研究では、ヒト子宮内膜の上皮細胞および間質細胞の足場のないヒト子宮内膜オルガノイドを生成するプロトコルが提示されている。間質細胞の存在は、上皮細胞の支持を提供するだけでなく、子宮内膜ホルモン応答4、8、9のために重要であることが確立された必要なパラクリン作用を提供する.
新しい多細胞子宮内膜オルガノイドは、生成が簡単で、上皮細胞と間質細胞の両方を組み込む子宮内膜のモデルシステムを提供します。これらのオルガノイドは、ホルモンの不均衡や外因性侮辱による腫瘍形成などの疾患の長期的なホルモン変化および初期の事象を研究するために使用することができる。これらのオルガノイドの複雑さは、最終的には、本当に人間の組織生理学を模倣するために、おそらくミオメトリオ細胞を持つ内皮および免疫細胞を含む他の細胞タイプを含むように拡張することができる。

<table><tbody><tr><td>アガロースHS、分子生物学グレード</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>アガロース金型</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>Z764043</td><td>(https://www.microtissues.com/)</td></tr><tr><td>塩化アンモニウム (NH<サブ>4</サブ>Cl)</td><td>アムレスコ</td><td>0621</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-エストラジオール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2257</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ、タイプ II、粉末</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td>コーニング</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>エオシン染色</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>エストロゲン受容体(SP1)、ウサギモノクローナル抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>RM-9101-S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI付きフルオロシールド、組織学封入剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液(HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td>1x カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドを含まない</td></tr><tr><td>ヘマトキシリン染色液</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>3530-32</td><td>改変ハリス製剤、水銀フリー</td></tr><tr><td>ヘパリン溶液</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07980</td><td>が MammoCult 培</td></tr>地に追加 <tr><td>ヒドロコルチゾンストック溶液</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07925</td><td>が MammoCult 培地</td></tr><tr><td>に追加 オルガノイド培地 - Mammocult</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05620</td><td>2 & micro;L / mLヘパリンおよび5 &micro;L/mL ヒドロコルチゾン</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、16% 溶液</td><td>電子顕微鏡</td><td>Sciences 15710</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>プロゲステロン受容体、PgR 1294、非抱合型、培養上清</td><td>Agilent Technologies</td><td>M356801-2</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質マトリックス - Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>精製マウス抗E-カドヘリン抗体</td><td>BD Biociences</td><td>610181</td><td>Clone 36</td></tr><tr><td>組換え抗ビメンチン抗体 [EPR3776]</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr><tr><td>RNA溶解および単離キット</td><td>Zymo Research</td><td>R2060</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム (NaHCO3)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>テストステロン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>86500</td><td></td></tr><tr><td>トリクロームステイン</td><td>アブカム</td><td>ab150686</td><td></td></tr><tr><td>ワックスフィルム-パラフィルム</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr></tbody></table>

多細胞ヒト初等子宮内膜オルガノイドの生成

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

ヒト子宮内膜は、体内で最もホルモン応答性の組織の一つであり、妊娠の確立に不可欠です。この組織はまた、病気になり、罹患率、さらには死を引き起こす可能性があります。ヒト子宮内膜生物学を研究するモデルシステムは、単一細胞型のインビトロ培養系に限定されている。また、子宮内膜の主要な細胞型の一つである上皮細胞は、培養中に生理的形質をうまく伝播したり保持したりしないため、子宮内膜生物学に対する理解は限られています。ヒト子宮内膜の上皮細胞と間質細胞の両方からなる子宮内膜オルガノイドを初めて生成しました。これらのオルガノイドは、外因性足場材料を必要とせず、上皮細胞がスフェロイド様構造を包含し、コラーゲンを産生し分泌する中心の間質細胞と偏光するように特異的に組織化する。エストロゲン, プロゲステロンおよびアンドロゲン受容体は、上皮および間質細胞で発現され、エストロゲンとテストステロンの生理学的レベルで治療は、オルガノイドの組織を促進します.この新しいモデルシステムは、以前は不可能だった方法で正常な子宮内膜生物学と疾患を研究するために使用することができます。

プロトコルの概略図を図 1 に示します。子宮組織は病理学者によって検査された後、手術から得られた。子宮内膜の内層を掻き取ることによってミオメリウムから分離し、子宮内膜組織をプロトコルで概説したように細胞に酵素的に消化した。上皮および間質細胞をアガロース型のマイクロウェルに添加した。培養7日後、オルガノイドをさらに7−14日間EおよびTで処理した。
組織学的処理のために、子宮内膜オルガノイドを含むアガロース型をアガロースで密封し、続いて一晩4%のPFAで固定した。これらの型は、標準的なパラフィン埋め込みのために処理され、組織学、免疫蛍光または免疫組織化学のために切り分けおよび染色された。ヘマトキシリンとエオシン(H&amp;E)染色(図2A)は、外側と中心の細胞を裏打ちする単層の球体を持つスフェロイド状構造を明らかにした。子宮内膜上皮(E-カドヘリン)および間質細胞(ビメンチン)に対する細胞特異的マーカーは、中心に間質細胞を有するオ...

上皮細胞と間質細胞からなるヒト原発性子宮内膜オルガノイドを生成し、天然子宮内膜組織の特性を保持するプロトコルが提示される。このプロトコルは、子宮組織獲得から子宮内膜オルガノイドの組織処理までの方法を記述する。

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

子宮内膜は、ホルモンに応答して毎月変化する組織です。ホルモンの不均衡は、胚の付着を防ぎ、また癌のような病気を引き起こす可能性があります。私たちのプロトコルは、生理学的な方法で女性の体の外で研究できるように子宮内膜を再構築します。この技術の主な利点は、2つのホルモン応答性細胞タイプ、特に体のように組織化して振る舞う上皮細胞と間質細胞で構成される細胞の3D構造を提供することです。オルガノイドは組織の挙動をよりよく模倣することができるので、最終的には異なる薬物をテストするために使用することができます。子宮内膜オルガノイドは、肥満および多嚢胞性卵巣症候群を含む癌の現在知られている危険因子の直接的な影響を研究するために使用することができる。私たちのオルガノイドは、2つの細胞タイプ間のパラクリン作用の重要性を強調しています。十分な量の組織から始めるのが重要です。上皮細胞と間質細胞の適切な密度を得ることは難しい場合があります。また、オルガノイドは非常に小さく、IHC染色で視覚化するのが難しい場合があります。この手順の視覚化は、それらを見た後に理解しやすいいくつかのステップがあるため、重要です。これらには、子宮の適切な組織層を取得し、組み合わせる細胞の適切な密度を取得し、アガロース型を播種することが含まれます。細胞分離を開始する前に、オルガノイドを収容するメーカーの指示に従って1.5%アガロースマイクロモールドを鋳造し、平衡化する。バイオセーフティキャビネットでは、無菌技術を使用して摂氏37度の酵素溶液を調製し、0.2マイクロメートルのシリンジフィルターを使用して溶液を15ミリリットルの円錐チューブにフィルターします。メスを使用して、子宮生検から子宮内膜を削り取り、組織を非常に小さな部分にミンチする。酵素溶液を含む15ミリリットルの円錐管にみじん切りにしたての組織を入れる。キャップを閉じ、チューブの上部をワックスフィルムで包み、汚染を防ぎます。チューブを水浴またはインキュベーターに37°Cで30分間ゆっくりと揺さぶります。この後、50ミリリットルの円錐チューブに20ミクロンの細胞ストレーナーの上に100ミクロンの細胞ストレーナーを積み重ねる。2つのストレーナーを通して溶液をフィルターします。HBSSで15ミリリットル円錐形チューブをリンスし、すべての細胞が収集されていることを確認するために、ストレーナーを通してこの洗浄を入れます。その後、20ミクロンの細胞ストレーナーを新しい50ミリリットルの円錐形チューブに反転させ、1%ペニシリンとストレプトマイシンを補ったオルガノイド培地20ミリリットルで上皮細胞をストレーナーから洗い流します。円錐管を5分間500Gで遠心分離する。採取した間質細胞については、上清を取り除き、赤血球のリシスバッファーの10ミリリットルでペレットを再懸濁します。摂氏37度で10~15分インキュベートします。これらの細胞を500Gで5分間遠心分離する。上清を取り除き、オルガノイド培地の200〜300マイクロリットルでペレットを再懸濁します。収集した上皮細胞の場合は、上清を取り除き、オルガノイド培地の100マイクロリットルでペレットを再懸濁する。1.5%のアガロース型を平衡化した後、アガロース型の外側にあるオルガノイド培地を取り除き、アガロース皿の細胞播種室から培地を慎重に除去できるように組織培養板を傾ける。上皮細胞と間質細胞の懸濁液を顕微鏡で見て、懸濁液にオルガノイド培地を追加し、懸濁液が密度でほぼ等しくなるように一度に100マイクロリットルのみを添加するようにします。次に、間質細胞の一部を上皮細胞の3つの部分と体積で組み合わせます。結合した細胞懸濁液のピペット50マイクロリットルをアガロース型の細胞播種チャンバーに入れる。アガロース型が細胞で満たされたら、24ウェルプレートの井戸に400マイクロリットルの新鮮なオルガノイド培地を慎重に加えます。5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートし、オルガノイド培地500マイクロリットルで2日ごとに培地を交換するようにします。7日後, 上皮細胞と間質細胞の組織を促進するために 0.1 ナノモルエストラジオールと 0.8 ナノモルテストステロンを補うものに培地を変更します。.まず、沸騰させて1.5%のアガロースをPBSに溶解する。液体アガロースを温水のビーカーに入れ、約50°Cまで冷却します。解剖顕微鏡の下で、24ウェルプレートを傾け、慎重にアガロース型の外側から培地をピペットアウトします。次に、アガロース型の内部から慎重に培地をピペットアウトし、オルガノイドを破壊することを避けます。70~75マイクロリットルの暖かいアガロースをアガロース皿のチャンバーに慎重に加え、オルガノイドを乱さないと注意する。プレートを摂氏4度で5分間冷まします。この後、24ウェルプレートの各ウェルに4%パラホルムアルデヒドを加え、密閉されたアガロース型全体を摂氏4度で一晩固定します。翌日、パラフィン埋め込み処理の準備が整うまで、プレートを摂氏4度で70%エタノールに保管します。RNAの単離を開始するには、解剖顕微鏡の下でプレートを見てください。プレートを傾け、慎重にアガロース型のチャンバーから培地をピペットアウトします。新鮮なオルガノイド培地の1ミリリットルをアガロース型に直接強制的にピペット化して、オルガノイドがマイクロウェルから洗い流され、あまりにも多くの気泡を作り出さないように注意する。同じ媒体を使用して、この力強いピペット処理を一度繰り返します。この後、オルガノイドを含む培地をすべて収集する。500Gで遠心分離機をオルガノイドを回収し、RNA抽出に進む。本研究では、内膜の上皮細胞および間質細胞から成るヒト子宮内膜オルガノイドは、外因性足場材料を使用せずに生成される。組織学的処理のために、子宮内膜オルガノイドを含むアガロース型はアガロースで密封され、続いて4%パラホルムアルデヒドを一晩で固定する。これらの型は標準的なパラフィン埋め込み用に処理され、切断され、染色され、神学、蛍光免疫、または免疫体化学のために染色されます。エオシン染色におけるヘマトキシリンは、外側と中央の細胞の単層を有するスフェロイド様構造を明らかにする。子宮内膜細胞、上皮細胞、および間質細胞の細胞特異的マーカーは、中央に間質細胞を有するオルガノイドを取り巻く上皮細胞を明らかにする。子宮内膜生理学のマーカーは、子宮内膜オルガノイドがネイティブ組織の特定の特徴を保持していることを確認する。コラーゲンブルーと細胞を赤く染色するトライクローム染色は、間質細胞が存在する中心内のコラーゲンの存在を示し、天然組織と同様の間質細胞によるコラーゲンの活性産生および分泌を示す。さらに、免疫ヒストリカル染色は、上皮細胞および間質細胞の両方にエストロゲン受容体、アンドロゲン受容体、およびプロゲステロン受容体の存在を明らかにする。下流の実験に十分なオルガノイドを持つために、細胞を密にプレートすることが重要です。これはいくつかの練習を取るでしょう。子宮内膜オルガノイドは、異なる条件下で培養し、免疫組織化学や免疫蛍光染色などの実験のために収穫してタンパク質発現を研究したり、RNAが遺伝子発現を研究するために収穫したりすることができます。私たちの研究室では、子宮内膜がホルモンレベルの変化にどのように反応するかを調査し、子宮内膜過形成や癌につながる可能性があります。これらのオルガノイドをホルモンの長期的な治療に使用し、多嚢胞性卵巣症候群に見られる過剰なテストステロンなどの病理学的条件を追加したり、脂肪細胞からのシグナルを使用して肥満誘発子宮内膜変化を研究することができます。ヒト組織は生体に有害であると考えられ、適切な予防措置を講じることが重要です。

generation-of-multicellular-human-primary-endometrial-organoids

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

オルガノイドの全体の3D構造および細胞内容、ならびに元の組織に似たその表現型は、ここで説明する単一細胞分解能3D画像化プロトコルを使用して捕捉することができる。このプロトコルは、起源、大きさおよび形状が変化するオルガノイドの広い範囲に適用することができる。...

インタクトオルガノイドの単一細胞分解能3次元イメージング

ここでは、原発性新生児マウス精巣細胞から精巣オルガノイドを生成する4つの方法、すなわち、細胞外マトリックス(ECM)およびECMフリーの2Dおよび3D培養環境について説明する。これらの技術は、複数の研究アプリケーションを持っており、体外で精巣の発達と生理学を研究するために特に有用である。...

細胞外マトリックスベースおよび細胞外マトリックスフリーのマウス精巣オルガノイドの生成

我々は、ヒトの歯から出発して上皮オルガノイド培養を開発するためのプロトコルを提示する。オルガノイドは堅牢に拡張可能であり、アメロブラスト分化能を含む歯の上皮幹細胞を再現する。このユニークなオルガノイドモデルは、歯の再生アプローチの視点を持つヒト歯科(幹細胞)生物学を研究するための有望なツールを提供します。...

ヒト歯からオルガノイドを機構研究・再生医療への強力なツールとして確立

このプロトコルは、遺伝子発現および組織学的分析のためのマウス子宮内膜上皮オルガノイドを確立するための方法論を説明しています。...

マウス子宮からの3D子宮内膜オルガノイドの確立

このプロトコールでは、迅速で再現性の高い内胚葉性肝オルガノイド(eHEPO)の生成について説明します。このプロトコルにより、eHEPOは2週間以内に産生され、その差別化と機能を失うことなく長期(1年以上)に拡大することができます。...

機能的肝内胚葉オルガノイドの作製

このプロトコルは、初代ヒト卵巣表面上皮(hOSE)細胞からの三次元(3D)組織オルガノイドの確立を説明しています。このプロトコールには、新たに採取した卵巣からのhOSEの単離、hOSEの細胞増殖、凍結保存融解手順、およびオルガノイドの誘導が含まれます。免疫蛍光、定量分析、スクリーニングプラットフォームとしての有用性の紹介が含まれています。...

組織再生研究のプラットフォームとしてのヒト卵巣表面上皮オルガノイド

ここでは、ラット子宮内膜上皮幹細胞(reESC)を単離して培養し、ラット子宮内膜オルガノイドを作製するプロトコールを紹介します。この方法は、子宮内膜疾患の in vitro...

ラット子宮内膜上皮幹細胞からのラット子宮オルガノイドの作製と特性評価

私たちは、ヒトの頸部オルガノイドを確立し遺伝的に操作するための詳細なプロトコルを提示します。...

ヒト頸部オルガノイドの生成と遺伝的操作

本プロトコルは、制御された三次元培養システムにおいて乳腺形態形成の重要な特徴を再再現するヒト乳房オルガノイドを生成する定義されたハイドロゲルを用いた方法を記述しています。...

乳腺形態形成を再現する三次元ヒト乳房オルガノイドを生成する定義されたハイドロゲルベースの方法

神経上皮組織の前例のない複雑さのために、人間の脳の発達をモデル化することが妨げられてきました。ここでは、ヒトの脳発生の初期のイベントを明らかにし、in...

初期の神経発達障害をモデル化するためのiPSC由来のヒト脳オルガノイドの生成

学ぶ多細胞ヒト初等子宮内膜オルガノイドの生成法。上皮細胞と間質細胞を含む3D構造で、ホルモン応答や子宮内膜がんのリスク因子を研究する生理学的モデルとして薬剤スクリーニングに応用可能です。

多細胞ヒト初等子宮内膜オルガノイドの生成

さらに動画を探す