Name: 多細胞三次元回転楕円体を生成するためのラボオンCDプラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 学ぶ ラボオンCDプラットフォームを用いた遠心マイクロ流体デバイスによる多細胞スフェロイドの作製法。単一細胞および複数細胞タイプの共培養が可能で、高重力条件下での組織工学や創薬スクリーニングへの応用が期待されます。

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この研究は、NRFの基礎科学研究プログラム(2016R1D1A1B0393934418)と生物医療技術開発プログラム(2018M3A9H1023141)によって支援され、韓国政府MSITが資金を提供しました。

1. 遠心マイクロ流体ベースの回転楕円体(CMS)培養チップ製造
<ol><li>CNC加工により、CMSカルチャーチップの上下層用のPC金型を作ります。チップの詳細な寸法を図1に示します。</li>
	<li>PDMSベースとPDMS硬化剤を5分間10:1(w/w)の比率で混合し、デシケータに1時間置いて気泡を除去します。</li>
	<li>CMS培養チップの金型にPDMS混合物を注いだ後、気泡を1時間以上取り除き、80°Cのヒートチャンバーで2時間硬化させます。</li>
	<li>表面を上に接合する真空プラズマクリーナーに入れ、30sで18 Wのパワーでエアアシストプラズマにさらします。</li>
	<li>CMSカルチャーチップの2層を接着し、80°Cのヒートチャンバーに30分間入れ、接着強度を高めます。</li>
	<li>CMS培養チップを121°Cおよび15 psiのオートクレーブ滅菌器で殺菌します。</li>
</ol>2. 細胞調製
<ol><li>5×105-1×106hASCまたはMRC-5s細胞を含むバイアルの1mLを36.5°Cの水浴中で2分間解凍します。</li>
	<li>ダルベッコのオグニドイーグルミディアム(DMEM)をバイアルに1mL加え、1,000μLピペットと軽く混ぜます。</li>
	<li>36.5°Cに前温したDMEMの15mLをピペットを使用して直径150mmのペトリ皿に入れ、バイアルから細胞を加えます。</li>
	<li>1日後、DMEMを吸引し、新鮮なDMEMの15 mLに交換してください。その後、2~3日ごとにメディアを変更します。</li>
	<li>ペトリ皿から細胞を切り離すために、ペトリ皿に4mLのトリプシンを加え、36.5°Cでインキュベーターに入れ、4分間5%CO2に入れます。</li>
</ol>3. 単一培養回転楕円体形成
<ol><li>2.5 mL の 4% (w/v) プロウロン F-127 溶液を CMS カルチャー チップの入口穴 (図 2A)に入れ、チップを 500 ~ 1,000 rpm で回転させ、CMS システムを使用して 4,000 rpm で 3 分間チップを回転させます (図 2B)。 メモ:プルーニックコーティングは、チップの回転中に入口ポートへのセルアタッチを防止します。空気がマイクロウェルに閉じ込めされていないことを確認します。</li>
	<li>5%CO2で36.5 °Cで一晩プロロニック溶液で満たされたCMS培養チップをインキュベートします。</li>
	<li>プレロニック溶液を取り出し、残りのプルロニック溶液をDMEMで洗い流し、チップを12時間乾燥させます。</li>
	<li>CmSカルチャーチップに2.5 mLのDMEMを追加し、チップ内部を前もって3分間約4,000rpmで回転させます。</li>
	<li>回転を停止し、DMEMの100°Lを引き出して、セルサスペンションを注入するスペースを作ります。</li>
	<li>5 × 105 hASC または 8× 105 MRC-5s を含むセル懸濁液を 100 μL 加え、ピペットで 3 ~ 5x のリサスペンション用にセルを均一に分散します。</li>
	<li>チップを3,000 rpmで3分間回転させ、各マイクロウェルのセルを遠心力でトラップします。 メモ:回転速度が過度すぎると、溶液の放出穴を通してセルエスケープが発生する可能性があります。</li>
	<li>36.5°C、>95%湿度、5%CO2でインキュベーターで3日間細胞を培養し、1,000~2,000rpmで回転させる。毎日文化培地を変える。</li>
</ol>4. コカルチャースフェロイド形成
<ol><li>
同心円球状形成
	<ol>
<li>最初のセル、2.5 × 105 hASC を追加し、チップを 3,000 rpm で回転させます。3分後、2番目の細胞、4×105 MRC-5sを加え、3,000rpmで3分間チップを回転させます。細胞が注入されたら、回転速度を500-1,000 rpmにシフトします。</li>
		<li>インキュベーター内の細胞を36.5°C、>95%湿度%、5%CO2で培養し、1,000~2,000rpmで回転させた。同心円回転楕円体は 24 時間以内に作成されます。長期的な文化のために、毎日文化培地を変更します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ヤヌス・スフェロイド形成
	<ol>
<li>チップが500~1,000rpmで回転しながらピペットを取り込み、最初のセルを含む100μLのセル懸濁液を2.5× 10 5 hASCに加えます。次に、チップを3,000rpmで3分間回転させます。</li>
		<li>チップを36.5°C、湿度95%、CO25%で3時間1,000~2,000 rpmで回転させてインキュベートします。</li>
		<li>チップが500~1,000rpmで回転しながらピペットを取り込み、2番目のセルセットを含むセル懸濁液を100μL、4×105 MRC-5sに加えます。次に、チップを3,000rpmで3分間回転させます。</li>
		<li>インキュベーター内の細胞を36.5°C、>95%湿度、5%CO2で培養し、1,000~2,000rpmで回転させた。ヤヌス・スフェロイドは24時間以内に作成されます。長期的な文化のために、毎日文化培地を変更します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
サンドイッチ回転楕円体形成
	<ol>
<li>チップが500~1,000rpmで回転しながらピペットを取り込み、最初のセルを含む100μLのセル懸濁液(1.5×105 hASC)を加えます。次に、チップを3,000rpmで3分間回転させます。</li>
		<li>チップを36.5°C、湿度95%、CO25%で3時間1,000~2,000 rpmで回転させてインキュベートします。</li>
		<li>チップが500~1,000rpmで回転しながらピペットを取り込み、2番目のセルを含む100μLのセル懸濁液を3×105 MRC-5sに加えます。次に、チップを3,000rpmで3分間回転させます。</li>
		<li>チップを36.5°C、>95%湿度%、5%CO2で3時間1,000~2,000 rpmで回転させてインキュベートします。</li>
		<li>チップが500~1,000rpmで回転しながらピペットを取り込み、3番目のセルを含む100μLのセル懸濁液(1.5×105 hASC)を加えます。次に、チップを3,000rpmで3分間回転させます。</li>
		<li>インキュベーター内の細胞を36.5°C、>95%湿度%、5%CO2で培養し、1,000~2,000rpmで回転させた。サンドイッチ回転楕円体は12時間以内に作成されます。長期的な文化のために、毎日文化培地を変更します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 細胞染色
<ol><li>細胞蛍光色素を室温(20°C)まで温める。</li>
	<li>バイアルあたり20μLの無水ジメチルスルホキシド(DMSO)を加えるため、1mM溶液を作ります。</li>
	<li>DMEMを使用して蛍光を1μMの最終作業濃度に希釈します。</li>
	<li>蛍光を細胞懸濁液に加え、ピペットを使用して穏やかに再サスペンドします。</li>
	<li>36.5 °Cで 20 分、湿度 >95%、および 5% CO2をインキュベートします。</li>
</ol>

<ol><li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems%3A+Advantages+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems: Advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li>
<li>Tung, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+3D+spheroid+culture+and+drug+testing+using+a+384+hanging+drop+array%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array.</a> Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).</li>
<li>Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroids+in+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Spheroids in Cancer Research.</a> Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).</li>
<li>Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroidal+culture+of+cytotrophoblast+cells+mimics+the+phenotype+and+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+normal+and+preeclamptic+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies.</a> Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).</li>
<li>Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+force-based+microfluidic+techniques+for+cellular+and+tissue+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).</li>
<li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li>
<li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+culture+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+promotes+cell+yield+and+stemness+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance.</a> Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+spheroids+exhibit+enhanced+in-vitro+and+in-vivo+osteoregenerative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential.</a> Bmc Biotechnology. 14 (1), 105(2014).</li>
<li>Koh, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+microfluidic+platform+for+ultrasensitive+detection+of+botulinum+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin.</a> Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).</li>
<li>Steigert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+hemoglobin+measurement+on+a+centrifugal+microfluidic+platform+for+point-of-care+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators%2C+A%3A+Physical%22%5BJournal%5D)">Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics.</a> Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).</li>
<li>Park, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+centrifugal+microfluidic+device+for+ultrasensitive+protein+detection+from+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e1(2016).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-in-one+centrifugal+microfluidic+device+for+size-selective+circulating+tumor+cell+isolation+with+high+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).</li>
<li>Gorkin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+microfluidics+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Centrifugal microfluidics for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).</li>
<li>Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypergravity-induced+multicellular+spheroid+generation+with+different+morphological+patterns+precisely+controlled+on+a+centrifugal+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform.</a> Biofabrication. 9 (4), (2017).</li>
<li>Rocca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barium+titanate+nanoparticles+and+hypergravity+stimulation+improve+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+into+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).</li>
<li>Genchi, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypergravity+stimulation+enhances+PC12+neuron-like+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

CMSは、注入されたすべての細胞が無駄なくマイクロウェルに入り、従来のマイクロウェルベースの回転楕円体生成方法よりも効率的で経済的なシステムです。CMSシステムでは、チップ内のメディアを取り外すために設計された吸引穴を通して、メディアは12~24時間ごとに交換されます(図3A)。メディア吸引プロセスの間、メディアとマイクロウェルの壁との間の表面張力のために、マイクロウェルの内部からほとんどすべてのメディアが脱出します。PDMS製のチップは弾力性があり柔軟であるため、チップのマイクロウェル領域付近を指で押すことで、閉じ込められたメディアを簡単に取り外すことができます。マイクロウェル内の細胞は、複数のメディアの変更があっても、エスケープすることなく安定したままです。すべての100マイクロウェルで回転楕円体の同じ品質を達成するために、デバイスの回転は偏心してはず、チップは軸対称でなければなりません。そうしないと、可変個のセルが各ウェルに入り、回転楕円体のサイズと形状が異なる場合があります。従来のマイクロウェルシステムでは、空気がマイクロウェルに閉じ込められることが多いため、気泡を除去...

2次元(2D)細胞培養(例えば、従来のペトリ皿細胞培養)よりも3次元(3D)スフェロイド細胞培養で生体内の微小環境で生物学的なシミュレーションを行い、より生理学的に現実的な実験を行う方が簡単です。結果1.現在入手可能な回転楕円体形成方法には、吊り下げ滴法2、液体オーバーレイ技術3、カルボキシメチルセルロース技術4、磁力系マイクロ流体技術5、及びバイオリアクター6.それぞれの方法には独自の利点がありますが、再現性、生産性、および共培養スフェロイドの生成のさらなる改善が必要です。例えば、磁力系マイクロ流体技術5は比較的安価であるが、強磁場が生細胞に及ぼす影響は慎重に検討しなければならない。回転楕円体培養の利点は、特に間葉系幹細胞分化および増殖の研究において、いくつかの研究において報告されている7、8、9である。
集光マイクロ流体システムは、ラボオンCD(コンパクトディスク)とも呼ばれ、内部の流体を容易に制御し、基板の回転を利用するのに有用であり、従って免疫測定法10などの生物医学的用途に利用されてきた。生化学的マーカー11を検出するための比色アッセイ、核酸増幅(PCR)アッセイ、自動血液分析システム12、およびオールインワン遠心マイクロ流体デバイス13。流体を制御する駆動力は、回転によって作成される引力です。さらに、混合、評価、およびサンプル分割の複数の機能は、この単一の CD プラットフォームで簡単に行うことができます。しかしながら、上記の生化学的分析方法と比較して、培養細胞、特にスフェロイド14にCDプラットフォームを適用する試験は少なくなっている。
本研究では、ヒト脂肪由来幹細胞(hASC)及びヒト肺線維芽細胞(MRC-5)の単一培養又は共培養による遠心微流体系回転楕円体(CMS)系の性能を示す。本論文では、当社グループの研究方法論15について詳しく述べている。これにより、スフェロイド培養ラボオンCDプラットフォームを容易に再現することができる。CMSカルチャーチップ、チップホルダー、DCモータ、モータマウント、回転プラットフォームを備えたCMS生成システムを提示します。モーターマウントは、アクリロニトリルブタジエンスチレン(ABS)で3Dプリントされています。チップホルダーと回転プラットフォームは、PC(ポリカーボネート)で加工されたCNC(コンピュータ数値制御)です。モータの回転数は、パルス幅変調に基づいてPID(比例積分微分)アルゴリズムを符号化することにより、200~4,500rpmを制御します。寸法は100mm×100mm×150mmで、重さは860gで取り扱いが容易です。CMSシステムを使用すると、スフェロイドは1 x gから521 x gまでの様々な重力条件下で生成できるため、高重力下での細胞分化促進の研究を2D細胞16、17から3Dに拡張することができます。回転 楕円 体。種々の種類の細胞の共培養も、生体内環境18を効果的に模倣するための重要な技術である。CMSシステムは、様々な構造タイプ(同心円、ヤヌス、サンドイッチなど)の共培養スフェロイドだけでなく、単一培養スフェロイドを簡単に生成することができます。CMSシステムは、単純な回転楕円体研究だけでなく、3Dオルガノイド研究にも利用することができ、ヒト臓器構造を考慮する。

<table><tbody><tr><td>3Dプリンター</td><td>Cubicon</td><td>3DP-210F</td><td></td></tr><tr><td>脂肪由来間葉系幹細胞(hASC)</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-011</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌剤</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>完成した培地と緩衝液の1%を含む</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>10</td></tr><tr><td>mM CellTracker Red CMTPX</td><td>Thermo FisherScientific</td><td>C34552</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>コンピューター数値制御 (CNC) ロータリー彫刻機</td><td>Roland DGA</td><td>EGX-350</td><td></td></tr><tr><td>DC モーター</td><td>Nurielectricity Inc.</td><td>MB-4385E</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコの修飾イーグルの培地 (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (D-PBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td> 完成した中型ヒト肺線維芽細胞<td>の 10% を含んでいました</td></tr><tr><td>(MRC-5)</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Inventor 2019</td><td>Autodesk</td><td></td><td>3D コンピューター支援設計プログラム</td></tr><tr><td>ペトリ皿 & ファイ; 150 mm</td><td>JetBiofill</td><td>CAD010150</td><td>表面処理</td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>ハリックプラズマ</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>プルロニック F-127</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>11/6/9003</td><td>リン酸緩衝生理食塩水で 4% (w/v) 溶液</td></tr><tr>に希釈します<td>ポリカーボネート (PC)</td><td>アクリル</td><td>AC15PC</td><td>200 x 200 x 15 mm</td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン (PDMS)</td><td>Dowcorning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td></td></tr></tbody></table>

多細胞三次元回転楕円体を生成するためのラボオンcdプラットフォーム

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

三次元回転楕円体細胞培養は、2次元細胞培養よりも生体の細胞微小環境をより良くシミュレートできるため、細胞実験でより有用な結果を得ることができる。本研究では、遠心マイクロ流体ベースの回転楕円体(CMS)培養システムと呼ばれる電気モータ駆動ラボオンCD(コンパクトディスク)プラットフォームを作製し、高遠心力を実装する三次元(3D)細胞回転楕円体を作製した。この装置は1 x gから521 x gに重力条件を生成するために回転速度を変えることができる。CMSシステムは直径6cmで、100400μmのマイクロウェルを有し、コンピュータ数値制御機によって予め作られたポリカーボネート型でポリジメチルシロキサンで成形することによって作られています。CMSシステムのチャネル入り口のバリアウォールは、遠心力を使用してチップ内に均等に細胞を広げます。チャネルの終わりに、細胞がマイクロウェルに入ることを可能にするスライド領域があります。デモンストレーションとして、スフェロイドは、システムを用いた高重力条件下でヒト脂肪由来幹細胞およびヒト肺線維芽細胞の単一培養および共培養によって生成された。CMSシステムは、単純な操作スキームを使用して、同心円、ヤヌス、およびサンドイッチの様々な構造の共培養回転楕円体を生成しました。CMSシステムは、単一または複数の細胞型のスフェロイドおよびオルガノイド培養を必要とする細胞生物学および組織工学研究に有用であろう。

直径6cmCMCMS培養チップ(図2)は、上記のプロトコルに従って正常に作られました。まず、チップを最上層と底層とは別に作り、プラズマ結合により結合した。得られた回転楕円体は、チップを取り外すことによって容易に集めることができる。CMSカルチャーチップのチャネルは、入口ポートと中央、スライド、およびマイクロウェル領域で構成されます(図3)。細胞、中、およびプレロン溶液は、直径5mmの入口穴を通して注入される。注入された細胞は、入口ポート領域の再懸濁液3~5倍によって均等に分布する。細胞は中央領域で遠心力を受け、外側に広がる。中央領域はマイクロウェルよりも高いため、より多くのメディアを含むことができ、回転楕円体がより長く生き残ることができます。マイクロウェルの高さは0.4mm、中央領域の高さは1.5mmであり、吸引孔は中央領域の中心に存在し、内部溶液を容易に取り除く。スライド領域は、中央領域とマイクロウェル領域を結ぶ傾斜領域である。細胞は45°の斜面に沿って移動し、細胞が定着し、成長し、回転楕円体を形成するためにもつれが...

細胞回転楕円体を培養できるモータ駆動遠心マイクロ流体装置を紹介する。この装置を使用して、単一または複数の細胞タイプの回転楕円体は、高い重力条件下で容易に共培養することができる。

多細胞三次元回転楕円体を生成するためのラボオンCDプラットフォーム

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

この技術は、迅速な回転楕円体の生成のための先駆的なシステムであるLab-on-a-CDプラットフォームを使用して、個々および複数の細胞タイプから細胞回転楕円体を生成するために使用することができます。この技術は遠心力を使用して細胞を指定されたマイクロウェルに沈着させ、多様なスフェロイドの製造のために複数の細胞タイプの昇順を可能にする。CMS培養チップ製造の場合は、まず、コンピュータ数値制御加工により培養チップの上層と底層にポリカーボネート金型を作ります。次にPDMS塩基とPDMS硬化剤を10対1の比率で5分間混合してから、1時間デシケータに入れ、気泡を除去した。脱気PDMS混合物をCMS培養チップ金型に注ぎ、カビをデシケーターに1時間置いて気泡を取り除きます。2回目の脱気の終わりに、80°Cの熱室で2時間混合物を治してから、表面を上に接着する真空プラズマクリーナーにチップを入れます。培養チップを18ワットの電力で30秒間空気アシストプラズマに露出し、熱室の2層を80°Cで30分間接着して接着強度を高めます。その後、15分間摂氏121度でオートクレーブでCMS培養チップを殺菌します。スフェロイド形成のために細胞を調製するために、穏やかな混合で細胞に1ミリリットルのDMEMを加える前に、摂氏36.5度の水浴中の5つの細胞に5〜10倍10倍を含む1ミリリットルバイアルを解凍する。次に、36.5°C培地の15ミリリットルを含む直径150ミリメートルのペトリ皿に細胞を加え、24時間細胞培養インキュベーターに皿を入れます。翌日、上清を15ミリリットルの新鮮なDMEMに置き換え、細胞をインキュベーターに戻します。細胞を取り外すには、摂氏36.5度と5%の二酸化炭素で4分間トリプシンを4ミリリットルで培養し、細胞が皿の底から持ち上がったときに新鮮な培地との反応を止める。細胞にラベルを付けるには、20マイクロリットルの無水ジメチルスルホキシドをバイアルに加える前に適切な蛍光色素を室温に温め、1ミリモル溶液を得る。DMEMで1マイクロモルの最終的な作業濃度に蛍光を希釈し、穏やかな混合で目的の細胞懸濁液に色素を加えます。その後、細胞を培養インキュベーターに20分間入れます。単一培養スフェロイド形成の場合、まず、1分間に500~1,000回転でチップを回転させながら、CMS培養チップの入口穴に4%プルロンニックF-127溶液の2.5ミリリットルを加える。すべてのソリューションが追加されたら、CMSシステムを使用して1分間に4,000回転でチップを3分間回転させます。回転の終わりに、培養チップを摂氏36.5度で一晩5%の二酸化炭素でインキュベートする。翌朝、Pluronic溶液を取り出し、DMEMで培養チップを洗浄します。クリーンベンチでチップを12時間乾燥させた後、2.5ミリリットルの媒体を入口ポートに加え、チップを毎分4,000回転で3分間回転させます。回転の終わりに、チップが毎分500〜1,000回転で回転している間、入口ポートの媒体の100マイクロリットルを準備されたセル懸濁液の100マイクロリットルに置き換えます。次いで、チップを毎分3,000回転で3分間回転させ、各マイクロウェルの細胞を遠心力でトラップしてから、細胞培養インキュベーターにチップを3日間入れ、毎日実証されるように培地をリフレッシュする。同心円球共培養の生成では、チップが500〜1,000回転で回転している間に、100マイクロリットルの培地中の細胞の最初の集団をチップの入口ポートに追加し、その後毎分3,000回転で3分回転します。回転の終わりに、チップが毎分500〜1,000回転で回転している間に2番目の細胞集団の100マイクロリットルを加え、さらに3分間毎分3,000回転でチップを回転させます。両方の量の細胞が注入されたら、チップを細胞培養インキュベーターに1,000~2,000回転/分で24時間置きます。ヤヌススフェロイド形成の場合、チップが500〜1、毎分000回転、3分で3分、毎分3分回転している間、細胞の最初の集団の100マイクロリットルを追加します。回転の終わりに、細胞培養インキュベーターにチップを入れ、1,000~2,000回転/毎分3時間回転します。インキュベーションの終わりに、細胞の2番目の集団の100マイクロリットルを加え、チップは毎分500〜1,000回転で回転し、チップを毎分3,000回転で3分間回転させます。次に、細胞培養インキュベーターに1,000~2,000回転/毎分24時間置きます。サンドイッチスフェロイド形成の場合、最初のセル集団の100マイクロリットルを追加し、チップは1分あたり500〜000回転で回転し、次に毎分3,000回転で3分回転します。回転の終わりに、チップを1分あたり1,000〜2,000回転で細胞培養インキュベーターの回転子に2時間置き、チップが毎分500〜1,000回転で回転している間に細胞の2番目の集団の100マイクロリットルを加える。チップを3,000 RPMで3分間回転させ、チップをインキュベーターに戻して3時間回転させます。次に、チップが毎分500〜1,000回転で回転する間、最初の細胞集団の100マイクロリットルを追加し、ちょうど12時間実証したように細胞を回転させて培養します。実証されたプロトコルに従って、直径6センチのCMS培養チップを正常に製造することができます。CMS培養チップのチャネルは、入口ポート、中央、スライド、マイクロウェル領域から構成されます。示されるように、個々のCMSチップ内の培養の最初の24時間に対して毎分2,000回転で撮影された2種類の細胞培養のタイムラプス画像は、示されるように、スフェロイドの形成に成功したことを示す。培養3日後のマイクロウェルのイメージングは、スフェロイドが優れた均一性および球形性を示していることを示す。コレントリクス、ヤヌス、サンドイッチ構造を用いた共培養スフェロイドも生成可能です。さらに、7日間高重力にさらされた細胞培養は、生きた/死んだ染色に続いて、ほとんどの細胞がチップ内の長期培養を生き残ることを示している。CMS培養チップの上層と底部の層は、結合時に慎重に整列する必要があり、そうでなければ、各マイクロウェル内の細胞の数が等しくない可能性があります。この研究は、コカルチャースフェロイド研究の参入障壁を下げることができ、例えば、関心のある新薬をスクリーニングするために、コカルチャー研究で広く使用することができる。

lab-on-cd-platform-for-generating-multicellular-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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多細胞三次元回転楕円体を生成するためのラボオンCDプラットフォーム

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