Name: 中央記憶表現型の維持による9日間の主要T細胞の導入と拡張 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学ぶ、ヒト免疫細胞治療のための9日間T細胞導入・拡張プロトコル。レトロウイルスベクターによる遺伝子導入とフローサイトメトリー解析により、中心記憶表現型を維持した治療用T細胞を効率的に製造する方法です。

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この研究は、NIH助成金5R01AI096966(PS、EC、およびEB)、1UM1AI26617(PS、 EC および EB、P51OD011106/P51RR00167 (ER) MN リーチ グラント 5U01HL127479-03 (PS) 1R01A1 43380-01(PSおよびEB)、1UM14126617(PSおよびEC)、およびNIAID内壁研究部門およびNIHインタルム内エイズ標的抗ウイルスプログラムによって提供される資金。これらの研究で使用される抗CD3および抗CD28は、NIH非ヒト霊長類試薬リソース(R24 OD010976、U24 AI126683)によって提供された。これらの研究で使用されるIL-2は、NCI前臨床リポジトリによって提供された。このCD4-MBL CAR/CXCR5プロジェクトの協力者、アリゾナ大学のエリザベス・コニック博士、NIAIDのエドワード・A・バーガー博士、NIHのエドワード・ア・バーガー博士、ウィスコンシン国立霊長類研究センターのエヴァ・G・ラカシュ博士、ミネソタ大学のジェフ・ハート博士、ミネソタ大学のプレティ・ハラン博士、ハーバード大学医学部のレスリー・キーン博士、キャサリン・ボルド博士また、ミネソタ大学のスコット・マクアイヴァー博士、フレッド・ハッチンソンがんセンターのクリストファー・ピーターソン博士、NIHのマシュー・トリベット博士、シアトル小児病院のアグネ・タラセビシウト博士、小児病院のコンラッド・ラッセル・クルーズ博士に感謝します。また、ミネソタ大学のチ・ファン氏とジョマリー・アレグリア=ベロカル氏がガンマレトロウイルス産生を認め、ウィスコンシン大学マディソン校のキム・ワイスグラウ氏がアカゲザルPBMCを隔離したことを感謝しています。

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<li>Ghanem, M. H., Bolivar-Wagers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+chimeric+antigen+receptors+targeting+the+CD4+binding+site+and+high-mannose+Glycans+of+gp120+optimized+for+anti-human+immunodeficiency+virus+potency+and+breadth+with+minimal+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Bispecific chimeric antigen receptors targeting the CD4 binding site and high-mannose Glycans of gp120 optimized for anti-human immunodeficiency virus potency and breadth with minimal immunogenicity.</a> Cytotherapy. 20, 407-419 (2018).</li>
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<li>Connick, E., Folkvord, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+Simian+Immunodeficiency+Virus+Replication+within+Secondary+Lymphoid+Tissues+of+Rhesus+Macaques+Is+Linked+to+Disease+Stage+and+Inversely+Related+to+Localization+of+Virus-Specific+CTL%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of Simian Immunodeficiency Virus Replication within Secondary Lymphoid Tissues of Rhesus Macaques Is Linked to Disease Stage and Inversely Related to Localization of Virus-Specific CTL.</a> The Journal of Immunology. 193 (11), 5613-5625 (2014).</li>
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<li>Ayala, V. I., Deleage, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR5-Dependent+Entry+of+CD8+T+Cells+into+Rhesus+Macaque+B-Cell+Follicles+Achieved+through+T-Cell+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">CXCR5-Dependent Entry of CD8 T Cells into Rhesus Macaque B-Cell Follicles Achieved through T-Cell Engineering.</a> Journal of Virology. 91 (11), e02507-e02516 (2017).</li>
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<li>Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+Through+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Sorting Through Subsets.</a> Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).</li>
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<li>Chambers, C. A., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costimulatory+regulation+of+T+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Costimulatory regulation of T cell function.</a> Current Opinion in Cell Biology. 11 (2), 203-210 (1999).</li>
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</ol>

パメラ・スキナー博士は、MarPamファーマの共同創設者兼最高科学責任者です。

このプロトコルは、抗ウイルスCARを発現するT細胞集団につながるアカゲザルPBMCをトランスデュースするためにガンマレトロウイルスベクターを利用するT細胞免疫療法の生産戦略を概説するCXCR5。合計8日間のex vivo培養時間で、生存可能な機能的なCAR T細胞は、前臨床有効性試験のために非ヒト霊長類への注入に使用される10、21、2222の公開範囲内の量で産生される。10,21
トランスダクションプロトコルの成功は、健康で刺激されたPBMCとガンマレトロウイルスの品質製剤の両方に依存しています。刺激・伝達を成功させるためには、収集後のPBMCの凍結・輸送に適切な注意を払う必要があります。理想的には、細胞が離れた場所に回収された場合、それらは液体窒素で出荷され、すぐに長期液体窒素貯蔵に入れられる。PVCは、ガンマレトロウイルスによって正常に導入されるために、有糸分裂活性である必要があります。抗CD3/抗CD28による刺激後の細胞のクラスタリングを視覚的に監視する必要があります。正しく活動化しないと、低効率の伝達が生じてしまいます。また、刺激された細胞の生存率を監視することも重要です。刺激ステップ後の生存率が悪いと、通常、あまり成功しなかった伝達につながります。ウイルス製剤がラボで製造されるか、外注されるかに関わらず、ウイルスに損傷を与え、トランスダクション効率を損なう可能性のある凍結融解サイクルを避けるために、-80°Cで単独使用アリコートに保存する必要があります。ウイルスは、各実験で一貫した量のウイルスを使用できるように、titeredする必要があります。ウイルスをトランスダクションに使用する場合は、ウイルスを素早く解凍し、必要になるまで氷の上に保存します。プロモーター、エンハンサーおよびエンベロープタンパク質の選択は、標的細胞におけるトランスジーンの伝達効率および発現に全て影響を及ぼす可能性がある。したがって、MOIは経験的に決定されなければならない。また、T細胞やプレートをガス透過ウェルで支えるように設計された培地を使用して膨張させ、細胞の増殖に優れています。しかし、動物に対する細胞膨張率の変動性がある。特定の細胞製剤の伝達および拡大の能力を決定するための試験研究を推奨する。拡張レベルは、小規模および大規模な伝達の両方で一貫しています。
このプロトコルを使用して、我々は試験動物への注入のための2.5 x 109細胞まで生産した。現時点ではプロトコルをスケールアップする必要はないことがわかりましたが、6つのウェルプレートの使用は大規模な細胞調製の制限であり、プロトコルは多くの細胞を生成するために変更を必要とします。潜在的な修飾の例としては、フィブロネクチンコーティング培養袋内でのトランスダクションを行って、細胞のトランスデュース数を増加させ、さらに拡大工程に対してより大きなガス透過性培養容器を利用することが挙げられる。我々はまだこれらの変更を行っていないが、彼らは市販の製品を利用し、現在のプロトコルに可能な変更です。
この方法を用いて、未感染動物、SIV感染動物、抗レトロウイルス療法(ART)で治療されたSIV感染動物から単離されたPBMCから細胞を導入した。しかしながら、ART処理細胞20におけるトランスダクション効率の低下を指摘している。この減少は、薬物による逆転写酵素および/またはインテグラーゼの阻害によるものと考えられていう。ART処理動物からの細胞の導入は、PBMCを収集する前に数日間ARTを停止するか、一般的に使用されているART薬の影響を受けない代替ベクターを使用することによって、ART薬物の細胞内レベルを低下させるなど、このプロトコルの変更を必要とする。
免疫療法のために産生される細胞は、輸液後12を持続させるため、最小分化表現型であることが重要である。細胞の養子移動のための多くのプロトコルは長い培養時間を必要とするが、分化の減少およびCAR T細胞機能13の改善との両方のex vivo培養時間の短縮と相関している。この伝達および拡張プロトコルの比較的急速な時間枠は、免疫療法の可能性20の試験に十分な細胞を産生しながら、所望の中央記憶表現型の維持を可能にする。
このT細胞免疫療法製品の生産戦略の目標は、SIV感染細胞を認識し、B細胞卵胞中のウイルス複製部位にトラフィックし、長期的に生じる動物に持続するT細胞を製造することです抗レトロウイルス薬を必要としない機能的な治療。ヒト免疫療法製品への翻訳のために、このプロトコルは、ヒト特異的抗体およびサイトカインの使用とGMP標準の実施を通じてヒトT細胞をトランスデュースするように変更することができ、機能性の治療法を作り出すHiv。

がんや感染症などの疾患を治療する新しい手段として、細胞免疫療法が生まれつつあります。これらの免疫療法法は、多くの場合、特定の分子を発現する治療細胞を遺伝的に操作することを含む。例えば、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞は、疾患細胞上の分子に特異的に結合する細胞外ドメインを有するCAR分子と、免疫細胞を引き起こすシグナル伝達ドメインを有するCAR分子を発現するように設計されている。CAR T細胞は、がん免疫療法において有効に使用されており、特にB細胞白血病11、2、32,3の治療に有効である。CAR-T細胞はまた、HIVなどのウイルス感染を治療するために開発されています。HIV特異的CARsは、ウイルス感染細胞4の表面上のエンベロープタンパク質を標的とする。免疫療法細胞はまた、特定の組織の位置に治療細胞を標的とするホーミング分子を発現するように設計することができる。我々は、ウイルス特異的CARとリンパ卵胞ホーミング分子CXCR55の両方をトランスデューシングするベクターを開発した。
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)およびシミアン免疫不全ウイルス(SIV)を含むいくつかのウイルスのウイルス複製は、二次リンパ組織におけるB細胞包包内に集中する6。B細胞卵胞は、ウイルス特異的CTLの低レベルが継続的なウイルス複製77、8を可能にする幾分免疫の特権部位である。これらの理由から、CXCR5の発現を通じて卵胞にHIV/SIV特異的T細胞を標的化することは、ウイルス感染細胞99,1010の濾胞貯留層の排除のための戦略である。具体的には、CXCR5共発現を介して、SIV特異的CAR T細胞をB細胞卵胞にターゲットにしています。
このプロトコルでは、CAR/CXCR5をトランスデュースし、治療用注入のための十分な量のCAR/CXCR5 T細胞を産生するためにPBMCを拡大する方法を説明する。これらの方法で導入された細胞は、中央記憶表現型を維持する。研究は、中央記憶T細胞およびT記憶幹細胞のような分化表現型が少ない細胞が、より多くの分化細胞11、12,12よりもより良く持続することを示している。さらに、養子に移された細胞を産生するように設計された多くのプロトコルは、より分化された表現型および減少した持続性13を有する細胞をもたらす比較的長い培養時間を有する。さらに、長い培養時間を有する細胞は、アカゲザル14,15,15の標的リンパ組織の代わりに肺内に蓄積された。ここで説明し、実証する方法では、アカゲザルPBMCsを急速にトランスデュースして拡大し、中央記憶表現型を維持するトランスデューセT細胞を生成します。
CD4細胞とCD8T細胞の両方が免疫療法アプローチに含まれています。この混合細胞集団は、臨床試験において、CD8+T細胞産物中のCD4+T細胞の存在が、CD8+T細胞を注入して16個を持続させる不全と相関したために選択された。ここで説明する方法は、T細胞受容体を強力に刺激し、クローン性アナギー17、18,18を回避するための共刺激シグナルを提供する抗CD3および抗CD28抗体を用いてPBMCを活性化することから始まる。
活性化後、細胞は、ウイルス特異的CARおよびリンパ系ホーミング分子CXCR5をコードするガンマレトロウイルスベクターを用いてトランスタイズされる。その後、トランスデューシー細胞は、基部にガス透過膜を有する非接着細胞伝搬用に設計されたプレートを使用して拡張されます。この膜は、細胞の生存率と栄養の可用性を強化する井戸の底部でのガス交換を可能にします19.これらの方法を用いて、十分な機能細胞をインビボ注入研究のための9日間の時間枠で産生することができる。このプロトコルは、アカゲザルT細胞をトランスデューシングおよび拡張するために設計されているが、種特異的活性化抗体のわずかな改変により、他の種の細胞と共に使用することができる。これらの方法は、以前に発表された研究99、2020に基づいています。

<table><tbody><tr><td>ガンマレトロウイルス製剤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.025% トリプシン、0.01% EDTA</td><td>Gibco</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>293T細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート、処理</td><td>済み CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>熱不活性化FBS</td><td>Hyclone</td><td>Sh30088.03</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Invitrogen</td><td>31985070</td><td>還元血清培地</td></tr><tr><td>pBS-CMV-gagpol</td><td>Addgene</td><td>35614</td><td>パトリック・サーモン博士からの贈り物</td></tr><tr><td>CAR P2A CXCR5 を含む GenScript</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RD114</td><td></td><td></td> からのカスタム オーダー<td>エド・バーガー博士からの贈り物</td></tr><tr><td>T75フラスコ</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-4875</td><td></td></tr><tr><td>VSV-G</td><td></td><td>pMD.G</td><td>スコット・マクアイバー博士からの贈り物</td></tr><tr><td>T cell stimulation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 well plates, untreated</td><td>CytoOne</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD28</td><td>NHP Reagent Resource</td><td>Clone: CD28.2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-macaque CD3</td><td>NHP Reagentリソース</td><td>クローン: FN18</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>アカゲザル PBMC または CD8 T 細胞</td><td>WNPRC</td><td></td><td>初代細胞</td></tr><tr><td> フィブロネクチンコーティング用</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート、未処理</td><td>の CytoOne</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>BSA (フラクション V)</td><td>HyClone</td><td>SH30574.02</td><td></td></tr><tr><td>レトロネクチン (1 mg/ml)</td><td>TaKaRa</td><td>T100A</td><td></td></tr><tr><td>For T cell Expansion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>G-Rex 6 Well Plate</td><td>Wilson Wolf</td><td>P/N 80240M</td><td>Plates with Gas Permeable wells</td></tr><tr><td>Media Components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>b mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>熱不活性化FBS</td><td>Hyclone</td><td>Sh30088.03</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>NCI Preclinical Repository</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo-15 medium</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Variations of Media used</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>basic medium:</td><td>X-Vivo 15培地、10%熱不活化FBS、1 xペニシリン/ストレプトマイシン/ L-グルタミン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>拡張培地:</td><td>増殖培地+ 50 mM bメルカプトエタノール</td><td></td><td></td></tr>成長<tr><td>培地:</td><td>塩基性培地+ 50 IU / ml IL-2</td><td></td><td>抗CD28、IL-2、またはb-メルカプトエタノールの添加による培地の完成は、使用日に行う必要があります。</td></tr><tr><td>Cell counting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess cell countess chambers</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4% solution</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 抗体ラベリングキット</td><td>Invitrogen</td><td>A20186</td><td>MBL 抗体の標識</td></tr>用 <tr><td>抗 CD28-BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>562976</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD3-AF700</td><td>BD Biosciences</td><td>557917</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD4-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>556615</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD8-BV788</td><td>BD Biosciences</td><td>563824</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD95-PerCPCy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>561655</td><td></td></tr><tr><td>抗CXCR5-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1985-42</td><td></td></tr><tr><td>抗MBL</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-40145-S6</td><td></td></tr><tr><td>Flow Analysis software</td><td>FlowJo, LLC</td><td>FlowJo v10</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>Beckman</td><td>CytoFlex</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Near IR</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>その他の機器</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エアロゾルの漏れを封じ込めるためのキャニスター</td><td>ベックマン</td><td>SX4750</td><td>安全装置</td></tr><tr><td>ベックマン・アレグラ 遠心分離機</td><td>ベックマン</td><td>・ステリガード e3</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養インキュベーター</td><td>サーモフィッシャー</td><td>エバーラスト247</td><td></td></tr><tr><td>クラスII 層流フード</td><td>ベイカー</td><td>ヘラセル ヴィオス 160i</td><td></td></tr><tr><td>超安全 使い捨て白衣</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td>・<td>ス359232</td><td>個人用保護具</td></tr><tr><td>バイオ認証カバー付きマイクロプレートキャリア</td><td>ベックマン</td><td>SX4750A</td><td>安全装置</td></tr><tr><td>ロッキングプラットフォーム</td><td>ベンチマーク</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>スイングバケットローター</td><td>ベックマン</td><td>X13-R</td><td></td></tr><tr><td>X-Gen ニトリル手袋</td><td>ジェネシー</td><td></td><td>個人用保護具</td></tr></tbody></table>

中央記憶表現型の維持による9日間の主要t細胞の導入と拡張

Transduction and Expansion of Primary T Cells in Nine Days with Maintenance of Central Memory Phenotype

感染症や癌を治療するための新たな免疫療法は、しばしば、疾患標的タンパク質をコードする遺伝子を用いた細胞集団の導入を伴う。例えば、がんやウイルス感染を治療するキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞は、CAR分子をコードする合成遺伝子を有するT細胞の導入を伴う。CAR分子は、T細胞を特異的に認識させ、癌またはウイルス感染細胞を殺す。細胞はまた、関心のある他の遺伝子と共に導入することができる。例えば、細胞は、細胞を特定の場所に標的とするタンパク質をコードする遺伝子と共にトランスニューシーを行うことができる。ここでは、ウイルス特異的CARおよびB細胞卵胞ホーミング分子ケモカイン受容体5型(CXCR5)をコードする遺伝子を用いて、一次末梢血単核細胞(PBMC)をトランスデューシングするプロトコルを提示する。この手順は9日かかり、その結果、中央記憶表現型を維持するT細胞集団が導入される。中心記憶またはあまり分化された表現型の維持は、細胞の持続性と後注入に関連することが示されている。さらに、この方法で産生された細胞は、高レベルの生存率、2つの導入遺伝子の高レベルの共発現、および免疫療法用注入のための十分な量の細胞を示す。この9日間のプロトコルは、CAR-T細胞および他のT細胞免疫療法アプローチに広く使用することができる。ここで説明する方法は、以前の出版物で提示された研究に基づいています。

細胞製造 この資料で提示された結果は、以前に出版された作品9,,20に似ています。ここで示したプロトコルを利用して、5日目から9日目までの細胞の少なくとも8倍の拡張が期待されます(中央値は11.1倍、範囲は8.7-13倍)。ガス透過性ウェルを5 x106細胞の開始密度で播種し、4日間の成長の後、ウェルあたり55.6 x 106細胞の中央値密度を達成した(範囲43.5-64.8 x 106)(図1A)。Trypan Blue除外を含むセルカウントは、細胞がプロトコル全体で高い生存率を維持していることを示しています(9日目の中央値85.8%、範囲83-95%)(図1B)。我々は、細胞が拡大する能力における動物の変動に動物を見つける。しかし、1日目に50~100 x 106細胞の母集団を作り出すこのプロトコルを用いて、1~2 x 108個のセル/kgのアカゲザル注入に十分な細胞を作り出しました。
トランスデューセド遺伝子の共発現をフローサイトメトリーでモニタリングした(図2A)。この拡張プロトコルの5日目から9日目の間に、トランスデューセドされた細胞の表面上のCARおよびCXCR5の発現は比較的安定であった。5日目の中央値は42.8%(範囲は36.5~46.9%)細胞のうちCD4-MBL CARとCXCR5の両方を導入したが、9日目には中央値の発現が47.6%(範囲44.5~64.5%)であった。1回の伝達のラウンドを有する(図2B)。いくつかのプロトコルは、第二の伝達を必要としますが、プロトコルの終了時に総導入細胞の面で利益を見ていない(データは示されていません)。
細胞表現型 トランスデュース細胞をフローサイトメトリーで解析し、それらの記憶表現型をモニタリングした。導入と拡張の前に、ナイーブ、中央記憶およびエフェクターのメモリ集団が同定される(データは示さない)が、培養によってナイーブ集団は失われ、細胞は主に5日目(図3A)および9日目(図3B)によってCD95+ CD28+発現+によって識別される中央記憶細胞である。+この急速な伝達および拡張プロトコルの使用は、主に中央記憶細胞である細胞を産生し、したがって、試験動物に注入されたときに増殖し、持続する可能性が高い。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60400/60400fig01.jpg"> 図1:この伝達および拡張プロトコルは、高い生存性を持つ豊富な導入細胞を生成する。(A) 6つの異なる動物から6つの異なる動物からガス透過性容器内での増殖性を5日目から9日目に、そして(B)同じ6匹の動物からトランスタイズされたPBMCの生存率。自動セルカウンターを用いたトリパンブルー排除を用いて、細胞数および生存率を監視した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60400/60400fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60400/60400fig02.jpg"> 図2:この伝達プロトコルは、2つの導入された遺伝子の共発現を維持する細胞を産生する。(A) CD4-MBL CARとCXCR5の両方の発現を示す、トランスダクションおよび拡張プロトコルの9日目のアカゲサスPBMCの代表的なフロープロット。(B) リンジサイトメトリーで測定した培養5日目および9日目の6種類の動物からトランスデューセなアカゲスPBMCに対するCD4-MBL CARおよびCXCR5の発現。ゲートは、ライブ、CD3+セルに設定されました。トランスデューサされた細胞は、MBL+ CXCR5+として識別されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60400/60400fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60400/60400fig03.jpg"> 図3:9日間のプロトコルで産生される細胞の大部分は、中央記憶表現型を有する。代表流動サイトメトリープロット(A)日 5 および (B) 日 9 CAR/CXCR5 トランスデューサ アカゲサス PBMC.ゲートは、ライブ、CD3+、CD8+セルに設定されました。中央メモリは CD28+ CD95+と定義されました。エフェクター メモリは CD28-、CD95+と定義されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60400/60400fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

我々は、細胞有効性の注入研究のために十分な数の目的の遺伝子の優れた共発現を有する細胞を得るアカゲザル末梢血単核細胞の導入及び拡張のための9日間のプロトコルを概説する。

中央記憶表現型の維持による9日間の主要T細胞の導入と拡張

Emerging immunotherapies to treat infectious diseases and cancers often involve transduction of cellular populations with genes encoding disease-targeting ...

このプロトコルは、2つのタンパク質を発現する免疫療法用アカゲスT細胞の生産を概説する:抗ウイルスキメラ抗原受容体と、細胞をリンパ球卵胞に標的とするケモカイン受容体CXCR5。この比較的急速な9日間の手順は、動物への注入後に長期的に持続する可能性を持つ、より分化されていない中央記憶表現型を有するT細胞を産生する。この方法をヒト細胞に適応させることで、抗レトロウイルス薬の投与なしにHIVに対する耐久性のある寛解を誘導する可能性のある免疫療法T細胞の産生が可能になる。この方法は、関心のある他のタンパク質を発現するアカゲスT細胞を産生するために広く使用することができる。また、軽微な改変により、ヒトを含む他の種でトランスデューセT細胞を生成するために使用することができる。伝達の成功は健康な刺激されたPBMCに依存する。収集、輸送、および保管には注意が必要です。細胞の刺激を視覚的に評価することは、伝達の前に重要です。プライマリアテウスPBMCを解凍して開始します。少量の氷が残るまで、穏やかな攪拌で37°Cの水浴で細胞をインキュベートします。細胞をコニカルチューブにそっとピペットします。その後、塩基性培地の1ミリリットルでバイアルをすすい、ゆっくりと細胞に加えます。ゆっくりと細胞に暖かい基本的な媒体の追加9ミリリットルを追加.チューブをエアロゾル耐性キャニスターに入れ、600倍gで摂氏22度で5分間遠心分離します。上清を吸引し、少量の成長培地でペレットを再懸濁する。細胞を数えるために、10マイクロリットルのトリパンブルーに細胞10マイクロリットルを加える。チャンバースライドをロードし、カウンターに挿入します。キャプチャ ボタンを押してセルをカウントします。細胞濃度を体積で乗算して細胞の総数を計算し、増殖培地中の1ミリリットル当たり200万個の細胞に希釈する。ミリリットル当たり5マイクログラムの最終濃度に対して、抗CD28を加えます。その後、抗CD3コーティングされたプレートに井戸あたり3〜600万個の細胞をピペット。プレートを摂氏37度と炭酸ガス5%で2日間インキュベートします。遠心分離機を2,000 gで約30分間走して摂氏32度に温めます。一方、37°Cの水浴で無血清と成長培地の両方を暖め、摂氏37度の水浴で穏やかに渦巻いてウイルスを解凍します。その後、氷の上に置きます。ウイルスを無血清培地で所定の最適な感染倍数に希釈する。陰性対照細胞用の培地単独を用いて、フィブロネクチンコーティングプレートの各ウェルに希釈レトロウイルスの2ミリリットルを加える。プレートをマイクロプレートキャリアの前温め遠心分離機に入れ、2時間2,000倍gで遠心分離します。すぐに使用する場合は、ウェルからウイルス製剤を吸引し、2ミリリットルの成長培地を添加する。反転顕微鏡で刺激されたPBMCsを確認します。セルは丸く、明るく、光を屈折させる必要があります。彼らはまた、刺激を示す凝集した外観を持っている必要があります。標的細胞を収集し、50ミリリットルの円錐管に移します。成長培地の1ミリリットルで一度よく各井戸をすすい、チューブにそれを追加します。次に、前に示したようにセルをカウントします。細胞を摂氏32度で5分間600倍gで遠心してペレット状にする。ペレットから培地を吸引し、1ミリリットル当たり150万細胞の濃度で増殖培地中の細胞を再懸濁する。各ウイルスコーティングウェルに細胞懸濁液の1ミリリットルを追加し、ウイルスを受け取らなかったフィブロネクチンコーティングされたウェルにMACトランスデュース細胞を追加します。プレートを摂氏32度で10分間1,000倍にして、摂氏37度、炭酸ガス5%で48時間インキュベートします。アカゲサス細胞やガンマレトロウイルスの使用には、ラボコートや手袋などの個人用保護具を使用する必要があり、バイオセーフティキャビネットで作業を行う必要があります。すべてのピペットと溶液は除染する必要があります。5ミリリットルのピペットを使用して各ウェルの内容物を上下にピペットし、細胞を再中断し、50ミリリットルの円錐管に移します。各ウェルに成長培地の1ミリリットルを追加し、接着細胞を除去するために上下にピペット.次に、前述のようにセルをカウントします。25°Cで10分間600倍gで細胞を遠心分離します。その後、培地を吸引し、1ミリリットル当たり100万細胞の濃度に膨張培地中の細胞を再懸濁する。6ウェルプレートの各ガス透過ウェルに5ミリリットルの細胞を播種し、井戸ごとにさらに25ミリリットルの膨張培地を慎重に重ねます。その後、摂氏37度と5%の二酸化炭素で4日間、邪魔されずに細胞をインキュベートします。ウェルから細胞を収集するには、細胞を乱さないで注意して、メディアの20ミリリットルを除去し、廃棄します。残りの培地を上下にピペットして細胞を取り除く。滅菌移動ピペットを使用して、3ミリリットルの培地で各ウェルをすすい、残留細胞を収集します。次に、それらを数え、セル番号と生存率を確認します。このプロトコルは、6つの異なる動物からの細胞の導入および拡張に使用された。ガス透過性ウェルを500万個の細胞の開始密度で播種し、4日間の成長の後、ウェル当たり5,560万個の細胞の中央値密度が達成された。trypanブルー排除によって監視される細胞の生存率は、プロトコル全体で83〜95%に維持された。フローサイトメトリーを使用して、導入された遺伝子の共発現を観察した。5日目には、細胞の中央値42.8%がCD4-MBL CARおよびCXCR5の両方で導入された。9日目の間、中央値の表現は47.6%で、単一の伝達ラウンドでした。フローサイトメトリーは、メモリ表現型のモニタリングにも使用された。導入と拡張の前に、ナイーブな中央記憶とエフェクターメモリ集団が同定された。ナイーブ集団は培養で失われ、細胞は主に5日目と9日目までに中央記憶細胞であった。このトランスダクションの成功は、高品質の試薬、高生存細胞、および滴定ウイルスの使用に依存し、プロトコルのタイミングに一貫して従う。細胞は、移動およびウイルス抑制アッセイを含む機能アッセイに使用できるだけでなく、免疫療法の有効性をテストするための前臨床試験のための動物への注入のために使用することができる。私たちは、動物のCARおよびCXCR5 T細胞の前臨床試験を進めており、すぐにHIV感染者でこの免疫療法をテストしたいと考えています。

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