Name: マウス脳のマイナート核基底部におけるコリン作動性繊維長の立体的推定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学ぶマウス脳マイナート核基底部におけるコリン作動性繊維長の立体計測法。三次元解析により神経変性の早期検出が可能となり、神経繊維の定量的評価を通じて神経変性疾患の病態理解と治療標的の探索に貢献します。

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この研究は、医学研究開発サービス、退役軍人省(メリットレビュー1I01 BX001067-01A2)、アルツハイマー病協会(NPSPAD-11-202149)、中西部バイオメディカルからのリソースからのW.Z.S.への助成金によって支えられた研究財団。

これらの動物を使用するためのすべての手順は、カンザスシティ退役軍人医療センター機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されています。スウェーデンの突然変異体β-アミロイド前駆体タンパク質(Appswe)とそのC57/BL6 WTリッター類を過剰発現する18ヶ月のマウスが実験に使用された。繁殖とジェノタイピングの詳細は、He et al.8.
1. 灌流および組織処理
<ol><li>ケタミン(100mg/kg)およびキシラジン(10mg/kg)を用いた腹腔内注射を用いてマウスを麻酔する。つま先をつまんで応答の欠如を確認してから9.</li>
	<li>0.1Mのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)の氷冷〜50mLを有する経脈的に浸透し、続いて0.1Mリン酸緩衝液(PB)中に4%パラホルムアルデヒド(PFA)が続く。 注意: PFA は有毒です。PFA を使用する場合は、個人用保護具 (PPE) を使用します。</li>
	<li>脳10を取り除き、4°Cで0.1 M PBの4%PFAに浸漬し、24時間後置きのためにDPBS 3xで洗浄します。</li>
	<li>0.1 DPBSで15%のスクロース溶液に一晩に変更し、0.1 M DPBSで30%のスクロース溶液を4°Cでさらに48時間に変更します。</li>
	<li>スクロース溶液から組織を取り出し、あらかじめ設定されたクライオトームチャンバー内で-20°Cの温度に凍結する。凍結したサンプルは、切り離しまで-80°Cの密閉管に保管することができます。</li>
	<li>最適な切断温度埋め込み媒体に組織を埋め込み(材料表を参照)、試料ディスクに取り付けます。クライオトームを使用してコロナ平面で連続30 μmの厚い部分を切断し、その結果、凍結保護剤溶液(30%グリセロール、30%エチレングリコール、40%DPBS;40%DPBS)を充填した24ウェル培養プレートですべてのセクションを収集します。図 1A–C-20°Cの冷凍庫に保管してください。 注:より厚いセクション(例えば、50 μm)は、可能であれば好ましい。セクションが切断順序に保たれ、すべてのセクションが完全に凍結保護剤であることを確認してください。96ウェルプレートは、セクションを収集するために24ウェルプレートの代替として使用することができます。</li>
	<li>蒸発と乾燥を防ぐためにプレートシーラーで井戸を覆います。プレートは、さらに使用するまで-20°Cで保存してください。-20°Cで保存された切片は、ChAT免疫賦化学に対して数ヶ月間安定である。</li>
</ol>2. IHCの系統的なセクション選択
注: 許容誤差係数(CE)を達成するために必要なセクションの総数を知るためにパイロットスタディを行う必要があります。CE 値は、サンプリング・プロシージャーのエラーの合計量を表す式です。最小値は最小エラーを表し、0.1 未満の CE 値はここで使用されるソフトウェアで許容可能と見なされます (資料表11を参照)。
<ol><li>フランクリンやパキシノスなどの標準的なマウス脳アトラスと形態学的特徴を比較することによって、各脳の最初と最後のセクションを識別します。NBMはブレグマ-0.0mmで始まり、-1.6mmで終わります。したがって、約 50 セクションには NBM が含まれます。セクションの総数は、ステレロジーの間に必要なパラメータの1つです。8番目のセクション(SSF = 1/8)の選択は、分析のための合計6-7セクションを与え、我々のパイロット研究でボリューム推定と繊維長推定の両方に許容可能なCEを得ました。</li>
	<li>最初の 8 つのセクションのうちの 1 つからランダムに開始し、NBM を含む最後の後部セクション (図 1C)まで、8番目のセクションごとにシステム的にサンプリングします。</li>
</ol>3. 免疫学化学
<ol><li>凍結保存されたセクションを凍結保護剤で室温に移し、その後0.1Mリン酸緩衝液(PB)を6つのウェルプレートに移します。</li>
	<li>PBで3倍を洗います。</li>
	<li>メタノール中の0.3%H2O2で15分間インキュベートする。</li>
	<li>トリス緩衝生理処理 (TBS) で 3 倍洗浄します。</li>
	<li>TBSで0.25%トリトンX-100で30分間インキュベート。</li>
	<li>TBSで0.1%トリトンX-100で10%正常牛血清(NBS)で30分間ブロックします。</li>
	<li>4 °Cで0.1%トリトンX-100および1%NBSを有するTBSにおけるヤギ抗ヒトChAT一次抗体の1:1,000希釈(材料表を参照)をインキュベートする。</li>
	<li>室温でTBSで3倍洗います。室温で、さらにすべてのインキュベーションと洗浄を行います。</li>
	<li>ビオチン化牛抗ヤギ二次抗体(材料表を参照)を1時間インキュベートする。</li>
	<li>TBSで3倍に洗います。</li>
	<li>アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体を用いたインキュベート(資料表参照)。</li>
	<li>TBSで3倍に洗います。</li>
	<li>メーカーの推奨に従って、強化されたDABペルオキシダーゼ基質溶液(材料表を参照)を使用して開発します。 注意:DABは発がん性物質の疑いがあります。接触および吸入によって有毒である。DAB を使用する場合は PPE を使用します。</li>
	<li>蒸留水でセクションを数回洗浄し、トリスpH = 7.6に保ちます。</li>
	<li>ゼラチン化スライドにセクションをマウントします。1つの組織からのすべての切片を同じスライドに置くことができます。空気は、セクションを乾燥し、70%、90%、95%、および100%エタノールでそれぞれ5分間2xを脱水し、その後、2つの10分キシレンワッシュでセクションをクリアします。取り付け媒体を使用してセクションをカバースリップします(材料の表を参照)。 注: 退避と消去の処理時間は、断面の厚さに影響します。したがって、すべてのセクションで同じ条件を使用する必要があります。現在の研究では、最終厚みの平均値は21.11±0.45μmであった。</li>
	<li>ヒュームフードのセクションを乾燥させておきます。乾燥セクションは生殖器学のための準備ができている。</li>
</ol>4. ステレロジー
メモ:使用する顕微鏡およびソフトウェアの材料表を参照してください。数値開口(NA)>1.2を使用した浸漬目的は有用であり、必要に応じて使用する必要があります。スライドは、遺伝子型または治療グループに従ってグループ化し、コード化する必要があります。1つの研究のための完全な滅菌学は、同じ人によって行われるべきであり、ステレロジーを行う人は、検査された個々のスライドまたはグループのアイデンティティに対して盲目であるべき1、12、13である。
<ol><li>ソフトウェアで新しい研究を開きます。(ファイル > 新しい研究)[スタディの初期化] ダイアログ ボックスが開きます。マルチレベル(分数ベース) ( 図 2A) を使用して、学習情報を入力します。</li>
	<li>[パラメータ] で [ボリューム] をダブルクリックすると、[ボリューム] ダイアログ ボックスが開きます。対象の機能に名前を付け、[領域ポイントカウント' プローブ] を選択します。[次へ] をクリックします。</li>
	<li>次のパラメータ '長さ' をダブルクリックします。<ol>
<li>機能の名前を指定します (例:'L')球の選択 ' 球 ' プローブを選択し、 [次へ] をクリックします。</li>
	</ol></li>
	<li>次に、[スタディの初期化] ダイアログ ボックスをクリックします。ケース情報を入力します。グループは、調査を開始する前にコード化する必要があります。セクションの総数は、対象領域を含む最初のセクションから、対象領域を含む最後のセクションまでのセクション数です (ステップ 2.1 を参照)。IHC染色のために8区間ごとに選択されたため、断面サンプリング間隔は8である。</li>
	<li>[次へ] をクリックすると[プローブの初期化]ダイアログ ボックスが開き、領域の選択と体積の推定の最小の倍率が自動的に設定されます。設定を確認し、選択した低倍率で関心領域を識別できるかどうかを確認します。「ボリューム」をダブルクリックし、領域ボリューム分率のポイントあたり50,000 μm3を入力します。[完了 ]をクリックします。</li>
	<li>[オブジェクト (高) の倍率] で、[長さ] を 63 倍または 100 倍に設定します。[長さ]をダブルクリックして[長さ- 球] ダイアログ ボックスを開き、球の直径を 10 μm に設定します。 注: ガード ゾーンは、断面の実際の厚さに基づいて決定する必要があります。オペレータは、損傷を避けるために、複数のサイトでセクションの厚さをチェックする必要があります。必要に応じて、断面の厚さに基づいてガードゾーンの厚さを調整します。</li>
	<li>フレーム領域、フレームの高さ、ガード ゾーン、フレーム間隔に適切な値を設定します。 注: これらの値は、スタディ領域のオブジェクト プロファイル(ファイバ)の異種性に依存します。フレーム面積は400μm2、フレーム高さ10μm、ガードゾーンは2μm、フレーム間隔は300μmで、NBMにおける繊維長推定に適したCE値を得られます。パイロット スタディは、次のケースに向かう前に、これらの値を使用して実行する必要があります。</li>
	<li>各手順の後に、ソフトウェアによって提供される指示に従ってください。指示は、ダイアログ ボックスまたは画面下部に表示されます。</li>
	<li>セクション 1 を挿入します。</li>
	<li>低倍率(5x)で、NBMの周囲に任意の境界を作って、対象領域を定義します。ビデオウィンドウの左隅にある[次へ]ボタンをクリックします。指示に従って、すべての緑のポイントがNBMに入っているのを確認します。ポイントは、ポイントをクリックして含めたり除外することができます。 注: NBM の周りに明確な境界を設定する必要はありません。選択は主に調査者が定義しています。NBMのChAT+コリン作動性ニューロンは、内部カプセル(ic)および球状パリダス(GP)で観察することができる。このプロトコルでは、ChAT+コリン作動性ニューロンを持つicとそれらの突起(繊維)およびGP全体がNBMに含まれています(図1D)。</li>
	<li>指示に従い、現在の分数でのファイバー測定の場合は 63x に変更します。[セクションの太さ] ダイアログ ボックスが画面に表示されます。断面の実際の厚さを測定するには、断面の上面と底面を設定します。手動の Z 軸の移動を使用する必要があります。[完了]をクリックします。 注: 領域にファイバーがない場合は、ステップをスキップして次の分数位置に移動できます。</li>
	<li>断面のフレームの高さの上から下に Z 軸をゆっくりと移動し、仮想球プローブのサーフェス上のすべての交差するファイバーをマークします (図 3)。完了したら、[次へ] をクリックして次の場所に移動します。</li>
	<li>すべての分数を完了すると、ソフトウェアは次のセクションを挿入するように求めます。組織の 6 セクションまたは 7 セクションすべてに対して、手順 4.9 ~ 4.12 を繰り返します。<ol>
<li>最後に、CE値を示すケースの結果がソフトウェアによって生成されます (図 4)。CE が許容される場合は、次のケースに進みます。ファイル > 新しいケース.CE が許容できない場合 (図 4A)、ソフトウェアは、いくつかのパラメーターを変更するための推奨事項を提供します。多くの場合、フレーム間隔を小さくすると CE 値が許容範囲に減少します (図 4B)。</li>
	</ol></li>
	<li>すべてのケースを完了したら、ケースとグループごとに結果を生成します ([ファイル|結果] )。</li>
</ol>5. 分析と統計
<ol><li>ソフトウェアは、各サンプルと各グループのデータを提供します。ソフトウェア自体は、SSF、ASF、TSFなどのフラクションを計算し、参照領域(この場合はNBM)の繊維の総参照体積(VREF)および全長(L)を提供します(図4B)。データをエクスポートし、グループ分析間で選択した統計ソフトウェアに保存またはコピーします。表 1に、統計分析の代表的な結果データを示します。総繊維長を参照体積で割って、繊維密度(Lv)を解析します。</li>
</ol>

<ol><li>Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereological+length+estimation+using+spherical+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Stereological length estimation using spherical probes.</a> Journal of Microscopy. 206, Pt 1 54-64 (2002).</li>
<li>Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer+disease%3A+evidence+for+selective+loss+of+cholinergic+neurons+in+the+nucleus+basalis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis.</a> Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).</li>
<li>Davies, P., Maloney, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+loss+of+central+cholinergic+neurons+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease.</a> The Lancet. 2 (8000), 1403(1976).</li>
<li>Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cholinergic+hypothesis+of+geriatric+memory+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction.</a> Science. 217 (4558), 408-414 (1982).</li>
<li>Savonenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Episodic-like+memory+deficits+in+the+APPswe%2FPS1dE9+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%3A+relationships+to+beta-amyloid+deposition+and+neurotransmitter+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer's disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities.</a> Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).</li>
<li>Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+forebrain+degeneration+in+the+APPswe%2FPS1DeltaE9+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse.</a> Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).</li>
<li>Stokin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonopathy+and+transport+deficits+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).</li>
<li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GRK5+Deficiency+Leads+to+Selective+Basal+Forebrain+Cholinergic+Neuronal+Vulnerability%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability.</a> Scientific Reports. 6, 26116(2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab+Animal+Research.+Anesthesia+Induction+and+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMouton%2C+PR+%22Unbiased+Stereology-A+Concise+Guide%22">Unbiased Stereology-A Concise Guide</a>. , Johns Hopkins University Press. (2011).</li>
<li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+started+in+stereology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Getting started in stereology.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).</li>
<li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Space+Balls+Revisited%3A+Stereological+Estimates+of+Length+With+Virtual+Isotropic+Surface+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49(2018).</li>
<li>Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+capillary+network+of+aged+APPswe%2FPS1dE9+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice.</a> Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).</li>
<li>Gutierrez-Jimenez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbances+in+the+control+of+capillary+flow+in+an+aged+APP%28swe%29%2FPS1DeltaE9+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).</li>
<li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology--reconsidered%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">The efficiency of systematic sampling in stereology--reconsidered.</a> Journal of Microscopy. 193, Pt 3 199-211 (1999).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+study+of+the+capillaries+within+the+white+matter+of+the+Tg2576+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain and Behavior. 9 (4), 01268(2019).</li>
<li>McNeal, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+Stereological+Analysis+of+Reactive+Astrogliosis+to+Estimate+Age-Associated+Cerebral+White+Matter+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury.</a> Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+%28amyloid-beta%29+immunotherapy+attenuates+monoaminergic+axonal+degeneration+in+the+AbetaPPswe%2FPS1dE9+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 23 (2), 271-279 (2011).</li>
<li>Gagnon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Sprouting+of+Dopamine+and+Serotonin+Axons+in+the+Pallidum+of+Parkinsonian+Monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys.</a> Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38(2018).</li>
<li>Boncristiano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+changes+in+the+APP23+transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis.</a> Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).</li>
</ol>

著者たちは開示するものは何もない。

ここでは、スペースボール(球)プローブを用いてNBM中のコリン作動性繊維の密度を推定する方法を示す。このプローブは、対象領域の総繊維長を推定します。全長を領域の体積で割って、繊維密度を取得できます。リージョンのボリュームを推定するには、カバリエリポイント数法を使用しました。カバリエニポイント数法は、任意のリージョンの3D参照ボリュームの公平で効率的な推定値です。この方法では、点を数え(面積分率を表す)、分析された2つの断面間の距離を乗じて、断面の切断面の面積の推定値を計算します。この方法は、労働集約的で、関心のある領域の周囲の正確なトレースを必要としません。光学分画器と組み合わせて細胞や繊維の密度を推定します。
立体分析には、正確なサンプリング方法が必要です。関心のある脳領域は、染色で適切に定義する必要があります。NBMは、フランクリンとパキシノスのマウスアトラスあたりAPブレグマ-0.0 mm〜-1.6 mmの間に位置しています。免疫組織化学の場合、セクションは系統的にランダムに選択されるべきであり、これは最初のセクションをランダム...

脳内神経線維の長さおよび/または密度の定量的推定は、神経病理学的研究の重要なパラメータである。様々な脳領域におけるコリン作動性、ドーパミン作動性、およびセロトニン作動性軸索の長さは、しばしばその領域の特定の機能と相関する。これらの軸索の分布は一般的に不均一であるため、設計ベースのステレロジーは、サンプリング中のバイアスを回避するために使用されます。ステレロジーの宇宙ボールプローブは、関心のある領域で神経線維などのライン状構造の効率的かつ信頼性の高い対策を提供するように設計されている1.プローブは、組織に体系的に課せられる仮想球を作り、プローブの表面との線の交差を測定する。分析のために球プローブを組織に入れることは不可能であるため、市販のソフトウェアは、基本的には球プローブの表面を表す様々な直径の一連の同心円である仮想3次元(3D)球を提供します。
選択的コリン作動性神経変性は、アルツハイマー病(AD)2、3、4の一貫した特徴の1つである。機能不全のコリン作動性伝達は、ADにおける認知機能低下の原因因子と考えられている。コリン作動性機能不全は、パーキンソン病、中毒、統合失調症などの他の多くの精神障害でも明らかです。コリン作動性神経変性の異なる態様は、動物モデル(例えば、アセチルコリン5の減少、ChATタンパク質6、アミロイドプラーク6付近におけるコリン作動性繊維神経変性、及びコリン作動性繊維およびシナプス変動性の減少7、8)において研究されている。繊維変性は神経細胞の損失よりも早く起こると考えられています, コリン作動性神経細胞の損失は、常に研究で観察されないので、コリン作動性ニューロンのほとんどは基底脳と脳幹にあり、その軸索は皮質や海馬などの様々な脳領域に投影する。NBMは基礎前脳に位置し、ADで一般的に影響を受ける脳領域の1つであることがわかりました。
分数体の分数法は、複数のレベルでの組織の系統的ランダムサンプリングに基づいています。セクションサンプリング分率(SSF)は、フラクテレータ法のステラゲオ法に対する非コンピュータベースの系統的な断面サンプリングである。エリア サンプリング分数(ASF)は、セクション内の対象領域の領域の分数です。厚さサンプリング分率(TSF)は、断面の厚さの分画です。スペースボールプローブを使用すると、分画された位置にある3D球体の関心プロファイルを定量化できます。ここでは、マウス脳のNBMにおけるコリン作動性繊維の全長を推定するスペースボールプローブを用いて、手順を説明する。現在のプロトコルは、組織処理、ステレロジーのサンプリング方法、ChAT抗体を用いた免疫組織化学染色、およびマウス脳のNBMにおけるコリン作動性繊維長と繊維密度を推定する非バイアスステローロジーに関する詳細を提供します。

<table><tbody><tr><td>ABCキット</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>抗ChAT抗体</td><td>米国マサチューセッツ州ミリポア</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>ウシ抗ヤギ IgG-B</td><td>Santacruz Biotechnology</td><td>SC-2347</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清、成人</td><td>Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス、米国</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>Lieca Microsystems、イリノイ州</td><td></td><td></td>バッファローグローブ</tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>324558</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Immpact-DAB kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK4105</td><td>強化型DABペルオキシダーゼ基質溶液</td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>ウェストワード・ファーマシューティカルズ社、ニュージャージー州、米国</td><td>0143-9509-01</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Lieca Microsystems社、イリノイ州バッファローグローブ、米国</td><td>AF6000</td><td>電動ステージとIMI-techカラーデジタルカメラを装備</td></tr><tr><td>最適な切断温度(O.C.T.)埋め込み媒体</td><td>電子顕微鏡科学、ペンシルバニア州、米国</td><td>62550-12</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Permount mounting medium</td><td>Electron Microscopy Sciences, PA, USA</td><td>17986-01</td><td></td></tr><tr><td>Stereologer Software</td><td>Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA</td><td>Stereologer2000</td><td>デルのデスクトップコンピュータにインストール済み。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>T1503</td><td>Tris base</td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,</td><td>USA T5941</td><td>Tris hydrochloride</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>バイエル、レバークーゼン、ドイツ</td><td>Rompun</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes, Histological grade</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis,MO</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス脳のマイナート核基底部におけるコリン作動性繊維長の立体的推定

Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain

様々な脳領域におけるコリン作動性または他の神経軸索の長さは、しばしば領域の特定の機能と相関している。ステアロジーは、様々な脳構造の神経細胞のプロファイルを定量化するのに有用な方法です。ここでは、基礎前脳のメイナート核(NBM)の基底にあるコリン作動性繊維の全長を推定するソフトウェアベースのステレロジープロトコルを提供します。この方法では、長さの推定にスペース ボール プローブを使用します。コリン作動性繊維は、西洋ワサビペルオキシダーゼ-ジアミノベンジジン(HRP-DAB)検出システムを用いたコリンアセチルトランスファーゼーション酵素(ChAT)免疫染色によって可視化される。染色プロトコルは、ステレロジーソフトウェアを用いた様々な脳領域における繊維および細胞数の推定にも有効である。このステレオロジープロトコルは、絨毛ノセプティブ繊維、ドーパミン作動性/カテコールアミン作動性繊維、セロトニン繊維、アストロサイトプロセス、あるいは血管プロファイルなどの任意の線形プロファイルの推定に使用できます。

代表的な結果を表 1および図 5に示します。APweグループ(APP)としてデコードされたグループCは、野生型(WILD)のリッターメートと比較して、ファイバ長(図5B)およびファイバ長密度(図5C)が有意に低かった。結果は、分析した2つのグループ間でNBMの体積に有意差がないことを示した(図5A)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60405/60405fig1.jpg"> 図1:本研究で用いた組織処理およびサンプリングの図。</stron...

脳領域の三次元構造内の神経線維の長さは、特定の神経構造の完全性または変性を定量化する信頼できるパラメータである。本稿では、マウスにおけるマイナート核内のコリン作動性繊維長を測定する立体定量法を例に説明する。

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a ...

多くの神経疾患における神経否定は、細胞の身体喪失の前にしばしば神経線維喪失が起こる慢性プロセスである。3次元の神経線維の立体的定量化は、早期の神経変性変化を検出するための敏感で正確な方法を提供する。この技術は、スペースボールの信頼性と効率的なコンピュータベースの公平な分別を利用して、3Dの神経線維のような線状の構造の長さを測定します。この手順のデモンストレーションは、ポストドクでステテロロジーの専門家であるプラバカール・シンと、私の研究室の研究アシスタントであるデビッド・ペンによって行われます。麻酔マウスのペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、約50ミリリットルの氷冷0.1モルDPBSを経頭方向に透過し、続いて0.1モルPBSで約25ミリリットルの4%PFAを続ける。灌流の終わりに、摂氏4度で24時間新鮮な4%PFAの容器に脳を後固定する。翌日、洗い込みごとに新鮮なDPBSで3回1〜2分の洗浄で脳を洗い、脳を一晩で0.1 DPBS溶液で15%スクロースに移します。翌朝、脳を30%スクロース溶液に入れ、摂氏4度で48時間0.1モルDPBSを入れます。インキュベーションの最後に、脳を低温室に移し、マイナス20度に設定します。脳は密閉チューブに保管し、マイナス80°Cで保存することができます。切削のために、最適な切断温度埋め込み媒体にティッシュサンプルを埋め込み、試料ディスクにサンプルを取り付ける。その後、クライオトームのコロナ平面で30マイクロメートルの厚さの連続セクションを取得し、マイナス20°Cの貯蔵に備えて、凍結保護剤溶液を含む24ウェル培養プレートの個々の井戸に各セクションを移管する。各脳の最初と最後のセクションを識別するには、標準的なマウス脳アトラスと形態学的特徴を比較します。NBM はブレグマから 0.0 ミリメートルを引いたから始まり、マイナス 1.6 ミリメートルで終了します。8番目のセクションを選択すると、合計6〜7個のセクションが生成され、体積と繊維長の両方の推定に適切な誤差係数が得られます。組織切片の免疫組織化学的標識の場合、トリス緩衝生理食動物中の0.1%トリトンX-100で10%正常ウシ血清による非特異的結合を遮断した後、摂氏4度で48時間対象の一次抗体を切片に標識する。インキュベーションの終わりに、洗浄ごとに新鮮なトリス緩衝生理食動物で3分間セクションを3回洗浄し、続いて室温で1時間適切なビオチン化二次抗体をインキュベートします。インキュベーションの最後に、実証されているように新鮮なトリスバッファー生理食い物で3回セクションを洗浄し、続いてメーカーのプロトコルに従ってアビジンビオチンペルオキシダーゼ複合体およびDABペルオキシダーゼ基質溶液で染色します。洗浄後、1つの脳組織サンプルのすべての切片を1つのゼラチン化スライドに取り付け、サンプルを空気乾燥させます。セクションを脱水するには、示されているように、サンプルを1希釈あたり5分間、順次上昇エタノール溶液に浸し、続いて2回10分間のキシレンを溶解してクリアします。次に、適切な取り付け媒体を使用して、スライド上にカバーリップを配置します。ステレロジーのために、ソフトウェアの新しい研究を開きます。スタディの初期化ダイアログボックスが開きます。スタディ情報を入力し、複数レベルの分数ベースが選択されていることを確認します。ボリュームをダブルクリックして、音量ダイアログボックスを開きます。対象のフィーチャに名前を付け、リージョン ポイント カウント プローブを選択して、[次へ] をクリックします。長さをダブルクリックし、フィーチャーの名前を指定します。球プローブを選択し、[次へ]をクリックします。ケース初期化ボックスで、スタディを開始する前にグループをコーディングするには、対象領域を含む最初のセクションから、対象領域とセクションサンプリング間隔を含む最後のセクションまでのセクションの総数を 8 に設定します。次をクリックしてプローブ初期化ダイアログボックスを開き、リージョンの選択と体積の推定値の最小倍率を自動的に設定し、設定を確認します。[プレビュー]をクリックして、選択した低倍率で対象領域を識別できるかどうかを確認します。領域の体積分率にポイントあたり 50,000 マイクロメートルの立方体を入力し、[プレビュー]をクリックして完了します。[オブジェクトの高倍率]の下で、長さを 63 倍に設定し、ダブルクリックすると、長さの球体ダイアログ ボックスが開きます。この球の直径を10マイクロメートルに設定し、クリックします。フレーム領域、フレームの高さ、ガード ゾーン、およびフレーム間隔に適切な値を設定します。次へをクリックし、ソフトウェアによって提供される指示に従います。最初のセクションを挿入するには、スライドを 5X の目的の下で顕微鏡のステージに配置し、緑色の矢印をクリックして NBM の周囲に任意の境界を描画して対象領域を定義します。緑色の矢印をクリックして、63Xの目標を変更して、現在の分数のファイバー測定値を取得します。セクションの太さダイアログボックスが表示されます。手動z軸フォーカスノブを使用してセクションの実際の厚さを測定するためにセクションの上面と下面を設定し、完了をクリックします。断面のフレーム高さで Z 軸を上から下にゆっくりと移動して、仮想球プローブの表面上のすべての交差するファイバーをマークします。すべてのファイバーがマークされたら、次の位置に進むには、次のボタンをクリックします。すべての分数が完了したら、緑の矢印をクリックします。ソフトウェアは、次のセクションを挿入するように求めます。スライド上の次のサンプルを5Xの目的を使用して焦点を合わせ、ちょうど実証したようにファイバー測定を繰り返します。すべてのセクションが測定されると、エラー値の係数を示すケースの結果が生成されます。誤差係数が許容される場合は、次のケースに進みます。エラー係数が許容されない場合、ソフトウェアは、いくつかのパラメータを変更するための推奨事項を提供します。すべてのケースが完了したら、各ケースとグループの結果を生成します。この代表的な実験では、スウェーデンの変異型βアミロイド前駆体タンパク質群は、野生型のごみ合致物と比較して、繊維長および繊維長密度が有意に低い結果を示した。結果はまた、分析された2つのグループ間のNBMの体積に有意な差がないことを示した。この技術は、適切な方向での取得とインキュベーション期間と良好な染色方法を必要とします。ステレロジープロトコルは、他の神経線維、アストロサイトプロセス、あるいは血管プロファイルなどの線形プロファイルの推定に使用できます。

stereological-estimation-cholinergic-fiber-length-nucleus-basalis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、マウス蝸牛の特定の領域にあるリボンシナプスを評価する方法を示します。免疫染色と共焦点イメージング技術を利用して、各蝸牛回転の異なる周波数領域にわたる機能的なシナプスを同定します。...

マウス蝸牛の特定の周波数領域におけるリボンシナプスの評価

このビデオは、マウス脳切片のMeynert領域の基底核におけるコリン作動性線維の免疫組織化学的染色を示しています。切片をブロックし、一次対コリンアセチルトランスフェラーゼで処理し、続いてビオチン化二次抗体で治療します。アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体が添加され、これが二次抗体に結合し、続いて発色基質が添加されます。その後、切片を脱水してマウントし、顕微鏡で視覚化します。...

マウス脳のMeyner基底核における神経線維の免疫組織化学的染色

神経筋接合部(NMJ)は、シナプス不全に至ることもあるさまざまな条件で変化します。本稿では、このような構造変化を定量化するための蛍光顕微鏡法について述べる。...

神経筋接合部：測定シナプスサイズ、断片化および共焦点蛍光顕微鏡を用いてシナプスタンパク質の密度の変化

このプロトコルは、成体マウスの適応行動と脳修復の根底にある環境誘発性の脳変化を研究するための、2つの異なる環境操作と同時脳注入プロトコルを説明しています。...

成体マウスにおける中脳ドーパミンニューロンの数の環境モジュレーション

ここでは、in vitroでの脊髄固有の接続の機能的再生を研究するために、マルチ電極アレイ上で培養脊髄スライスに基づいてされているプロトコルを提示します。...

マルチ電極アレイ上に成長させた器官脊髄共培養における機能的再生の調査

我々は、in vitroでの調製物を用いて脳核に順行性または逆行性トレーサー注射を介して、神経細胞とそのプロセスを標識する技術が記載されています。我々 は 、nラベリング精度を高めるために、蛍光標識されたマウスの変異体および基本光学機器を利用して、トレーサーエレクトロ体 ​​外 I既存の方法を変更しました。...

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

この作品には、標準的な顕微鏡装置 (すなわち、光学顕微鏡 (x、y、z のモーターを備えられたオブジェクト テーブルを使用してマウス中脳ドーパミン作動性神経細胞数の公平な薬剤推定手順プロトコル平面)、およびデジタル画像解析のためのパブリック ドメイン...

光分留と標準的な顕微鏡装置を用いたマウス中脳のドーパミン作動性ニューロン数の薬剤の評価

本原稿は、正常マウスにおけるリボンシナプスの形態学的特徴および機能状態を評価するための実験プロトコルについて説明する。本モデルは、騒音誘発および加齢性共生性シナプトパシー制限モデルにも適している。以前のマウス研究の相関結果についても議論する。...

マウスコクレアの特定周波数領域におけるリボンシナプスの形態学的および機能的評価

画像を分析する人工知能(Ai)の使用は、一般的に使用される方法と比較して、強力でバイアスが少なく、迅速なアプローチとして浮上しています。ここでは、細胞小器官、一次繊毛を認識し、厳密かつ再現可能な方法で長さや染色強度などの特性を分析するためにAiを訓練しました。...

一次繊毛の評価に対する人工知能のアプローチ

マウスの脳部位を標的とする定位手術は、一般に頭蓋骨を介したアクセスを含み、頭蓋骨のランドマークによって導かれる。ここでは、脳幹のランドマークの直接可視化に依存する大槽 マグナを介して...

マウスのCisterna Magna を介して 尾側脳幹および上部頸椎脊髄をマイクロインジェクションする定位的外科的アプローチ

脈管筋は内蝸牛電位の生成に不可欠です。ここでは、単核シーケンシングまたは免疫染色のための成体マウス脈条血管の解剖を紹介します。...

単核シーケンシングまたは免疫染色のための成体マウス脈条血管の解剖

学ぶマウス脳マイナート核基底部におけるコリン作動性繊維長の立体計測法。三次元解析により神経変性の早期検出が可能となり、神経繊維の定量的評価を通じて神経変性疾患の病態理解と治療標的の探索に貢献します。

マウス脳のマイナート核基底部におけるコリン作動性繊維長の立体的推定

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