Name: 出芽酵母SNX-BARヘテロダイマーの発現、精製、リポソーム結合 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学ぶ SNX-BARヘテロダイマーの発現・精製・リポソーム結合法。出芽酵母を用いて膜再構成タンパク質の生化学的特性を解明し、脂質特異性と膜動態の理解に貢献する実験手法を習得できます。

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本書で報告された研究は、国立衛生研究所総合医科学研究所が受賞番号GM060221の下で、また国立研究所総合医科学研究所によって一部支援された。賞番号T32GM007223の下で健康の。R.C.はUNC-シャーロット教員研究助成プログラムの一部で支援されました。

1. 酵母ひずみ構造
<ol><li>TVY614(pep4Δ::LEU2 prb1Δ::hisG prc1Δ::HIS3)11から始めます。この株は、細胞分解後のタンパク質分解の大部分に寄与する空胞プロテアーゼに欠乏し、したがって、よりクリーンで効率的な精製を可能にする。</li>
	<li>設計プライマー12と相同組換えを用いてAtg20(SNX-BAR ORF1)のC末端でタンデム親和性精製(TAP)タグを統合する。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して統合を確認します(図2)。</li>
	<li>TAPタグに対してウェスタンブロットのセル溶解を実行し、適切な統合13を確認する。 注:SDS-PAGEおよびウェスタンブロット検証のために3つのOD(1 OD ≥ 1 x 107細胞)の細胞を収穫することをお勧めします。TAP タグの統合は、内因性プロモーターを GAL1 プロモーターに置き換える前に発生し、ウェスタンブロットを介した TAP タグ検証を容易にすることに注意してください。</li>
	<li>内因性Snx4(SNX-BAR ORF1)およびAtg20(SNX-BAR ORF 2)プロモーターを、個々のORF 14の逐次相同組換えおよび変換ステップを使用して、タグなしGAL1プロモーターに置き換えます。</li>
	<li>統合サイトの外部でフランキング プライマーを使用して、統合が成功したことを PCR で確認します (図 2)。これは、成長培地中にガラクトースがない場合に標的SNX-BARのヌル表現型をもたらす。</li>
</ol>2. 酵母誘導とSNX-BARダイマー精製
注:酵母細胞は、染色体的に統合された改変として、標準的なYPD(酵母エキス、ペプトン、および2%グルコース)寒天プレート上に伝播することができる。
<ol><li>標準YP(酵母エキスとペプトン)培地の50 mLに細胞の大きな綿棒を接種し、フラスコ中の炭素源として2%ラフィノースと0.1%グルコースを少なくとも4倍の培養量にし、30°Cシェーカーで一晩成長させて適切な通気を可能にする。この培地の成長は、標準的なYPDに比べて遅くなると予想されます。</li>
	<li>翌朝、50 mLの前培養を使用して、2%ラフィノースと0.1%のグルコースを有する標準YP培地の1Lに接種し、30°Cシェーカーで4〜5時間成長させます。 注:1L培養を接種するために使用されるプレカルチャーの体積は、前培養のOD600に応じて調整され得る。接種後の1L培養物のOD600は、4〜5時間成長中に少なくとも2倍を可能にするために約0.2でなければならない。<ol>
<li>適切な通気を可能にするために成長のためにバッフルフェルンバッハフラスコを使用して、2.8 Lボリュームフラスコで十分です。通気が少ないと、収穫時に成長が遅くなり、細胞ペレットが小さくなることがある。</li>
	</ol></li>
	<li>OD600をチェックして、培養が4~5時間の成長後にログフェーズ(0.5-1)にあることを確認します。ひずみの成長に応じて、少なくとも2倍にできるように成長時間を調整します。2%ガラクトースに加え、30°シェイカーで一晩成長します。 注:一晩の成長後のOD600は変化し得るが、培養は飽和すべきである。この増殖プロトコルに2%ガラクトースを添加する前に、細胞を0.1%グルコースから除去する必要はないことに注意してください。検証のためにSDS-PAGEとウェスタンブロットのために、このステップで未誘導および誘導細胞の3つのODを収穫することをお勧めします(図3A、B、レーン1-2)。</li>
	<li>4500 x gで15分間遠心分離して細胞を収穫する。ここでは、1 L ボリュームカルチャーに対応するスイングバケットローターを使用できます。</li>
	<li>酵母ペレットを50mL円錐管に移します。必要に応じて2番目の遠心分離工程を実行してもよい。細胞ペレットは、一般に、卒業マーキングによって測定された体積で約10〜15mLであり、すぐに使用するか、-80°Cで保存することができます。<ol>
<li>15 mL精製バッファー(50 mM Tris pH 7.4、300 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、1mM ジチオスレイトール(DTT)、プロテアーゼ阻害剤カクテル)でペレットを再サスペンドし、約30mLの最終体積を作る。</li>
	</ol></li>
	<li>使用前にホモジナイザー4°Cを冷やし、精製バッファーで平衡化する。機械的細胞破壊体またはホモジナイザーを用いた細胞をライゼする。ホモジナイザーにサンプルをロードし、2-3ラウンドのために20,000-25,000 psiでlyse;細胞がリンパが出るにつれて、20,000-25,000 psiを維持するために、より多くの入力圧力が必要になることに注意してください。氷上の50 mL円錐形チューブで細胞リサートを収集します。 注:追加のサンプルを洗浄する必要がある場合は、次のサンプルをロードする前に、ホモジナイザーを完全に洗浄して平衡化する必要があります。すべての細胞リシスを氷の上に置いてください。</li>
	<li>直ちに35,000 x gで細胞リサートを4°Cで1時間クリアします。慎重に新しいチューブに上清を転送します。細胞リシスからの脂質は遠心分離中に上部に浮遊し、精製に影響を与えないことに注意してください。 注:SDS-PAGEサンプルのリサートとペレットの0.5-1%を保存することをお勧めします。典型的には、大きな違いは観察されず、TAPタンパク質溶解性を確認するために追加のウェスタンブロットが行われ得る(それぞれ図4、レーン1および2)。</li>
	<li>精製バッファーを用いてIgGセファロースビーズの300μLを平衡化する。クリアした細胞リジン酸塩に加え、2時間インキュベートし、4°Cで回転させる。</li>
	<li>10 mLクロマトグラフィーカラムにビーズを集め、非結合リサートが流れるようにします。</li>
	<li>洗浄バッファー(50 mM Tris pH 7.4、300 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、1mM DTT)を使用してビーズを洗浄し、一度に1mLを加算し、完全に流れるようにします。 注:SDS-PAGE サンプル用のバインド IgG ビーズの 2% を保存することをお勧めします。通常、私たちは4つの主要なバンドを観察します。2つのSNX-BARタンパク質とIgGヘビーおよびライトチェーン(図4、レーン3)。TEV切断効率を比較するために、同等の量の「溶出物」と「TEV後のIgGビーズ」を保存することをお勧めします。</li>
	<li>ビーズを収集し、マイクロ遠心チューブに転送します。新鮮な洗浄バッファーと10 mg/mL TEVプロテアーゼの2 μLで全容積の500 μLに追加し、4°Cで回転し、一晩インキュベートします。</li>
	<li>翌朝、27G針を使用して上清を完全に除去し、タンパク質純度を10%ポリアクリルアミドSDS-PAGEで評価します(図4、レーン4)。 注:通常、0.5-1 mg/mLの500μLを95%純粋ヘテロ二量(図4、レーン4)とします。カルモジュリン樹脂を用いた追加の精製も可能ですが、通常は収量が大幅に減少し、純度が>90%の場合はここで停止することをお勧めします。TEVはリポソーム結合アッセイを妨げませんが、TEVはNi-NTAアガロースビーズ15を使用してさらに除去することができます。</li>
	<li>濃縮するには、メーカーの指示に従って、10 KDaカットオフと遠心分離機を備えた0.5 mL遠心フィルターにサンプルを移します。ブラッドフォードタンパク質アッセイを用いて濃縮タンパク質を定量する。4°Cで保管し、1週間以内にご使用ください。</li>
</ol>3. リポソーム製剤
<ol><li>市販の脂質を購入する: ホスファチジルセリン (PS), PI3P, エルゴステロール, ホスファチジルコリン (PC).必要に応じて、推奨される溶媒に再サスペンドしてストック脂質を作ります。 注:脂質は、製造業者の推奨事項に従ってメタノール/クロロホルム混合物に再懸濁される。使用する前に、脂質ストックが透明で室温まで温まれていることを確認してください。再懸濁脂質は、アルゴンガスの下に貯蔵し、6〜12ヶ月間、または活性の損失が観察されるまで-20°Cでワックスフィルム(または同等物)を使用して密封することができる。</li>
	<li>各脂質ストックに必要な体積を計算して、所望の脂質組成との混合物を作成します(表1を参照)。脂質混合物中の脂質の合計1モルを仮定する。</li>
	<li>化学ヒュームフードでこのステップを実行します。クロロホルムの完全な注射器の容積を描き、廃棄物容器に捨てることによってきれいなガラス注射器。さらに 2 回繰り返します。クロロホルムを移す場合は、ガラスシリンジまたはピペットのみを使用してください。クロロホルムを描くときは、シリンジに気泡が入らないようにストッパーをゆっくり引っ張ってください。</li>
	<li>ガラスシリンジを使用して、クリーンなガラス培養管に計算されたストック脂質を転写し、1%PI3P、20%エルゴステロール、30%PS、PC(表1)の最終脂質混合物を作製する。各脂質が再懸濁される溶媒によっては、各脂質を添加すると混合物が曇りになることがある。 注:PSの濃度を変化させる(0-30%)には、それに応じて音量を調整し、様々なPCで補正する(表1)。</li>
	<li>円運動で脂質混合物に向けられた窒素ガスを用いて脂質混合物を慎重に乾燥させ、脂質を均一に乾燥させる。乾燥プロセス中にガラス管の底部に脂質を保つために低ガスの流れを使用してください。ガラス培養管をホイルで包み、開口部を未カバーのままにし、さらに1時間真空中で脱水する。</li>
	<li>400 μL の結合バッファー (50 mM Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl2)を加えると、脂質を完全に脱水し、最終的なリポソーム濃度を 2.5 mM にします。 注:最終的なリポソーム濃度は、多かれ少なかれ結合緩衝液を添加することによって調整することができる。例えば、200μL結合緩衝液を添加して、必要に応じて5mMのリポソーム濃度を生成してもよい(下記参照)。<ol>
<li>30分間室温で渦上で中速で振って脂質を再懸濁し、脂質が再懸濁されると、緩衝液は曇って見えるはずです。</li>
	</ol></li>
	<li>再懸濁されたリポソームをマイクロ遠心管に移す。この時点から、プラスチックピペットチップは、脂質がクロロホルムに再懸濁されなくなったように使用され得る。リポソーム溶液は曇って見えるはずです。</li>
	<li>凍結融解リポソームは、まず液体窒素にマイクロ遠心管を浸し込み、次に37°水浴中に沈み込む。リポソーム混合物は、解凍する前に完全に凍結し、目で固体に見える必要があります。</li>
	<li>化学ヒュームフードにクロロホルムを含むステップを実行します。クロロホルムの完全な注射器の容積を引き出して捨てることによって2つの1 mLガラス注射器をきれいにし、それぞれ3回、残留脂質を除去する。各ガラスシリンジを2つのシリンジボリュームを作成して超純水で平衡化し、2つのシリンジボリュームを作成して結合バッファと平衡化します。</li>
	<li>メーカーの推奨事項に従ってミニ押出機を組み立てます。結合バッファーにそれぞれを水没させることにより、1つの200 nm膜と2つのフィルタサポート(材料表を参照)を平衡化します。</li>
	<li>フィルターサポートとミニ押出機に配置する間に膜を挟みます。組み立てられたミニ押出機のデッドボリュームを減らし、アセンブリが気密であることを確認するには、1 mLガラスシリンジを使用してミニ押出機を介してリポソーム混合物の体積に匹敵する結合バッファのボリュームを渡します。</li>
	<li>1 mLガラスシリンジのいずれかを使用し、リポソーム混合物を描きます。マイクロ遠心チューブを反転して、ガラスシリンジに引き込むためにチューブキャップ内のリポソーム混合物の最後を収集します。</li>
	<li>200nm膜を19〜21回通過してリポソームを押し出す。新しいマイクロ遠心管で押し出されたリポソームを収集します。 注:押し出しリポソームは、押し出し前のリポソームよりも曇りが少なく見えるはずです。リポソームは、同じ日に使用し、氷の上に保存する必要があります。最後の押し出しは、リポソームを始めた注射器の反対側に置く必要があります。</li>
</ol>4. SNX-BAR リポソーム結合とチューブ
<ol><li>リポソーム結合および沈殿実験を行う前に、4°Cで20分間の超遠心分離機で100,000 x gで精製されたタンパク質を予め整示しました。上清を取り除き、新しいマイクロ遠心管に移します。ペレットがある場合は、ペレットを乱さないでください。</li>
	<li>リポソーム結合および管状アッセイを行うために、4μM精製Snx4-Atg20および2.5 mMリポソームを20μLの全反応体積でインキュベートし、添加するリポソームの体積を変化させる。 注:同じ実験では、同じ量のリポソームを使用する必要があります。</li>
	<li>30°Cで30分間インキュベートする。 注:沈殿時の可視化を可能にするために、10μL以上のリポソームを用いて、各反応に添加する2.5mMリポソームの量を最大化することを提案する。20μL反応で2.5mMリポソームの10μLを使用する場合、リポソームの最終濃度は1.25mMになります。精製されたタンパク質が希釈され、4 μMタンパク質に対してより多くの体積が必要な場合、脂質はリポソームの濃度を2倍にするために、水分補給工程中に200μLで再懸濁され得る(ステップ3.6を参照)。しかし、これはリポソームを作る前にタンパク質濃度を知る必要があります。</li>
	<li>
リポソームの管を視覚化し、定量します。
	<ol>
<li>電子顕微鏡分析のために直ちにリポソーム結合反応を処理する。炭素被覆銅メッシュグリッド上のスポット試料及び1%ウラニル酢酸塩を用いた負の染色(図5B)16。</li>
		<li>透過型電子顕微鏡(200kV)でサンプルを分析します。</li>
		<li>画像解析ソフトウェアを使用して、尿細管の直径を測定および定量します。単一のチューブルの尿細管径を正確に定量するには、チューブの長さに沿って3つの直径測定を行い、平均(図5B)。 注:分散の双方向分析を使用して統計的有意性を決定しました (図 5E)。酢酸ウラノールは放射性と毒性の両方です。この手順を実行するには、適切なラボの安全性認定が必要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
リポソーム結合と沈沈下。
	<ol>
<li>反応(20°L、ステップ4.3から)をポリカーボネート遠心管に移し、互換性のあるローターを使用して、4°Cで20分間、超遠心分離機で100,000 x gで回転させます。慎重に上清を除去し、新しいマイクロ遠心管に移します。ペレットはそのまま残す必要があることに注意してください。</li>
		<li>サンプルバッファーのSDS-PAGE 40°Lのペレットを再サスペンドし、新しいマイクロ遠心管に移します。上清に20μLのサンプルバッファーを加えます。10%ポリアクリルアミドSDS-PAGEゲルに同等量のペレットと上清をロードし、クマシー染色を行い、リポソームに結合したSNX-BAを可視化する(図5A)。</li>
		<li>ペレット画分中のSNX-BAR複合体の量を定量するには、密度測定を用いてバンド強度を定量し、ペレット画分中のSNX-BARタンパク質の割合を定量する。 注:分散の双方向分析を使用して統計的有意性を決定しました(図5C)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Teasdale, R. D., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+PX+%28phox-homology%29+domain+and+SNX+%28sorting+nexin%29+protein+families%3A+structures%2C+functions+and+roles+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease.</a> The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Retromer+Complex+and+Sorting+Nexins+in+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79(2018).</li>
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<li>Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+endosome-derived+transport+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of endosome-derived transport carriers.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+receptor+trafficking%3A+Retromer+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic+%28Copenhagen%2C+Denmark%29%22%5BJournal%5D)">Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).</li>
<li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+trafficking+by+yeast+Snx4+family+SNX-BAR+proteins+promotes+autophagy+and+vacuole+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2018).</li>
<li>van Weering, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+SNX-BAR-mediated+assembly+of+distinct+endosomal+sorting+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules.</a> The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).</li>
<li>Chi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+of+SNX-BAR-coated+endosomal+retrograde+transport+carriers+is+promoted+by+the+dynamin-related+protein+Vps1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).</li>
<li>Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retromer-driven+membrane+tubulation+separates+endosomal+recycling+from+Rab7%2FYpt7-dependent+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).</li>
<li>Purushothaman, L. K., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+induces+retromer-mediated+membrane+remodeling+on+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).</li>
<li>Wurmser, A. E., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide+signaling+and+turnover%3A+PtdIns%283%29P%2C+a+regulator+of+membrane+traffic%2C+is+transported+to+the+vacuole+and+degraded+by+a+process+that+requires+lumenal+vacuolar+hydrolase+activities%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities.</a> The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li>
<li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li>
<li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).</li>
<li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+soluble+His%286%29-tagged+TEV+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+structure+of+lipoproteins+revealed+by+an+optimized+negative-staining+protocol+of+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).</li>
<li>Yong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+SNX1%2FSNX6+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex.</a> Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

ここでは、酵母のSNX-BARダイマーを精製するための最適化されたワークフローと、合成リポソーム上の生物物理特性を評価する2つのアッセイを示します。大腸菌または他のシステムにおける典型的な組換えタンパク質発現に対する主な利点は、天然の宿主でSNX-BARタンパク質を均等に発現する能力であり、したがって、他のシステムにおけるSNX-BARの精製に見られる毒性および不溶性の問題を回避する。また、我々のシステムは、分子クローニングや複数の発現ベクター17の収容を必要としないことも注目に値する。当社の二重SNX-BAR酵母株は、染色体設計されたガラクトースプロモーターによって駆動され、誘導時の発現さえも保証します。重要な考慮事項は、ガラクトースがない場合、標的となるSNX-BARの発現がほとんどなく、したがってヌル表現型になることです。さらに、SNX-BARsはC末端タグを十分に許容する傾向があり、C末端にTAPタグを追加できることがわかります。しかし、タグ付けされるタンパク質に応じて、N末端TAPタグを12個用いることもできる。さ...

形質膜などの膜結合オルガネラは、小胞体、ゴルジ装置、リソソーム(酵母空胞)、およびエンドソームが真核細胞の内膜系を含む。ほとんどのオルガネラは、小胞輸送キャリアを介して他のオルガネラと通信し、物質を交換する能力を有する。細胞が内膜系内の小胞輸送キャリアの包装および形成をどのように調整するかをよく理解されていない。しかし、内膜系の多くを構成するタンパク質および脂質は、形質膜(PM)からの内視鏡小胞の内在化に由来することが知られている。内因性は、これらの小胞の一次アクセプターオルガネラであり、管状オルガネラの複数の相互接続されたセットで構成されています。内因性者の主な機能は、栄養獲得を促進し、タンパク質および脂質のターンオーバーを調節し、病原体感染から保護し、形質膜の脂質の主要な補充源として機能することである。内因性は、血漿膜から大量の貨物タンパク質および脂質を受け取るにつれて、貨物を管状内染色輸送キャリア(ETC)に分離することによって仕分けコンパートメントとして機能する。ETCに隔離されていないタンパク質は、エンドリソソーム系を介して分解されます。EDCに選別する貨物の調節不良は、栄養素の取り込み、タンパク質のターンオーバーまたは脂質恒常性の喪失につながり、多数の代謝、発達、および神経学的障害をもたらす1、2。しかしながら、内因性におけるEPCの中心的な役割にもかかわらず、内因性者が多数の異種貨物の包装を管状キャリアに選択的に調整する方法の根本的なメカニズムは知られていない。
選別ネキシン(SNX)ファミリーは、細胞3、4、5における多くの小胞輸送反応に重要であることが判明した進化的に保存されたタンパク質クラスである。選別ネキシンはエンドソーム膜にリクルートされ、その特徴的なフォックス相同性(PX)ドメインを介して貨物捕獲を助け、エンドソーム膜に富んだ脂質であるホスファチジルイノシトール-3-一リン酸(PtdIns(3)P)と結合する。哺乳動物は33個のSNXタンパク質をコードし、他のドメイン1の存在に応じて、さらに複数のサブファミリーに分けることができる。最も顕著なのは、SNX-BARサブファミリーはヒトで12個からなる最大のサブファミリーであり、出芽酵母ではサッカロミセス・セレビシエで、サブファミリーはわずか7 SNX-BARRに減少する。SNX-BARタンパク質は、PXドメインと、脂質貯留層を引き起して陽性曲率膜を結合するビンアンフィフィシン-RvS(BAR)ドメインの両方を有する。その結果、SNX-BARファミリーはエンドソームに対して自然な親和性を有し、膜改造能力を介してETC形成を仲介することができる。インビトロでは、SNX-BARのリモデリング特性は、合成リポソームに精製されたSNX-BARを添加し、その後の狭い、被覆管を電子顕微鏡で可視化することによって誘導することができる。これらの方法を用いて、研究者は、オリゴマー化濃度と収縮強度の両方がSNX-BARファミリーの間で異なっているように見えることを決定し、ETCの形成とサイションの両方に役立つ可能性を示唆している。
SNX-BARは、その排他的二量体化特性によってさらに分類することができる。インビトロ結合アッセイと構造研究は、SNX-BARタンパク質が特異的ホモジマーまたはヘテロダイマーのみを形成できることを実証しています。したがって、原理的には、各潜在的なSNX-BARダイマーオリゴマーは、貨物特異的な入稿経路に対してチューブルコートを提供することができ、同様に、他のSNX-BARプロトマーの制限されたオリゴマー化は、異なる輸出経路を定義することもできる。しかし、SNX-BARの数が多く、SNXファミリー内の多様性が多いため、ネキシンワン貨物仮説を選別する可能性は非常に低いです。代わりに、SNX-BAR、貨物、脂質特異性、その他の依存関係など、さまざまな要因を使用して協調的な作業を行う可能性が高くなります。同様に、酵母SNX4ファミリーの最近の研究は、PtdIns(3)Pを超えて、追加の脂質特異性の証拠を明らかにし、内染色体輸送キャリア6を増強する。本研究では、SNX-BARホモダイマーMvp1-Mvp1を細菌および天然ヘテロダイマーSnx4-Atg20およびVps5-Vps17から精製し、酵母からの高収率で発現および精製したが、Snx4-Atg20のみがホスファチジルセリン(PS)と結合する構造を優先的に結合し、唇の結合研究で狭いチューブ様構造を形成することが分かった。この分野の他の分野では、細菌由来の組換え精製SNX-BARホモダイマーを用いたSNX-BARの重要な特性を明らかにしているが、類似系でSNX-BARヘテロダイマーを発現させることに伴う毒性は、本来の特徴付けを妨げている7、8、9、10である。したがって、純粋な組換え発現天然ヘテロダイマーを得るための信頼性の高いシステムがなければ、研究者はこれらの調査ラインを見送らなければなりません。図1では、1)タンデム親和性精製のためのSNX-BARヘテロダイマーを過剰発現する酵母株を構築する4部構成のワークフローを提示し、 2)発現および精製天然SNX-BARヘテロダイマー、3)ユニラメラ合成リポソームを調製し、4)リポソームチューブまたは沈沈沈下アッセイを設定し、研究者が自然界で見つかったソートネキシンの成長カタログを調査するための重要なツールを提供する。

<table><tbody><tr><td>0.2 &mu;m PC メンブレン</td><td>Avanti</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Poly-Prep Chromatography カラム (Bio-Rad)</td><td>Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>27 G needle</td><td>BD Biosciences</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff</td><td>Amicon</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer</td><td>Avestin</td><td>EF-C3</td><td></td></tr><tr><td>BCA assay</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Optima MAX-XP 超遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>DOPS</td><td>Avanti</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>Ergosterol (Sigma)</td><td>Sigma</td><td>47130-U</td><td></td></tr><tr><td>押出機セットブロック 0.2 &mu;L/1 mL</td><td>Avanti</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>FEI Tecnai F20 透過型電子顕微鏡 (200 kV)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス製培養管</td><td>VWR</td><td>47729-570</td><td></td></tr><tr><td>IgG セファロースビーズ (GE Healthcare)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0969-01</td><td></td></tr><tr><td>Microlter ガラスシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>7637-01</td><td></td></tr><tr><td>ニューブランズウィック エクセラ E25</td><td>エッペンドルフ</td><td>M1353-0000</td><td>または同等の揺れ30°CC</td></tr><tr><td>Ni-NTA磁気アガロースビーズ</td><td>ピアス</td><td>78605</td><td></td></tr>オプ<tr><td>ティマXE-90超遠心分離機</td><td>ベックマンコール</td><td>ターA94516</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルムM</td><td>VWR</td><td>52858-076</td><td></td></tr><tr><td>PI3P</td><td>エシュロン</td><td>P-3016</td><td>またはエシュロン相当</td></tr><tr><td>ポリカーボネートボトルアセンブリ</td><td>ベックマンコールター</td><td>355622</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100固定角度ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>343840</td><td></td></tr><tr><td>タイプ 45 Ti ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空デシケーター、ソケットバルブ付き底部および蓋</td><td>VWR</td><td>75871-436</td><td></td></tr><tr><td>真空ポンプ アルカテル (Pascal 2005 C1)</td><td>A&J バキューム</td><td>PN07050</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス フォームホルダー付</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td></td></tr><tr><td>VWR キット マイクロチューブ</td><td>VWR</td><td>12620-880</td><td></td></tr></tbody></table>

出芽酵母snx-barヘテロダイマーの発現、精製、リポソーム結合

Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

SNX-BARタンパク質は、エンドサイトーシス中のタンパク質と脂質の選別と密売、エンドソーム系内での選別、オートファジーの選別に重要な役割を果たす、進化的に保存された膜改造タンパク質クラスです。SNX-BARタンパク質機能の中心は、高度に保存されたフォックス相同性(PX)およびBAR(ビン/アンフィフィシン/Rvs)ドメインを使用して膜を結合するホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成する能力です。さらに、膜上のSNX-BARダイマーのオリゴマー化は膜管および小胞の形成を引き起こすことができ、この活性はエンドソーム由来輸送キャリアのコートタンパク質としての機能を反映すると考えられている。研究者は長い間、合成リポソームまたは巨大ユニラメラ小胞(GUV)上の組換えSNX-BARタンパク質を用いたインビトロ結合研究を利用して、膜リモデリングを駆動するために必要な脂質の正確な構成を明らかにし、その作用機序を明らかにしてきました。しかし、二重発現系の技術的な課題、細菌におけるSNX-BARタンパク質発現の毒性、および個々のSNX-BARタンパク質の溶解性の低下により、これまでのほとんどの研究では、細菌の発現中に形成される非生理学的二量体を含むSNX-BARホモダイマーを調べてきた。最近では、典型的な細菌発現系の大きな欠点を克服するためのプロトコルを最適化しました。このワークフローを用いて、大量のSNX-BARヘテロダイマーを正常に発現および精製する方法と、結合および管結アッセイのための合成リポソーム上でそれらを再構成する方法を示します。

このプロトコルは、下流膜改造アッセイに使用できる内因性酵母SNX-BAR複合体の再現性と堅牢な製造方法を記述する(図1)。精製に用いた酵母株の構築は、出芽酵母における相同組換えの効率を利用し、標的SNX-BARのゲノムロチでの改変を可能にする(図2)。この設計には2つの利点があり、(i)選択が修飾を維持する必要がないように、標準的なYP培地を使用することができ、より高い細胞密度への増殖を可能にし、したがって、タンパク質のより高い産生を可能にし、(ii)標的SNX-BARの発現レベルが均等になり、ヘテロ二量体複合体の産生を最適化する。ガラクトースを添加する前に、標的SNX-BARはヌル表現型を示すため、標的SNX-BARに特異的な成長欠陥またはその他の既知の欠陥をもたらす可能性があります。さらに、2%ラフィノースおよび0.1%グルコースの増殖は、2%グルコースの増殖よりも遅い。したがって、ガラクトース誘導前の増殖期間は、各特定の株に対する最適化を必要とし得...

ここでは、酵母におけるSNX-BARヘテロダイマーの発現、精製及びリポソーム結合のワークフローを提示する。

出芽酵母SNX-BARヘテロダイマーの発現、精製、リポソーム結合

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...

SNX-BAは、ヒト疾患において重要な役割を果たす膜改質タンパク質です。我々の方法を用いて、脂質結合および膜リモデリングを促進するために、その正確な生物物理学的性質を決定することができる。酵母細胞からSNB-BARタンパク質を精製することで、ネイティブホモおよびヘテロSNX-BARダイマーを取得し、非ネイティブ発現系で頻繁に遭遇する毒性と不溶性を最小限に抑えることができます。我々の方法は、すべての酵母SNX-BARの脂質特異性を理解したり、他の生物から組み換えSNX-BARタンパク質を産生するために使用することができる。押出プロセス中のリポソーム損失を防ぐためには、正しい押出機アセンブリが不可欠です。初めに学生や現場に初めて参加する学生にとって、最も重要なステップを視覚的に観察することで、成功の可能性が大幅に向上します。まず、炭素源として2%ラフィノースと0.1%グルコースを添加した50ミリリットルの標準的なYP培地を含む培養物の少なくとも4倍の量のフラスコに酵母細胞の大きな綿棒を接種し、30°Cシェーカーで一晩培養を成長させます。翌朝、2%ラフィノースと0.1%グルコースを2.8リットルの容量で2.8リットルバッフルフェルバックフェルンバッハフラスコで1リットルの標準YP培地で50ミリリットルの前培養を発振インキュベーターで4〜5時間培養する。600ナノメートルでの光学濃度が0.2に達すると、揺れインキュベーターで一晩培養するために、細胞に2%の最終濃度にガラクトースを加えます。翌朝、遠心分離によって細胞を収穫し、酵母ペレットを50ミリリットルの円錐形チューブに移す。ペレットを精製バッファーの 15 ミリリットルに再懸濁して約 30 ミリリットルの最終容積を達成し、セル懸濁液を摂氏 4 度に冷却したホモジナイザーにロードします。サンプルを2〜3ラウンドで1平方インチあたり20〜25,000ポンドでライセし、氷の上の新しい50ミリリットル円錐形チューブにライセートを移します。すぐに遠心分離によって細胞のライセートをクリアし、慎重に新しいチューブに上清を移します。次に、精製バッファーに3つの再懸濁液を有するIgGセファロースビーズの300マイクロリットルを平衡化してから、ビーズをクリアした細胞のライセートに加え、摂氏4度で回転して2時間のインキュベートを行います。インキュベーションの最後に、ビーズを10ミリリットルのクロマトグラフィーカラムに加え、非結合溶解物が流れるようにします。ビーズを洗浄ごとに1ミリリットルの洗浄バッファーで10回洗浄し、各洗浄液が完全に流れ込んでから次のボリュームを追加します。最後の洗浄後、ピペットと新鮮なバッファーを使用して、マイクロ遠心チューブにビーズを移します。新鮮な洗浄バッファーでビーズの総量を500マイクロリットルにし、4°Cで回転して一晩インキュベーションのために1ミリリットルTEVプロテアーゼあたり10ミリグラムの2マイクロリットルでリゼートからビーズを取り除きます。翌朝、27ゲージの針を使用して上清を完全に除去し、タンパク質の純度を10%ポリアクリルアミドSDSページで評価します。次に、標準プロトコルに従ってブラッドフォードタンパク質アッセイを使用して濃縮タンパク質を定量化し、摂氏4度で最大1週間タンパク質を保存します。リポソームを調製するために、ガラス注射器を使用して、ストック脂質をクリーンガラス培養チューブに移し、1%ホスファチジルイノシトール-3-リン酸、20%エルゴステロール、30%ホスファチジルセリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリンを表に概説した最終脂質混合物を達成する。各脂質が再懸濁される溶媒に応じて、混合物は各脂質の添加時に白濁し得る。低流量の窒素ガスを円運動で導き、ガラス管の底部で脂質を均一に処理することで、脂質混合物を慎重に乾燥させます。次に、開口部を覆い出したホイルでガラス培養チューブを包み、さらに1時間真空中で脂質を脱水します。インキュベーションの終わりに、各バイアルに400マイクロリットルの結合バッファーを加えて、最終的なリポソーム濃度2.5ミリモルで脂質を完全に水分補給してから、室温で渦中速度で脂質を30分間再懸濁します。脂質が再懸濁されると、バッファーが濁るはずです。再懸濁リポソームをマイクロ遠心分離チューブに移し、液体窒素でチューブを凍結し、続いて37°Cの水浴で解凍を7〜8回行います。化学フュームフードでは、1回のクロロホルムを1回3回フルボリュームで2本洗浄し、残留脂質を除去し、2体積の超純水と2体積の結合緩衝液で各シリンジを平衡化します。メーカーの推奨に従ってミニ押出機を組み立てます。次に、結合バッファーに 1 つの 200 ナノメートル膜に 2 つのフィルターサポートを水没します。完全に気密になるようにミニ押出機を組み立てることが重要です。そして、リークをチェックする良い方法は、デバイスを介してバッファを渡すです。フィルターサポート間の膜を挟み、ミニ押出機に膜を配置します。平衡化された1ミリリットルシリンジの1つを使用して、ミニ押出機を通してリポソーム混合物の体積に類似した結合バッファーのボリュームを渡し、他のシリンジを使用してマイクロ遠心分離チューブを反転させ、リポソームチューブの最後を収集してそのコレクションのチューブキャップに取り込みます。その後、200ナノメートル膜を通してリポソームを19〜21回押し出し、押し出されたリポソームを新しいマイクロ遠心チューブに集める。SNX-BARのリポソーム結合および細管アッセイを行う前に、精製したタンパク質を超遠心分離によって予めクリアし、ペレットを邪魔することなく上清を新しいマイクロ遠心管に移します。次に、精製されたSNX4-ATG20の4マイクロモルと2.5ミリモルのリポソームを合計20マイクロリットルの30分の摂氏でインキュベートします。リポソーム細管を視覚化して定量化するには、インキュベーションの終わりに、炭素被覆銅メッシュグリッドと1%の酢酸ウラニルとの負の汚れにサンプルをすぐに見つけます。その後、200キロボルトで透過型電子顕微鏡でサンプルを分析します。リポソーム結合および沈下のために、ポリカーボネート遠心管に反応の20マイクロリットルを移し、超遠心分離機で互換性のあるルータでサンプルを回す。遠心分離の終わりに、上清を新しいマイクロ遠心分離管に慎重に移し、SDSページサンプルバッファーの40マイクロリットルでペレットを再懸濁します。ペレット懸濁液を新しいマイクロ遠心分離チューブに移し、20マイクロリットルのサンプルバッファーを上清に加えます。その後、10%ポリアクリルアミドSDSページゲルに同等のサンプル量のペレットと上清をロードし、リポソームに結合したSNX-BARsを可視化するためにクーマシー染色を行います。SNX-BAR発現の適切な誘導を確認するために、タンデムアフィニティー精製タグに対するウェスタンブロットは、クーマシー染色を介してSNX-BARのタンパク質レベルを検出できない可能性があるため使用できます。SNX-BARヘテロダイマーの精製後、2つのSNX-BARのバンドは1対1の量論比で現れ、汚染バンドはほとんどまたは全く存在しないはずです。この代表的な分析では、SNX-BARヘテロダイマーを発現させ、精製し、実証したように合成リポソームに結合した。なお、MVP1はホモダイマーを形成し、期待通り細菌で発現した。SNX-BARは、様々なリポソーム組成物に結合し、例えばリポソーム結合に対するホスファチジルセリンの影響を評価するために、デンジソメトリーによって定量化することができる。電子顕微鏡イメージングは、通常14〜26ナノメートルの間の直径を有するほとんどの管管を有するSNX4-ATG20リポソーム細管の測定を可能にする。精製されたSNX-BAはリポソームの貨物捕獲複合体で再構成され、完全なアセンブリが膜のリモデリングに与える影響を理解することができることに注意してください。精製されたSNX-BARダイマーの異なる組み合わせと異なる脂質で構成される合成リポソームとの結合を比較した場合、SNX-BARタンパク質は、明確な脂質結合性の好みを有することが判明した。クロロホルムを扱う際は常にフードで作業し、シャープやガラス材料を扱う際には適切なPPEを着用してください。

expression-purification-liposome-binding-budding-yeast-snx-bar

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

神話では、モデル生物出芽酵母で発現されるタンパク質間の過渡と安定な相互作用を高感度に検出することができます。それが正常にハイスループットな方法でそれらの相互作用パートナーを同定するために、外因性および酵母内在性膜タンパク質の研究に適用されています。...

スプリットユビキチンによる膜酵母ツーハイブリッド（神話）システム：タンパク質間相互作用を識別するための強力なツール

高品質の酵母細胞抽出物の調製は、個々のタンパク質または全体プロテオームの解析に必要な最初のステップである。ここでは、タンパク質機能、相互作用、および翻訳後修飾を維持するために最適化された出芽酵母細胞のための、高速で効率的、かつ信頼性の高い均質化プロトコルが記載されている。...

機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

この原稿は、出芽酵母サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において、動原体タンパク質、Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出について説明します。...

出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術

私たちは、分裂酵母の性的なライフサイクルの長期顕微鏡検査のための再現可能な基本的な方法を提供します。説明されているわずかな調整で、提示されたプロトコルは、生殖プロセスのさまざまなステップに研究の焦点を当てることができます。...

分裂酵母セクシャルライフサイクルの顕微鏡観察

この単一分子蛍光その場で交配のプロトコルは、栄養生長と減数分裂中出芽酵母の RNA...

単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

酵母 2 ハイブリッド スクリーンのバッチ処理は、獲物の融合蛋白質の非常に複雑なセットを持つ複数の餌の蛋白質の相互作用のプロファイルの直接比較のためことができます。ここでは、我々...

蛋白質の相互作用を比較するバッチの酵母 2 ハイブリッド スクリーン

内生的に形成された mRNA 蛋白質複合体の回復のためのタンデムの RNA 分離手順 (旅行) を説明します。具体的には、RNA 蛋白質の複合体は、生体内で架橋 polyadenylated Rna ランダムプライマー ビーズ抽出物から分離された、特定の Mrna が変更された RNA アンチセンス オリゴヌクレオチドでキャプチャされます。イムノブロット解析による蛋白質の Mrna...

真核生物 mRNA 蛋白質複合体を回復するオリゴヌクレオチド系タンデム型 RNA の隔離プロシージャ

ここで表現し、可溶化、酵母を用いた SLC4 トランスポーター家族に相同性を有するいくつかの真核生物のホウ酸トランスポーターを浄化するプロトコルを提案します。ポリコームタンパク アセンブリの精製 homomeric...

式、可溶化、および真核生物ホウ酸輸送体の浄化

ここでは、架橋器の存在下でのグリセロール勾配遠心分離であるグラフィックス(勾配固定)の利用について、一過性にスプライセソーム複合体に結合するスプライシング因子間の相互作用を同定する。...

サッカロミセス・セレビシエ・スプライセソソーム・サブコンプレックスの過渡性インターアクター検出のためのグラフィックスの利用

銅成長アッセイであるACT1-CUP1アッセイは、前駆体メッセンジャーRNA(pre-mRNA)スプライシングと、変異体スプライシング因子がスプライソソーム機能に与える影響を迅速に読み取ることができます。この研究はプロトコルを提供し、関心のあるスプライシングの問題に対処するために可能なカスタマイズを強調しています。...

ACT1-CUP1アッセイは、出芽酵母におけるスプライソソーム変異体の基質特異的感受性を決定

このプロトコールは、目的の抗原に結合するタンパク質変異体を濃縮するための酵母表面ディスプレイ選択キャンペーンを実施するための重要なステップを説明しています。...

酵母表面ディスプレイによるタンパク質工学

学ぶ SNX-BARヘテロダイマーの発現・精製・リポソーム結合法。出芽酵母を用いて膜再構成タンパク質の生化学的特性を解明し、脂質特異性と膜動態の理解に貢献する実験手法を習得できます。

出芽酵母SNX-BARヘテロダイマーの発現、精製、リポソーム結合

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