化学的集団移動のためのマイクロ流体学と統合された牽引顕微鏡
2019年10月13日
発達における集団細胞移動、創傷治癒、癌転移は、多くの場合、成長因子またはシグナル伝達分子の勾配によって導かれる。ここでは、トラクション顕微鏡とマイクロ流体システムを組み合わせた実験システムと、生化学的勾配下での集団移動の仕組みを定量化する方法のデモンストレーションを行います。
集合的細胞の移動は、シグナル伝達分子の勾配によって導かれることが多い。このビデオでは、生化学的勾配によって導かれる集団移動中に細胞の力を定量化する方法を示します。そこで、マイクロ流体チップをトラクション顕微鏡と統合し、マイクロ流体チップを使用して生化学的勾配を生成し、トラクション顕微鏡を使用して細胞力を測定します。
私の研究室のポストグラッドであるファンセク・チャン博士が手順をデモンストレーションします。10対1の比率でベースエラストマーと硬化剤を混合してPDMS溶液を調製する。ベースエラストマーの15ミリリットルを50ミリリットルの円錐チューブに入れ、1.5ミリリットルの硬化剤を加えます。
これらのチューブの2つを準備します。PDMS混合物を5分間ボルテックスしてから、196時間gで気泡を除去する1分間の遠心分離を行った。PDMSステンシルを製造するには、PDMSがSU-8ピラーの側面に触れるのではなくSU-8パターンパターンの上部に触れないように、SU-8パターンの領域を避けながら、約1ミリリットルのPDMS混合物をウエハーに注ぎます。
平らな表面に平らな表面に室温で30分以上置き、2時間以上摂氏80度の乾燥したオーブンでPDMSを治します。SU-8型からPDMSを慎重に剥がし、14ミリの中空パンチを使用して薄いPDMS膜をトリミングします。PDMSステンシルをオートクレーブする前に、粘着テープを使用してPDMSピースの表面のほこりを取り除きます。
PDMSマイクロチャネルを製造するには、約30ミリリットルのPDMS混合物をSU-8型に注ぎます。真空チャンバーで30分間脱気し、乾燥したオーブンでPDMSを摂氏80度で2時間以上硬化させます。SU-8型からPDMSを慎重に剥がし、24ミリメートルの大きさにPDMSを24ミリメートルに切ります。
各PDMSブロックで、1ミリメートルのバイオプシーパンチを使用して1つの出口と3つの入口を作成します。テキストプロトコルに記載されているように、ガラススライドを製造し、シンアナイズする。底ガラスの縁の面を100マイクロリットルのバインドシラン溶液で覆います。
ガラスを室温で1時間放置した後、ガラスを脱イオン水で3回洗い流します。その後、周囲の空気温度で、または圧縮空気を吹くことによって、ガラスを乾燥させます。テキストプロトコルに記載されているようにポリアクリルアミドゲル溶液を調製する。
その後、10マイクロリットルの混合ゲル溶液を長方形のマイクロウェルに移し、円形のカバースリップを上に置きます。カスタムガラス、ゲル溶液、カバースリップの組み立てを粘着テープで6ウェルプレートのカバーに固定し、それを反転させます。次いで96回gで10分間遠心分離機を用いて、ポリアクリルアミドゲルの最上層に蛍光粒子を持ち込んだ。
遠心分離機からアセンブリを取り外し、カバースリップを下に向けた平らな面に置きます。30分後、アセンブリを反転し、35ミリメートルのペトリ皿に入れます。2ミリリットルの脱イオン水で皿を満たします。
鉗子を使用して、カバースリップを片側にスライドさせてそっと取り外します。ポリアクリルアミドゲルにコラーゲンをコードするには、1ミリリットルのスルホ-SANPAHあたり1ミリグラムを暖かい50ミリモルHEPESバッファーに溶解します。200マイクロリットルの溶液をゲル表面に落とし、UV光で10分間活性化します。
UV活性化後、ゲルを0.1モルHEPESバッファーで2回リンスし、次にPBSで1回リンスします。一晩で4°Cのコラーゲン溶液でポリアクリルアミドゲルをコード化します。翌日、PBSでゲルを3回洗います。
F-127溶液にオートクレーブPDMSステンシルを浸します。摂氏37度のインキュベーターに1時間保管してください。PDMSステンシルをPBSで3回洗浄し、PDMSステンシルとポリアクリルアミドゲルの両方から液体を取り除きます。
次に、ポリアクリルアミドゲルにPDMSステンシルを置き、そのステンシルにPBSを追加します。PDMSステンシルの穴の中の気泡を、穏やかにピペットして取り除きます。気泡を取り除いた後、PDMSステンシルの表面からPBSをクリアします。
次に、200マイクロリットルの細胞溶液をPDMSステンシルに加え、細胞がポリアクリルアミドゲルに付着するようにインキュベーターに1時間置きます。インキュベーションに続いて、細胞培養培地で細胞溶液を静かに洗い流し、さらに細胞培養培地を添加する。PDMSステンシルを取り外し、顕微鏡下で細胞島の形成を確認します。
次に、PDMSマイクロチャネルの表面を酸素プラズマで30秒間処理します。ポリアクリルアミドゲル充填底部ガラスの液体を取り除いた後、PDMSマイクロチャネルを底ガラスの上に置き、アセンブリをカスタムガラスホルダーに置きます。マイクロチャネルを細胞培養培地で満たします。
統合されたマイクロ流体システムの入口管を準備するために、トリムされた針および30センチメートルのミニボリュームラインを三方向のストップコックと接続する。これらの取り決めの3つを準備します。出口管の場合は、トリミングされた針と75センチメートルのミニボリュームラインを3ウェイストップコックで接続します。
チューブラインに、予熱された媒体を1時間充填します。注射器からプランジャーを取り除き、入口チューブラインを接続して、貯水池を準備します。各チューブラインの針コネクタを、マイクロ流体装置の3つの入口と1つの出口に差し込みます。
新鮮な培地または調整された培地の3ミリリットルで各貯水池を充填します。勾配試験のために、細胞培養培地中の1ミリリットル肝細胞増殖因子(HGF)で左入口貯留層を20ナノグラム充填する。濃度勾配の可視化のために、左入口貯留層に蛍光染料1ミリリットル当たり200マイクログラムを加える。
コンセントの管ラインをシリンジポンプに接続します。従来の蛍光顕微鏡のステージ上に、統合マイクロ流体システムを配置します。インキュベーターに収納された自動顕微鏡を使用して、最大24時間10分ごとに画像を撮影します。
各時点で、細胞移動を可視化する位相画像、ゲルに埋め込まれた蛍光ビーズを可視化する緑色蛍光画像、化学物質の濃度勾配を可視化する赤色蛍光画像など、3つの異なるチャネルで4X対物レンズを使用して一連の画像を撮影します。タイムラプス画像を撮影した後、0.25%トリプシン-EDTA溶液をマイクロチャネルに注入し、ポリアクリルアミドゲルから細胞を取り外します。ゲルから細胞を完全に除去した際に、蛍光性の緑色の画像を撮り、トラクション顕微鏡の基準画像として使用します。
テキストプロトコルの説明に従ってデータ分析に進みます。収縮力と細胞間ストレスを測定するために、トラクション顕微鏡と単層応力顕微鏡をマイクロ流体チャネルと組み合わせた。マップは、冷たい色を使用して暖かい色と内向きの牽引を使用して外向きの牽引と無線調整でプロットされました。
時間ゼロでは、すべての島は、島内のエッジと変動に強い内向きの牽引を持つ同様の牽引分布を示しました。HGF勾配を適用した10時間後、島の拡大の程度は各列で異なっていたが、トラクション分布はタイムゼロとほぼ同様であった。平均トラクションは10時間変わりませんでした。
しかし、単層応力を計算する際には、各列に異なる傾向が示されました。HGF濃度が低かった場合、島内の平均張力は10時間を通して約200パスカルを維持した。HGF濃度が高かったところでは、島内の平均張力は、前に示したように、10時間にわたって230パスカルから100パスカルに徐々に減少した。
HGF濃度が左半分で高く、島の右半分が低かったところで、平均張力は150パスカルの周りに維持された。マイクロ流体チャネルを充填することは穏やかでなければなりません。同時にマイクロ親細胞の島を破壊しない一方でチャネルに閉じ込められた気泡を除去することが重要です。
この統合システムを使用することで、ケモ誘引物質や成長因子などの様々な化学勾配に対して細胞集団がどのように機械的に反応するかを調べることができます。このプラットフォームは、再生、癌転移、および発達を理解するための鍵である化学勾配下の集団細胞移動の仕組みをさらに探求するのに役立ちます。
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概要
この記事では、生化学的勾配に影響される集団細胞移動のメカニズムについて説明しています。この実験システムは、このプロセス中の細胞力量を定量化するために引張りマイクロスコピーとマイクロ流体デバイスを統合しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 生物物理学
- マイクロ流体工学
背景
- 集団細胞移動は様々な生物学的プロセスにおいて重要です。
- これはシグナル分子の勾配によって導かれます。
- そのメカニズムを理解することで、発生や疾患への洞察が得られます。
- この研究では、細胞力を測定するための高度な技術を使用しています。
研究の目的
- 集団移動中の細胞力を定量化する。
- 引張りマイクロスコピーとマイクロ流体の統合を実証する。
- 生化学的勾配が細胞の動きに与える影響を探る。
使用された方法
- マイクロ流体チップと引張りマイクロスコピーの統合。
- マイクロ流体システムを使用した生化学的勾配の生成。
- 移動中の細胞力の測定。
- マイクロ流体チップ製造のためのPDMS溶液の調製。
主な結果
- 実験セットアップの成功的な実証。
- 生化学的勾配下での細胞力の定量化。
- 集団細胞移動のメカニズムへの洞察。
- 創傷治癒やがん転移の理解における潜在的な応用。
結論
- この研究は細胞力学を定量化する新しいアプローチを提供します。
- 細胞移動における生化学的勾配の重要性を強調しています。
- 将来の研究はこれらの知見に基づいて治療応用を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding how chemical gradients influence collective cell migration provides critical insights into cancer metastasis and tissue regeneration. This integrated microfluidic-traction microscopy system enables quantitative assessment of intercellular forces and traction dynamics under controlled biochemical gradients, supporting mechanistic de-risking in target validation for anti-metastatic therapies. The platform offers a reproducible, scalable approach to evaluate how growth factor gradients alter collective cell behavior, informing early discovery decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking HGF gradient exposure to changes in intercellular stress and collective migration patterns.
- Operational Value: Enables functional target validation by quantifying how HGF signaling modulates monolayer tension and cell-cell coordination in MDCK islands.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying whether a target influences collective migration mechanics, a key determinant in metastasis potential.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems (micropatterned MDCK islands) for downstream compound screening under gradient conditions.
- Reproducibility: Standardizes microfluidic gradient generation and traction measurement, ensuring consistent quantitative outputs across experiments.
- Scalability: Supports platform reuse for testing multiple growth factors or inhibitors in a controlled microenvironment.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models chemotactic collective migration relevant to wound healing and cancer metastasis, aligning with translational biomarker strategies.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery-phase mechanistic insights with preclinical validation by quantifying force changes that predict invasive potential.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing whether a compound reduces HGF-driven intercellular stress disruption in collective migration.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing mechanistic insights that inform preclinical continuity in metastasis-related programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how biochemical gradients alter intercellular stress and collective migration in epithelial cell islands.
- Screening: Enables assay-ready, reproducible systems for evaluating compound effects on traction and stress dynamics under controlled HGF gradients.
- Analytics: Generates quantitative traction and monolayer stress maps that allow teams to compare force distributions across gradient conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling collective migration mechanics relevant to metastasis and regeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for testing multiple chemotactic stimuli across different cell types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in how growth factors regulate collective cell migration.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through integrated microfluidic gradient control and traction microscopy readouts.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets involved in metastasis pathways.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by identifying compounds that normalize intercellular stress in chemotactic collective migration.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, PDMS handling, and traction microscopy data analysis.
- Depends on access to fluorescent microscopy, UV activation systems, and controlled incubators for long-term time-lapse imaging.
- Necessitates cross-team standardization of gradient preparation, gel coating, and cell seeding protocols to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when extending the system to other cell types or extracellular matrix proteins beyond collagen-coated polyacrylamide gels.
- Includes practical limitations such as the need for careful bubble removal in microfluidic channels and gentle medium exchange to avoid disrupting micropatterned cell islands.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:47
Fabrication of Polydimethylsiloxane (PDMS) Stencil and Microchannel
2:39
Preparation of Bottom Glass with Polyacrylamide (PA) Gel
4:41
Micropatterning of Cell Islands and Assembly of PA Gel with PDMS Microchannel
6:14
Integrated Microfluidic System
7:32
Image Acquisition
8:27
Results: Mechanical Interactions of MDCK Cell Islands
9:55
Conclusion
