Name: 化学的集団移動のためのマイクロ流体学と統合された牽引顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 学ぶ マイクロ流体チップと牽引顕微鏡を統合した手法で、化学的勾配下での細胞集団移動時の力を定量化する方法です。創傷治癒やがん転移のメカニズム解明に応用できます。

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この研究は、韓国政府の助成金を受けた韓国国立研究財団(NRF)の助成を受けました( いいえ)NRF-2017R1E1A1A01075103)、韓国大学助成金、BK 21 Plusプログラム。また、国立衛生研究所(U01CA202123、PO1HL120839、T32HL007118、R01EY019696)によってサポートされました。

注:ステンシル(厚さ= 250 μm)およびマイクロチャネル部品(厚さ=150μm)、ガラスエッチング(深さ=100μm)、鋳造加工のためのSU-8金型のリソグラフィは、コンピュータ支援設計ソフトウェアを使用して設計をメーカーに送信することで外部委託されました。
1. ポリジメチルシロキサン(PDMS)ステンシルおよびマイクロチャネルの製造
<ol><li>ステンシルとマイクロチャネルのマイクロパターンを設計します。</li>
	<li>シリコンウエハ(直径4")上にSU-8金型(ステンシルの厚さ~250μm、マイクロチャネルの場合は約150μm)を製造または委託してください。</li>
	<li>塩基エラストマーと硬化剤を10:1の比で混合してPDMS混合物を調出す。<ol>
<li>50 mL円錐管にベースエラストマーの15mLを入れ、硬化剤の1.5 mLを追加します。これらのうちの2つを準備します。</li>
		<li>PDMS混合物を5分間渦にして、PDMS混合物を196 x gで1分間遠心分離し、気泡を除去する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PDMSステンシルを製造するには、PDMS混合物をウェーハに約1mL注ぎ、SU-8パターン領域を避けながら、PDMSがSU-8柱の側面に接触するが、SU-8パターンの上部に触れないようにする。<ol>
<li>ウェーハを室温(RT)で30分以上平らな面に置きます。2時間以上80°Cの乾燥オーブンでPDMSを硬化させます。</li>
		<li>SU-8型から慎重にPDMSを剥がし、14mmの中空パンチを使用して薄いPDMS膜をトリミングします。粘着テープを使用してPDMSピースの表面のほこりを取り除き、PDMSステンシルをオートクレーブします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PDMSマイクロチャネルを製造するには、SU-8金型の上に約30 mLのPDMS混合物を注ぎます。<ol>
<li>真空室で30分間ドガを行い、2時間以上80°Cの乾いたオーブンでPDMSを硬化させます。</li>
		<li>SU-8型から慎重にPDMSを剥がし、24mm x 24 mmのサイズにPDMSをカットします。各PDMSブロックで、1mmの生検パンチを使用して1つの出口と3つの入口を作成します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ポリアクリルアミド(PA)ゲルを使用したボトムガラスの調製
<ol><li>長方形のマイクロウェル(6 mm x 12 mm、100 μm 深さ29)を使用した長方形スライドメガネ(24 mm x 24 mm x 1 mm)を、メガネの切断およびエッチングにより製造または外部委託します。</li>
	<li>底ガラス30の表面をサイラス化する。<ol>
<li>脱イオン水(DIW)の200mL、酢酸80μL、3-(トリメトキシシル)プロピルメタクリレート(TMSPMA)の50μLを1時間混合して結合シラン溶液を調製する。 注意:TMSPMAは可燃性液体です。材料安全データシートの推奨事項に従ってください。化学ヒュームフードでのみ使用してください。</li>
		<li>粘着テープでガラスの表面からほこりを取り除き、ガラスをオートクレーブします。</li>
		<li>バインドシラン溶液の100 μLで底ガラスのエッチング面を覆い、1時間RTでガラスを残します。</li>
		<li>DIW 3xでガラスをすすいで、周囲の空気温度で、または空気を吹き付けることによってガラスを乾燥させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PAゲル31用のゲル溶液を調出す。<ol>
<li>DIWの1mLで5mgのAPSを溶解することにより、0.5%(w/v)の硫酸アンモニウム(APS)の新鮮な溶液を調出します。</li>
		<li>40%アクリルアミド溶液の138 μL、2%のビスアクリルアミド溶液の101 μL、5μLの蛍光粒子溶液(0.2μm)、およびDIWの655μLからなるPAゲル溶液を調製する。 注意: アクリルアミドおよびビサクリラム化溶液は有毒です。保護手袋、衣類、目の保護具を着用してください。蛍光粒子を含むPAゲル溶液を光から保護します。 注:ピペッティング前の蛍光ビーズ溶液を渦にして、バッチ当たり一定数の蛍光ビーズを得る。</li>
		<li>APS溶液の100μLとテトラメチルチレンジアミン(TEMED)の1μLを加えた後、10μLの混合ゲル溶液を長方形のマイクロウェルに移し、円形カバースリップ(18mm)の上に置きます。 注:気泡なしでPAゲルで底ガラスを充填するには、底ガラスの溝に十分なゲル溶液を置き、慎重にゲル溶液の上にカバースリップをスライドさせ、余分なゲル溶液を除去します。 注意:ゲルは約40分間ゆっくりと硬化します。遠心ゲルの次の手順は、できるだけ早く行う必要があります。</li>
		<li>カスタムガラス、ゲル溶液、カバースリップの組み立てを反転し、96 x gで10分間遠心分離機を使用して、PAゲルの最上層に蛍光粒子を持ち込みます。</li>
		<li>遠心分離機からアセンブリを取り外し、カバースリップを下にして平らな面に置きます。 注:ステップ2.3.6から始まり、バイオセーフティキャビネットでサンプルを処理します。</li>
		<li>30分後、アセンブリを反転し、35ミリメートルペトリ皿に入れ、DIWの2 mLで満たし、(鉗子を使用して)片側にスライドさせてカバースリップを静かに取り外します。 注:硬化PAゲルは1ヶ月間DIWに保存することができます。しかし、コラーゲンをPAゲルに塗った後は、1日以内の実験で使用する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PAゲルにコラーゲンを塗ります。<ol>
<li>1 mg/mLスルホスクシニミジル6-(4'-azido-2'-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノエート(スルフォ-SANPAH)を温暖な50mM HEPESバッファーに溶解する。溶液の200 μLをゲル表面に落とし、UV光(365nm波長)で10分間活性化します。 注:スルフォ-SANPAHを光から保護します。</li>
		<li>ゲルを0.1 M[4-(2-ヒドロキセチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸でリンスする。HEPES]バッファ2xとPBS 1xと。</li>
		<li>PAゲルをコラーゲン溶液(PBSで100μg/mL、ラットテールコラーゲンタイプI)を一晩4°Cで塗ります。翌日はPBS3xで洗います。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 細胞島の微小パターン化
<ol><li>F-127(材料の表)溶液[PBSで2%(w/v)]を準備し、F-127溶液にオートクレーブされたPDMSステンシルを浸します。37 °Cのインキュベーターに1時間保管してください。</li>
	<li>からなる細胞培養培地中の細胞溶液(2 x 106細胞/mL)を調製する:ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)と10%の胎児ウシ血清(FBS)および1%の抗生物質抗菌性(AA)を含む。</li>
	<li>PBS 3xでPDMSステンシルを洗浄し、PDMSステンシルとPAゲルの両方から液体を取り除きます。PDMS ステンシルを PA ゲル上に配置し、ステンシルに PBS を追加します。</li>
	<li>穏やかにピペッティングすることにより、PDMSステンシルの穴の気泡を削除します。気泡を取り除いた後、PDMS ステンシルの表面から PBS を取り外します。</li>
	<li>PDMSステンシルに200μLの細胞溶液を入れた後、細胞がPAゲルに付着するように1時間インキュベーターにPAゲルを保管してください。</li>
	<li>細胞培養培養剤で細胞溶液を静かに洗い流し、PDMSステンシルを除去し、より多くの細胞培養培養培養培養剤を追加する。顕微鏡下で細胞島の形成を確認してください。</li>
</ol>4. PDMSマイクロチャネルを使用したPAゲルの組み立て
<ol><li>粘着テープを使用してPDMSマイクロチャネルのほこりを取り除き、オートクレーブします。</li>
	<li>PDMSマイクロチャネルの表面を酸素プラズマ(80 W、50 kHz)で30秒扱います。</li>
	<li>PAゲル充填ボトムガラスの流体を取り除いた後、PDMSマイクロチャネルを底面ガラスの上に置き、カスタムガラスホルダーにアセンブリを置きます。</li>
	<li>マイクロチャネルを細胞培養培地で充填する。 注意:温かいメディアをピペットでそっと洗い流すことで、チャネルに閉じ込められたすべての気泡を取り除くようにしてください。また、気泡を除去しながら、マイクロパターン化された細胞島を取り外さないようにしてください。</li>
</ol>5. 統合されたマイクロ流体システム
<ol><li>チューブを接続します。<ol>
<li>針の先端(18G)をトリミングし、90°を曲げてコネクタを準備します。</li>
		<li>3つの入口と1つの出口のためのチューブラインを準備します。<ol>
<li>入口チューブの場合は、トリミングされた針と30cmのミニボリュームラインを3ウェイストップコックで接続します。これらのうちの3つ。</li>
			<li>コンセントチューブの場合は、トリミングされた針と75cmのミニボリュームラインを3ウェイストップコックで接続します。これらのうちの1つを準備します。</li>
			<li>1時間予熱した媒体でチューブラインを埋めます。 注意:暖かいメディアを注射器でそっと洗い流すことで、チューブラインに閉じ込められたすべての気泡を取り除くようにしてください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>注射器からプランジャーを取り除き、入り込みチューブラインを接続して、貯水池を準備します。</li>
		<li>各チューブラインの針コネクタをマイクロ流体装置の3つの入口と1つの出口に差し込みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>新鮮な媒体または条件付き媒体の3 mLで貯水池を満たします。<ol>
<li>勾配試験では、左入口貯留部に20 ng/mL HGFを細胞培養培地に充填します。</li>
		<li>濃度勾配の可視化のために、左入口貯留部に200 μg/mL蛍光色素(ローダミンB-dextran、70 kDa)を追加します。</li>
		<li>コンセントチューブラインをシリンジポンプに接続します。 注:シリンジポンプの動作モードは「撤退」です。流量は、シリンジポンプのシリンジの容量と動作速度に応じて変化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>従来のエピ蛍光顕微鏡のステージに統合されたマイクロ流体システムを配置します。 注意: マイクロ流体チャネルで HGF の緩やかな勾配を生成するには、流量が 0.1 μL/min と同じくらい遅くする必要があります。これは2時間の安定化を必要とするように十分に敏感であり、実験中の物理的な妨害を避けるために注意する必要があります。</li>
</ol>6. 画像取得
<ol><li>インキュベーターに収容された自動顕微鏡を使用して、最大24時間10分ごとに画像を撮影します。各タイムポイントで、細胞移動を可視化する位相画像、PAゲルに埋め込まれた蛍光ビーズを可視化する緑色蛍光画像、赤色蛍光画像など、3つの異なる経路で4倍の対物レンズを用いて一連の画像を撮影し、化学物質の濃度勾配。</li>
	<li>タイムラプス画像を撮影した後、0.25%トリプシン-EDTA溶液をマイクロチャネルに注入し、PAゲルから細胞を剥離します。ゲルから細胞を完全に除去した後、トラクション顕微鏡の基準画像として使用する緑色蛍光画像を撮る。</li>
</ol>7. データ分析
注: MATLAB を使用してデータ分析用のカスタム コードが開発され、詳細は32、33、34、35、36の他の場所で説明されています。
<ol><li>位相画像解析の場合、粒子画像ベロシメトリー36を使用して、2つの連続した位相画像における変位を計算する。</li>
	<li>フーリエ変換トラクション顕微鏡検査では、各緑色蛍光画像を参照画像と比較し、粒子画像ベロシメトリー36を用いて各画像の変位を計算する。変位から、フーリエ変換トラクション顕微鏡検査33、34、37を使用してPAゲル上の細胞によって作られたトラクションを回復する。</li>
	<li>トラクションデータから、有限要素法32、34、38に基づいて単層応力顕微鏡を用いて細胞島の単層内の応力を算出する。</li>
</ol>

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著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。

構成細胞の集合的な移動は、発達および再生の間に重要なプロセスであり、移行方向はしばしば成長因子4,23の化学勾配によって導かれる。集合的な移行中、セルは隣接するセルや基底の基板と相互作用し続けます。このような機械的相互作用は、デュロタキシス42、プリト軸33、およびキノタキシカル43などの緊急現象を引き起こします。しかし、この研究は、胎児ウシ血清のような単一濃度の成長因子を用いて行われた。ギャップを埋めるために、このプロトコルは、化学勾配下での集合的な細胞移動中の機械的相互作用を測定できる新しい実験プラットフォームについて説明する。
新しいプラットフォームは、マイクロパターニング、トラクション顕微鏡、マイクロ流体解析の3つの実験システムを組み合わせたものです。まず、集団移動のための細胞島のマイクロパターン化を行った。第二に、...

生体系における細胞移動は、組織形成、免疫応答、および創傷治癒1、2、3に関与する基本的な現象である。細胞移動はまた、癌4のようないくつかの疾患で重要なプロセスです。セルは、多くの場合、個別ではなくグループとして移行します。細胞が集合的に移動するためには、微小環境のセンシングが不可欠6.例えば、細胞は物理化学的刺激を知覚し、運動性、細胞基板相互作用、および細胞間相互作用を変化させ、化学勾配7、8に沿った方向移動をもたらし、応答する。 9,10.この接続に基づいて、化学集化剤11、12、13の勾配のようなよく制御された化学微小環境を作成することができるラボオンチップ技術の急速な進歩がなされた.これらのラボ・オン・チップベースのマイクロ流体学は、以前に細胞アンサンブルまたは細胞スフェロイド14、15、16、17の化学タキシスを研究するために使用されてきましたが、単一セル移行18、19、20、21のコンテキストで主に使用されています。化学勾配に対する細胞集合応答の根底にあるメカニズムは、まだよく理解されていない14,22,23,24,25,26.したがって、可溶性因子の時空間制御を可能にするプラットフォームの開発と、細胞の生物物理学のその場観察は、集団細胞移動の背後にあるメカニズムを解明するのに役立つ。
ここで開発および説明されているのは、パターン化された細胞クラスターの移動を調節する可溶性因子の濃度勾配の生成を可能にする多チャネルマイクロ流体システムである。本研究では、肝細胞増殖因子(HGF)がマディン・ダービーイヌ腎臓(MDCK)細胞の移動挙動を調節するために選択される。HGFは、細胞の完全性を減衰させ、細胞27、28の運動性を高めることが知られている。マイクロ流体系では、フーリエ変換トラクション顕微鏡と単層ストレス顕微鏡も組み込まれており、HGFに応答して構成細胞によって誘導される運動性、収縮力、および細胞間張力の分析が可能です。グラデーション。同じ島内で、HGFの高濃度付近に位置する細胞はより速く移動し、低いHGF濃度を有する側のものよりも低い細胞間ストレスレベルを示す。この新しい実験システムは、様々な可溶性因子の化学勾配下での集団細胞移動を含む分野における他の疑問を探求するのに適していることを示唆している。

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES 緩衝液</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>1 mm バイオプシーパンチ</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td></td></tr><tr><td>100 mm シャーレ</td><td>SPL</td><td>10100</td><td>直径 100 mm 直径 15 mm 高さ</td></tr><tr><td>14 mm 中空パンチ</td><td>ILJIN</td><td>124-0571</td><td></td></tr><tr><td>18 mm &Oslash;カバーガラス</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>111580</td><td>円形 18 mm、厚さ No. 1 (0.13 から 0.16 mm)</td></tr><tr><td>2% ビスアクリルアミド溶液</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610142</td><td>保護手袋、衣服、目の保護具を着用してください。</td></tr><tr><td>3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート(TMSPMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159-500ML</td><td></td></tr><tr><td>3ウェイストップコック</td><td>Hyupsung</td><td>HS-T-61N</td><td>注意:以前に開封した場合は使用しないでください。</td></tr><tr><td>30cmの最小容量ラインを再</td>滅菌または再使用しないでください(小児用)<td>Hyupsung</td><td>HS-MV-30</td><td>注意:以前に開封した場合は使用しないでください。</td></tr><tr><td>35 mm細胞培養ディッシュ</td><td>を再</td>滅菌または再利用しないでください コーニング<td></td><td></td></tr><tr><td>430165 40% アクリルアミド溶液</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610140</td><td>保護手袋、衣服、目の保護具を着用してください。</td></tr><tr><td>75 cm最小ボリュームライン(小児用)</td><td>Hyupsung</td><td>HS-MV-75</td><td>注意:以前に開封した場合は使用しないでください。 酢酸を再滅菌または再使用しないでください</td></tr><tr><td></td><td>J.T.ベーカー</td><td>JT9508-03</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム(APS)</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌剤</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>底面ガラスチップ</td><td>MicroFIT</td><td></td><td>24 x 24 x 1 mm、カスタムメイド、長方形の溝(6 x 12 mm、深さ:100 &mu;m)</td></tr><tr><td>コラーゲンI型、ラットテール</td><td>コーニング</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>カスタムガラスホルダー</td><td>ハンググメカトロニクス</td><td>カスタムメイド</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ モディファイド イーグルス ミディアム (DMEM)</td><td>ウェルジーン</td><td>LM 001-11</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>バイオウエスト</td><td>L0615-500</td><td>マグネシウム、カルシウム</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-179</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres アミン修飾マイクロスフェア</td><td>Invitrogen</td><td>F8764</td><td>0.2 &micro;m, 黄緑色蛍光(505/515)</td></tr><tr><td>肝細胞増殖因子 (HGF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1404-5UG</td><td>組換え、ヒト</td></tr><tr><td>JuLI ステージ ライブセルイメージングシステム</td><td>NanoEnTek In</td><td></td><td>Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging インキュベーター互換 (37 °;Cおよび5%CO2)</td></tr><tr><td>Madin-Darby犬腎臓(MDCK)細胞</td><td></td><td></td><td>II</td></tr><tr><td>型酸素プラズマシステムフェ</td><td>ムトサイエンス</td><td>CUTE-MPR</td><td></td></tr><tr><td>プルロニックF-127</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>ローダミンBイソチオシアネート&ndash;デキストラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9379-100MG</td><td>70 kDa、マイクロ流体チャネル内のHGFの時空間分布を推定するために使用</td></tr><tr><td>滅菌皮下注射針 18 G</td><td>KOVAX</td><td></td><td>針の先端をトリミングし、90度曲げてボリュームラインでイン/アウトポートを接続</td></tr><tr><td>スティッキーテープ</td><td>3M/スコッチ</td><td>810D</td><td>33 m x 19 mm</td></tr><tr><td>SU-8 マスターモールド</td><td>MicroFIT</td><td></td><td>4インチ直径、カスタムメイドの</td></tr><tr><td>スルホスクシンイミジル6-(4'-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ)ヘキサン酸(スルホSANPAH)</td><td>Thermo Scientific</td><td>22589</td><td>-20°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>シルガード184エラストマーキット</td><td>ダウコーニング</td><td></td><td>PDMS</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>Chemyx Inc.</td><td>モデルフュージョン 720</td><td>引き出し液</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>KOVAX</td><td></td><td>1、3、5、10、または 50 cc 入口または出口シリンジポンプ</td></tr><tr><td>テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610800</td><td>保護手袋、衣服、目の保護具を着用してください。</td></tr><tr><td>紫外線(UV)ランプ</td><td>UVP LLC</td><td>95-0248-02</td><td>365 nm波長</td></tr></tbody></table>

化学的集団移動のためのマイクロ流体学と統合された牽引顕微鏡

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

細胞は、刺激の勾配を含む化学刺激に応じて移動パターンを変化させる。化学勾配の方向への細胞移動は、化学的勾配として知られており、発達、免疫応答、創傷治癒、癌転移において重要な役割を果たしている。化学タキシスは、単一細胞の移動と生体内の細胞のコレクションを調節する一方で、インビトロ研究は、適切な実験ツールの欠如のために、単細胞化学タキシスに焦点を当てています。このギャップを埋めるために、ここで説明するマイクロ流体とマイクロパターニングを組み合わせて、集団細胞移動に対する化学勾配の影響を実証するユニークな実験システムを説明します。さらに、トラクション顕微鏡と単層ストレス顕微鏡は、基板上の細胞力の変化を特徴付けるためにシステムに組み込まれ、隣接する細胞間でも変化します。概念実証として、マディン・ダービーイヌ腎臓(MDCK)細胞の微小パターン状の円形島の移動は、既知の散乱因子である肝細胞増殖因子(HGF)の勾配の下で試験される。HGFの高濃度付近に位置する細胞は、細胞島内の反対側の細胞よりも速く移動することがわかった。同じ島内では、細胞トラクションは両側で類似しているが、細胞間ストレスはHGF濃度が高い側ではるかに低い。この新しい実験システムは、細胞集団による化学的移動の力学を研究する新しい機会を提供できる。

化学勾配下での集団移動を探索するために、微小流体システムをトラクション顕微鏡検査と統合した(図1)。統合システムを構築するために、ポリアクリルアミド(PA)ゲルをカスタムカットガラス上に鋳造し、MDCK細胞はPDMSステンシル製のマイクロパターン化された島内に播種した。この実験では、MDCK細胞の12の島(3列で4列、直径約700μm)を作成した。PAゲルに付着した細胞の後、PDMSステンシルを除去して集団移動を開始した。あらかじめ作られたマイクロ流体チャネルをPAゲルの上に置き、細胞島の上にマイクロ流体チャネルを構築した(図1A)。
次いで、マイクロ流体チャネル内に濃度勾配を確立し、左入口を蛍光色素溶液を含む供給貯留部に接続した。さらに、中央と右の入り込みは、メディアのみを含む供給貯蔵所に接続されました。次に、出口をシリンジポンプに接続し、マイクロ流体チャネルから流体を除去した。カスタムカットガラスとマイクロ流体チャネルのサンド...

発達における集団細胞移動、創傷治癒、癌転移は、多くの場合、成長因子またはシグナル伝達分子の勾配によって導かれる。ここでは、トラクション顕微鏡とマイクロ流体システムを組み合わせた実験システムと、生化学的勾配下での集団移動の仕組みを定量化する方法のデモンストレーションを行います。

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

集合的細胞の移動は、シグナル伝達分子の勾配によって導かれることが多い。このビデオでは、生化学的勾配によって導かれる集団移動中に細胞の力を定量化する方法を示します。そこで、マイクロ流体チップをトラクション顕微鏡と統合し、マイクロ流体チップを使用して生化学的勾配を生成し、トラクション顕微鏡を使用して細胞力を測定します。私の研究室のポストグラッドであるファンセク・チャン博士が手順をデモンストレーションします。10対1の比率でベースエラストマーと硬化剤を混合してPDMS溶液を調製する。ベースエラストマーの15ミリリットルを50ミリリットルの円錐チューブに入れ、1.5ミリリットルの硬化剤を加えます。これらのチューブの2つを準備します。PDMS混合物を5分間ボルテックスしてから、196時間gで気泡を除去する1分間の遠心分離を行った。PDMSステンシルを製造するには、PDMSがSU-8ピラーの側面に触れるのではなくSU-8パターンパターンの上部に触れないように、SU-8パターンの領域を避けながら、約1ミリリットルのPDMS混合物をウエハーに注ぎます。平らな表面に平らな表面に室温で30分以上置き、2時間以上摂氏80度の乾燥したオーブンでPDMSを治します。SU-8型からPDMSを慎重に剥がし、14ミリの中空パンチを使用して薄いPDMS膜をトリミングします。PDMSステンシルをオートクレーブする前に、粘着テープを使用してPDMSピースの表面のほこりを取り除きます。PDMSマイクロチャネルを製造するには、約30ミリリットルのPDMS混合物をSU-8型に注ぎます。真空チャンバーで30分間脱気し、乾燥したオーブンでPDMSを摂氏80度で2時間以上硬化させます。SU-8型からPDMSを慎重に剥がし、24ミリメートルの大きさにPDMSを24ミリメートルに切ります。各PDMSブロックで、1ミリメートルのバイオプシーパンチを使用して1つの出口と3つの入口を作成します。テキストプロトコルに記載されているように、ガラススライドを製造し、シンアナイズする。底ガラスの縁の面を100マイクロリットルのバインドシラン溶液で覆います。ガラスを室温で1時間放置した後、ガラスを脱イオン水で3回洗い流します。その後、周囲の空気温度で、または圧縮空気を吹くことによって、ガラスを乾燥させます。テキストプロトコルに記載されているようにポリアクリルアミドゲル溶液を調製する。その後、10マイクロリットルの混合ゲル溶液を長方形のマイクロウェルに移し、円形のカバースリップを上に置きます。カスタムガラス、ゲル溶液、カバースリップの組み立てを粘着テープで6ウェルプレートのカバーに固定し、それを反転させます。次いで96回gで10分間遠心分離機を用いて、ポリアクリルアミドゲルの最上層に蛍光粒子を持ち込んだ。遠心分離機からアセンブリを取り外し、カバースリップを下に向けた平らな面に置きます。30分後、アセンブリを反転し、35ミリメートルのペトリ皿に入れます。2ミリリットルの脱イオン水で皿を満たします。鉗子を使用して、カバースリップを片側にスライドさせてそっと取り外します。ポリアクリルアミドゲルにコラーゲンをコードするには、1ミリリットルのスルホ-SANPAHあたり1ミリグラムを暖かい50ミリモルHEPESバッファーに溶解します。200マイクロリットルの溶液をゲル表面に落とし、UV光で10分間活性化します。UV活性化後、ゲルを0.1モルHEPESバッファーで2回リンスし、次にPBSで1回リンスします。一晩で4°Cのコラーゲン溶液でポリアクリルアミドゲルをコード化します。翌日、PBSでゲルを3回洗います。F-127溶液にオートクレーブPDMSステンシルを浸します。摂氏37度のインキュベーターに1時間保管してください。PDMSステンシルをPBSで3回洗浄し、PDMSステンシルとポリアクリルアミドゲルの両方から液体を取り除きます。次に、ポリアクリルアミドゲルにPDMSステンシルを置き、そのステンシルにPBSを追加します。PDMSステンシルの穴の中の気泡を、穏やかにピペットして取り除きます。気泡を取り除いた後、PDMSステンシルの表面からPBSをクリアします。次に、200マイクロリットルの細胞溶液をPDMSステンシルに加え、細胞がポリアクリルアミドゲルに付着するようにインキュベーターに1時間置きます。インキュベーションに続いて、細胞培養培地で細胞溶液を静かに洗い流し、さらに細胞培養培地を添加する。PDMSステンシルを取り外し、顕微鏡下で細胞島の形成を確認します。次に、PDMSマイクロチャネルの表面を酸素プラズマで30秒間処理します。ポリアクリルアミドゲル充填底部ガラスの液体を取り除いた後、PDMSマイクロチャネルを底ガラスの上に置き、アセンブリをカスタムガラスホルダーに置きます。マイクロチャネルを細胞培養培地で満たします。統合されたマイクロ流体システムの入口管を準備するために、トリムされた針および30センチメートルのミニボリュームラインを三方向のストップコックと接続する。これらの取り決めの3つを準備します。出口管の場合は、トリミングされた針と75センチメートルのミニボリュームラインを3ウェイストップコックで接続します。チューブラインに、予熱された媒体を1時間充填します。注射器からプランジャーを取り除き、入口チューブラインを接続して、貯水池を準備します。各チューブラインの針コネクタを、マイクロ流体装置の3つの入口と1つの出口に差し込みます。新鮮な培地または調整された培地の3ミリリットルで各貯水池を充填します。勾配試験のために、細胞培養培地中の1ミリリットル肝細胞増殖因子(HGF)で左入口貯留層を20ナノグラム充填する。濃度勾配の可視化のために、左入口貯留層に蛍光染料1ミリリットル当たり200マイクログラムを加える。コンセントの管ラインをシリンジポンプに接続します。従来の蛍光顕微鏡のステージ上に、統合マイクロ流体システムを配置します。インキュベーターに収納された自動顕微鏡を使用して、最大24時間10分ごとに画像を撮影します。各時点で、細胞移動を可視化する位相画像、ゲルに埋め込まれた蛍光ビーズを可視化する緑色蛍光画像、化学物質の濃度勾配を可視化する赤色蛍光画像など、3つの異なるチャネルで4X対物レンズを使用して一連の画像を撮影します。タイムラプス画像を撮影した後、0.25%トリプシン-EDTA溶液をマイクロチャネルに注入し、ポリアクリルアミドゲルから細胞を取り外します。ゲルから細胞を完全に除去した際に、蛍光性の緑色の画像を撮り、トラクション顕微鏡の基準画像として使用します。テキストプロトコルの説明に従ってデータ分析に進みます。収縮力と細胞間ストレスを測定するために、トラクション顕微鏡と単層応力顕微鏡をマイクロ流体チャネルと組み合わせた。マップは、冷たい色を使用して暖かい色と内向きの牽引を使用して外向きの牽引と無線調整でプロットされました。時間ゼロでは、すべての島は、島内のエッジと変動に強い内向きの牽引を持つ同様の牽引分布を示しました。HGF勾配を適用した10時間後、島の拡大の程度は各列で異なっていたが、トラクション分布はタイムゼロとほぼ同様であった。平均トラクションは10時間変わりませんでした。しかし、単層応力を計算する際には、各列に異なる傾向が示されました。HGF濃度が低かった場合、島内の平均張力は10時間を通して約200パスカルを維持した。HGF濃度が高かったところでは、島内の平均張力は、前に示したように、10時間にわたって230パスカルから100パスカルに徐々に減少した。HGF濃度が左半分で高く、島の右半分が低かったところで、平均張力は150パスカルの周りに維持された。マイクロ流体チャネルを充填することは穏やかでなければなりません。同時にマイクロ親細胞の島を破壊しない一方でチャネルに閉じ込められた気泡を除去することが重要です。この統合システムを使用することで、ケモ誘引物質や成長因子などの様々な化学勾配に対して細胞集団がどのように機械的に反応するかを調べることができます。このプラットフォームは、再生、癌転移、および発達を理解するための鍵である化学勾配下の集団細胞移動の仕組みをさらに探求するのに役立ちます。

traction-microscopy-integrated-with-microfluidics-for-chemotactic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

マイクロ流体チャネルおよび斑状の栄養の海の風景とせん断流内細菌の遊泳行動の中で海洋微生物の化学走性採食行動を研究するための実験で、その実装の製造が記載されている。...

マイクロスケール栄養層への海洋微生物の走化性応答

マイクロ流体を用いた細菌走化性の研究 - インタビュー

このプロトコルは、chemoeffectorsの安定した濃度勾配で細菌の走化性を調べるためのマイクロ流体デバイスの開発を説明します。...

安定した濃度勾配で細菌走化性を定量化するためのマイクロ流体デバイス

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区分するマイクロ流体デバイスとライブセルイメージングを使用した癌幹細胞の移行の評価

出典: Scheidweiler, D., 他 流体装置と顕微鏡、フローサイトメトリーを組み合わせて、空間スケールを超えた多孔質培地内の微生物輸送を研究すること。 J. Vis.

マイクロ流体装置を用いた細菌の運動性評価

生細胞遊走試験のための顕微鏡検査室における接着剤および可溶性勾配のアセンブリのための方法が記載されている。エンジニアリング環境は、ソリューションの勾配と防汚表面と接着剤のトラックを結合し、したがって1つは、指導の手がかりの相対的な重要度を決定することができます。...

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細胞の移動は、人間の発達と生命の重要な部分です。細胞遊走を変化させるメカニズムを理解するために、3Dコラーゲンマトリックスの走化性を調査するための平面勾配拡散システムを提示します。...

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学ぶ マイクロ流体チップと牽引顕微鏡を統合した手法で、化学的勾配下での細胞集団移動時の力を定量化する方法です。創傷治癒やがん転移のメカニズム解明に応用できます。

化学的集団移動のためのマイクロ流体学と統合された牽引顕微鏡

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