ケネラブディティス・エレガンスの腸透過性に及ぼす細菌および化学物質の影響の測定
2019年12月3日
このプロトコルは、カエネラブディティスエレガンスの腸透過性を測定する方法を記述します。この方法は、腸内細菌とその宿主との相互作用に関連する腸の健康に関する基礎生物学的研究や、漏出性腸症候群および炎症性腸疾患を治癒するためのプロバイオティクスおよび化学薬品を同定するためのスクリーニングに役立ちます。
腸内微生物叢と腸の健康との相互作用に関連する基本的な生物学的研究に役立つこの方法.さらに, このプロトコルは、潜在的なプロバイオティクスと栄養補助食品のスクリーニングに使用して腸の健康上の問題を治療するために, 漏れやすい腸症候群や炎症性腸疾患など.このプロトコルは、高スループットイメージングシステムを使用して、様々な細菌および化学物質で処理されたC.elegansの腸透過性の迅速かつ正確な定量分析を可能にする。
この手法に精通していない科学者は、誤ったラベルやその他の間違いを避けるためにサンプルの数を制限することをお勧めします。この手順は、96ウェルプレートへのワームの転送やOperettaマシンの使用、ハーモニーソフトウェアなど、視覚的なデモンストレーションを必要とする多くのステップで構成されています。滅菌LB培地の500ミリリットルを調製することによって開始します。
P.aeruginosaの単一コロニーを培地に接種し、150rpmで振りながら摂氏37度で14〜15時間培養する。翌日、細菌培養物を2本の500ミリリットルチューブに均等に分配し、3、220倍g、摂氏4度で30分間遠心分離する。上清を取り除き、各チューブに25ミリリットルを残し、残りの総容量は50ミリリットルで、細菌ペレットを再懸濁する。
細菌培養物は、使用できる状態になるまで摂氏4度で保存します。C.elegansの腸透過性に及ぼす細菌の影響をテストするには、冷蔵庫から培養物を取り除き、それらを徹底的に渦液にします。各新鮮なNGMプレートに合計800マイクロリットルを加え、プレートを一晩20°Cのインキュベーターで乾燥させます。
薄板を準備するには、NGMの混合物を含む薄暗いのボトルにNGM寒天培地の50ミリリットルを追加し、十分に混ぜます。その後、各90〜15ミリメートルのペトリ皿に媒体の20ミリリットルを注ぎます。各ペトリ皿にNGM培地を含むDMSOを20ミリリットル加えてDMSOプレートを準備し、プレートを少なくとも3時間室温にして固化させます。
800マイクロリットルのボルテックス大腸菌またはP.aeruginosa培養物を新鮮なNGMプレートに広げ、プレートを一晩20°Cのインキュベーターで乾燥させます。S-バッファで年齢同期化されたL4幼虫を洗浄し、異なる細菌や化学物質を含むNGMプレートに約500のワームを移します。その後、48時間摂氏20度でプレートをインキュベートします。
2ミリリットルの熱不活性化大腸菌と4ミリグラムのFITC-dextranを混合して、FITCデキストランを補充したプレートを準備します。20個の新鮮なNGM寒天プレートのそれぞれに混合物の100マイクロリットルを追加し、きれいなラボベンチで1時間乾燥するプレートを許可します。48時間の治療の後、Sバッファーでワームを洗浄し、FITCデキストラン補充プレートとFITCデキストランなしでNGMプレートに移し、プレートを一晩インキュベートします。
翌日、Sバッファでワームを洗い、新鮮なNGM寒天プレートで1時間クロールできるようにします。黒い96ウェルの平底プレートの各ウェルに4%ホルムアルデヒドの50マイクロリットルを加え、各井戸に約50ワームを移します。1~2分後、ホルムアルデヒドをすべて取り出し、100マイクロリットルの取り付け媒体を各ウェルに加えます。
ホルムアルデヒドは有毒な化学物質であり、注意して取り扱う必要があります。蛍光画像をキャプチャするには、イメージングソフトウェア内の「開いた蓋」アイコンを押し、プレートをマシンに挿入します。[設定]をクリックし、プレートタイプを選択して、明視野チャンネルとEGFPチャンネルを追加します。
レイアウトを調整するには、[レイアウト] の選択に移動し、[トラック] を選択します。1 マイクロメートル、平面の数を 10、距離を 1 マイクロメートルに設定します。処理井戸の 1 つとキャプチャ フィールドを 1 つ選択し、[実験の実行] セクションで [テスト] を押します。
画像が十分に満足できる場合は、[設定] セクションに戻り、[リセット] アイコンを押します。次に、ターゲットウェルと適切な数のキャプチャフィールドを選択します。実行実験に移動し、プレート名を入力して[開始]を押します。
蛍光強度を測定するには、画像解析セクションに移動し、画像を入力し、EGFPチャンネルと方法Bを選択してセルを見つけ、原稿の方向に従ってパラメータを調整し、出力として平均を選択します。[適用]アイコンを押して、セットアップを保存します。[評価] セクションに移動してヒート マップとデータ テーブルを取得し、読み出しパラメータを調整してから評価を開始します。
C.elegansは、他の2つの細菌株と比較してP.aeruginosaでインキュベーションした後のFITC-デキストラン蛍光の有意な増加を示し、P.aeruginoaが上皮腸壁に対してより重要な損傷を引き起こし、腸透過性を増加させたことを示した。生きて、熱不活性化P.aeruginosaはC.elegansの腸透過性に非常に異なる効果を引き起こした。熱不活性化の際、蛍光画像と統計データの両方が、P.aeruginosaが線虫に対する毒性を引き起こさなかったことを示す。
DIMによる48時間の共同治療は、P.aeruginosaにさらされたワームの腸内のFITC-dextran蛍光強度を有意に減少させ、DIMが細菌感染によって引き起こされる腸透過性機能不全を治す良い天然物と考えることができることを示している。FITC-デキストランコーティングプレートの調製中は、FITC-dextranの光感度のために光の露出を最小限に抑える必要があることを覚えておくことが重要です。この技術は、細菌をテストすることによって腸内細菌とその活性成分の病原性およびプロバイオティクスの効果を決定するために使用することができます, だけでなく、それらの化学組成.
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
このプロトコルでは、腸管の健康状態や腸内細菌との相互作用を研究する上で不可欠な、Caenorhabditis elegansにおける腸管透過性の測定方法について説明します。本手法は、リーキーガット症候群や炎症性腸疾患などの疾患治療を目的とした潜在的なプロバイオティクスや化学物質のスクリーニングに特に有用です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 微生物学
- 腸内健康
背景
- 腸管透過性は、腸の健康を理解する上で極めて重要です。
- 微生物叢と宿主の相互作用は、健康状態に影響を及ぼす可能性があります。
- リーキーガット症候群（腸管漏出症候群）および炎症性腸疾患は、重大な健康上の問題です。
- ハイスループットイメージングシステムにより、迅速な解析が可能になります。
研究目的
- C. elegansの腸管透過性を測定する。
- 様々な細菌や化学物質が腸の健康に及ぼす影響を調査する。
- 治療に有用なプロバイオティクスやニュートラシューティカルスの候補を特定する。
使用方法
- 滅菌済みLB培地の調製。
- 線虫の96ウェルプレートへの転移。
- イメージングのためのOperettaマシンの使用。
- Harmonyソフトウェアを用いた解析。
主な結果
- 腸管透過性の定量分析を実現。
- 効果的なプロバイオティクスおよび化学剤を特定。
- ハイスループットスクリーニングにおける本手法の信頼性を実証。
- エラーを回避するためのサンプル管理に関する推奨事項を提示。
結論
- 本プロトコルは、腸管の健康状態を研究するための堅牢な手法を提供します。
- 本手法は、腸疾患に対する治療薬の同定に有用です。
- 今後の研究では、本手法を基に、より広範な応用への展開が期待されます。
よくある質問
産業界における重要性
本手法は、C. elegansを用いて腸管透過性に対する細菌および化学物質の影響を高スループットで表現型スクリーニングすることを可能にし、腸管健康介入のための初期段階のターゲット検証を支援します。また、定量的な蛍光読み取り値を提供することで、哺乳類での試験前にプロバイオティクスやニュートラシューティカル候補のメカニズム的なリスク低減を促進します。本アッセイは、上皮バリア機能の調節において予測的信頼性の高い化合物を優先的に選定するという、探索段階の取り組みに合致しています。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値： 細菌または化学物質に曝露させた際の上皮バリア完全性の機能的変化を測定することにより、治療仮説を検証します。
- 運用上の価値： 標準化された透過性測定を通じて、病原性株とプロバイオティクス株の迅速な比較を可能にします。
- 予測的価値： FITC-dextranのフラックスを減少させる化合物（バリア保護を示す）を特定することで、ポートフォリオの優先順位付けを支援します。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： スクリーニングカスケードにおけるヒット化合物の確認に適した、用量反応性のある定量的な蛍光データを生成します。
- 運用上の価値： 高スループットイメージングプラットフォーム（Operettaなど）と統合でき、再現性のある多条件解析が可能です。
- アッセイの適用性： 正規化された強度出力を算出するため、ラン間の比較や閾値に基づいた判定が可能です。
翻訳・前臨床研究
- トランスレーショナル・アライメント： 炎症性腸疾患のパスウェイに関連するリーキーガット表現型をモデル化するために、疾患に関連したシステムを使用します。
- メカニズム的なリスク低減： 透過性に対する生存菌と熱不活化菌の効果を区別することで、偽陽性を排除します。
- 前臨床の継続性： 哺乳類での検証前に腸管健康調節の表現型証拠を提供することで、次段階への進展決定を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このアッセイは、ターゲット仮説のスクリーニングからリード最適化に至る創薬の連続的なプロセスに適合しており、特に腸管標的のバイオ医薬品および低分子化合物に適しています。
- 探索生物学：定義された細菌株を用いて、微生物叢が誘発するバリア機能不全に関するメカニズム上の仮説を検証します。
- スクリーニング：化学ライブラリから、透過性を調節する活性を持つ化合物の一次および二次スクリーニングを可能にします。
- 分析：1匹あたりの平均蛍光強度を、条件間比較のための定量的な正規化リードアウトとして提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：保存された透過性メカニズムを介して、表現型の結果をIBD（炎症性腸疾患）やリーキーガット症候群の臨床的関連性と結びつけます。
- 企業的な再利用：複数のプロジェクトにわたってプロバイオティクス、プレバイオティクス、およびニュートラシューティカルをスクリーニングするための再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：表現型の透過性変化を特定の細菌的または化学的処置に結びつけることで、メカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用的価値：固定されたイメージングおよび解析プロトコルを通じて、研究室間での透過性評価を標準化する。
- 戦略的価値：腸管健康候補物質の早期の有効性シグナルを提供し、go/no-go決定を改善する。
- ポートフォリオへの影響：DIM様のバリア保護能を示す化合物の、リスク調整後の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- C. elegansのハンドリング、細菌培養、および蛍光顕微鏡の専門知識が必要です。
- ハイスループットイメージングシステム（例：Operetta）および画像解析ソフトウェア（例：Harmony）へのアクセスに依存します。
- 再現性を確保するため、虫のステージング、培養時間、およびFITC-dextranへの曝露時間の標準化が必要です。
- 表現型としての結果に限定されており、相補的な遺伝学的アプローチやオミックスアプローチなしには分子メカニズムを解明することはできません。
- モデル特有の蛍光の制約があるため、絶対的な透過性の定量化よりも相対的な比較に適しています。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Preparation of P. aeruginosa PAO1 Culture
1:58
Preparation of Nematode Growth Medium (NGM) Plates for Testing the Effects of Bacteria and DIM on the Intestinal Permeability of C. elegans
2:57
Bacteria or DIM Treatment and FITC-Dextran Feeding
4:19
Imaging of C. elegans with the Operetta Imaging System and Determination of Intestinal Permeability
5:43
Results: Effects of Bacteria on Intestinal Permeability of P. aeruginosa
6:40
Conclusion
