Name: 皮膚心筋細胞を用いた心機能のインビトロ評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 学ぶ皮膚心筋細胞を用いた心機能評価法。小さな生検サンプルからミオフィラメント機能とカルシウム感受性を測定し、心疾患の病態生理を解明する。治療介入のインビトロ評価にも応用可能。

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著者らは、ポルトガル科学技術財団(FCT)、欧州連合、クエロ・デリメンシア・エストラテジコ・ナシオナル(QREN)、フンド・ヨーロッパ・デ・デセンボルヴィメント地域(FEDER)、プログラム・オペラシオナル・ファクタレス・デ・コンペティティビダード(COMPETE)に感謝する。このプロジェクトは、COMPETEERによってサポートされています COMPETE2020 - プログラムオペラシオナルコンペティティビダーデEインテルナシオナリザサン(POCI)、プロジェクトDOCNET(NORTE-01-0145-FEDER-000003)、ノルテポルトガル地域運用プログラム(NORTE 2020)、ポルトガル2020パートナーシップの下で、合意、 欧州地域開発基金(ERDF)を通じて、リスボンの地域運用プログラムである欧州構造投資ファンドが支援するプロジェクトNETDIAMOND(POCI-01-0145-FEDER-016385)を通じて行います。パティシア・ロドリゲスはFCT(SFRH/BD/96026/2013)によって資金提供され、ジョアン・アルメイダ=コエーリョはユニバーシダード・ド・ポルト/FMUPとFSEフンド・ソーシャル・ヨーロッパによって資金提供されました。 NORTE 2020-プログラムオペラシオナル地域ドノルテ、(NORTE-08-5369-FSE-000024-プログラム・ドゥートレ)。

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<li>van der Velden, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+myofilament+function+contribute+to+left+ventricular+dysfunction+in+pigs+early+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Alterations in myofilament function contribute to left ventricular dysfunction in pigs early after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 95 (11), e85-e95 (2004).</li>
<li>Wakili, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+potential+molecular+contributors+to+atrial+hypocontractility+caused+by+atrial+tachycardia+remodeling+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Arrhythmia+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Multiple potential molecular contributors to atrial hypocontractility caused by atrial tachycardia remodeling in dogs.</a> Circulation: Arrhythmia Electrophysiology. 3 (5), 530-541 (2010).</li>
<li>Ait Mou, Y., le Guennec, J. Y., Mosca, E., de Tombe, P. P., Cazorla, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+cardiac+sarcomeric+proteins+in+the+myofibrillar+force+response+to+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of cardiac sarcomeric proteins in the myofibrillar force response to stretch.</a> Pflugers Archiv. 457 (1), 25-36 (2008).</li>
<li>Falcao-Pires, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus+worsens+diastolic+left+ventricular+dysfunction+in+aortic+stenosis+through+altered+myocardial+structure+and+cardiomyocyte+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus worsens diastolic left ventricular dysfunction in aortic stenosis through altered myocardial structure and cardiomyocyte stiffness.</a> Circulation. 124 (10), 1151-1159 (2011).</li>
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<li>Woulfe, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+of+Isolating+Myofibrils+From+Primary+Cardiomyocyte+Culture+Suitable+for+Myofibril+Mechanical+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">A Novel Method of Isolating Myofibrils From Primary Cardiomyocyte Culture Suitable for Myofibril Mechanical Study.</a> Frontiers Cardiovascular Medicine. 6, 12(2019).</li>
<li>Ait Mou, Y., Bollensdorff, C., Cazorla, O., Magdi, Y., de Tombe, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+cardiac+biophysical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Cardiology+Science+Practice%22%5BJournal%5D)">Exploring cardiac biophysical properties.</a> Global Cardiology Science Practice. 2015, 10(2015).</li>
</ol>

著者には利益相反はない。

皮膚付き心筋細胞を用いた心機能のインビトロ評価は、生理学的(例えば、ストレッチ)および病的文脈(例えば虚血)において心筋細胞レベルで起こる修飾を明らかにするための重要な技術を表す。この方法論は、解凍されたサンプルから得られた心筋細胞の機能を評価するために最小限の量の心筋を必要とするなどのいくつかの利点を有する。広範囲の種(マウス13、ラット1、14、15、ウサギ16、ブタ17、犬18、モルモット19およびヒト20)および心房、左および右心室または梗塞心臓の特定の領域を含む異なる心臓の位置を使用して、心筋細胞を使用する。さらに、この技術は、Ca2+およびエネルギー(ATP)の特定の濃度を提供しながら、そのネイティブ構成における規制および収縮構造の機能を測定することを可能にする。
この手法のシンプルさにもかかわらず、いくつかの重要な手順があります。サンプルコレクションを含め、最初から各ステップの品質を保証することが不可欠です。ミオフィラメントタンパク質はプロテアーゼ21に感受性である。したがって、収集直後に液体窒素にサンプルを保存することが義務付けられています。以前は凍結されていなかった新鮮なサンプルは、有意に高い力を発生させるので、同じプロトコルで新鮮なサンプルと凍結したサンプルで行われた測定を混合することはお勧めできません。2番目に重要なステップは、心筋細胞の抽出です。この手順の間、ほとんどの場合、氷上のサンプルを維持することが重要です。プロテアーゼ阻害剤カクテルは、抽出/透過性22中のタンパク質分解のリスクを低減するために使用することができる。第三に、このステップが無視されたときに質の高い心筋細胞を減らすことに注意したので、サンプルは正確なメスの動きを使用して小さな部分にカットする必要があります。もう一つの重要なステップは、トリトンを洗浄すること(細胞を透過させるが、その不活性化を促進する)とできるだけ多くの細胞を上清に保つこととの間の適切なバランスを持つことが困難であるため、心筋細胞を洗浄することです。まず、抽出と各サンプル、種またはプロトコルの洗い流しの数を試してみることが重要です。例えば、私たちの手の中で、ZSF1肥満ラット組織抽出は「脂肪」の側面を持っており、接着中にこれらの細胞はより滑りやすいが、測定することはより困難ではないことを指摘した。この問題を回避する方法は、動物1匹につき妥当な数の細胞を持つために、より多くの実験を行うことでした。さらに、良好な線条と妥当な長さで、接着する良いセルを選択することが重要です。心筋細胞がこれらの特徴を持たない場合、それは主に針の先端から切り離されるか、または無/低力を開発する。また、接着の時間と細胞を針に接着する有効性を考慮して、心筋細胞の付着に正しい接着剤を使用することも重要です。私たちの手の中で、シリコーン接着剤(材料のテーブル)は速く(10-15分)、十分に強く治ります。最後の重要なステップは、細胞を接着した後5分の心筋細胞を慎重に持ち上げ(細胞をカバースリップに接着することを避けるため)、ウェルに移動する前に(顕微鏡ステージで引きずられる細胞を避けるために)関連しています。 表 7 に、この手法に関連するトラブルシューティング、その根本的な原因、および頻繁な問題を解決するための可能な解決策をまとめます。
この方法の主な制限は、myofilamentの収縮性に関連するすべての質問(myofilamentが活性化/非アクティブ化する速度など)に答えることができないということです。in vivo設定では、細胞内脱分極、細胞内Ca2+ の増加および筋糸状細胞への拡散が収縮するために起こる必要があるのに対し、皮膚付き心筋細胞ではCa2+ の筋糸に対する拡散は、細胞がCa2+ 溶液に沈下されるとすぐに起こる。このより速い速度のCa2+ 拡散は、ミオブフィラメントの活性化/非活性化分析23にバイアスを与える。
これらの実験は、温度、溶液pH、機械的摂動(緩み再伸縮対緩み)および細胞付着手順(ピンタイ対接着剤)を含む異なる要因の影響を受けるが、これらの変数の全てはktrの点で文献の不一致を説明し、サルコメアの長さ依存的な力4,12の増加を示す。
この技術の将来の進歩には、透過性心筋細胞ではなく無傷で機能研究を行うすることが含まれる。この技術は、新たに単離された心筋細胞(以前は凍結されていない)に頼るという欠点を有する。この方法論に直接関係しない別の重要な問題は、それが大きく影響する可能性があり、それはサンプル凍結ストレージの最大期間に関連しています。具体的には、保存時間を通じてmyofilament分解の程度を確立することが必須である(すなわち、抽出された心筋細胞から導出された良好な品質の機能データを保証するために、凍結したサンプルを保存できる期間)。

従来、心筋の機械的特性の評価は、主に乳頭筋や柱状筋筋1,2などの多細胞製剤において試みられてきた。多細胞性心筋ストリップには、異種細胞集団が含まれ、その中には、オリエンテーションと力の発生、電気活動およびストレス/歪み分布、ならびに周囲の結合組織マトリックス3,4を含む収縮性心筋細胞が含まれる。コラーゲンを含まず、単一の心筋細胞を含む調製物は、サルコメア長さおよび交差ブリッジ収縮特性を非常に正確かつ制御された方法で測定することを可能にする5,6.したがって、過去40年間に、いくつかの方法論が開発され、単一の心筋細胞6,7の機械的、収縮性、および緩和特性を調査できる。これらの細胞の収縮機能は、サルコメア長さおよびクロスブリッジサイクリングキネティクス3に強く依存している。したがって、サルコメアの長さや性能、ならびにクロスブリッジ機能および収縮特性を評価することを考慮して、単一の単一の単一の心臓細胞で直接筋肉機能を調査することが望ましい。しかし、μNレベルでの力測定を記録しながら、合理的な光学サルコメア分解能を有する機能的心筋細胞の単離および取り付けは、依然として困難であり、3,6.その他の課題は、新たに採取した生検から心筋細胞を分離するために設置する必要がある物流です。例えば、ヒト生検コレクションの予測不可能性は、実験の実現可能性を危険にさらす可能性があります。
さらに、科学的手順(3Rの原理)のための動物実験の置き換え、削減および改良に関する倫理的な懸念は、細胞および組織レベル、好ましくはヒト生検、またはより小さな動物サンプルでの研究の変化を促進している。実際に、より小さなレベルの複雑さの中でインビトロで心機能を評価するための方法論の進歩的な改良は、結果を全身に適切に統合し、臨床シナリオ7に翻訳することを可能にする。全体として、-80°Cで保存されたサンプルを使用して心筋細胞を抽出することは魅力的な代替手段であり得る。
心筋組織は小片に切断され、モルタルと害虫で均質化される。この均質化の結果は、皮質変化の損傷を伴う皮の束と単離された細胞の懸濁液であり、そこで近視が入浴媒体にさらされ、すべての細胞成分が洗い流される。サルコレンマから遠く離れた筋線維のような構造は保存される。従って、筋細動装置に関連するサルコメアの短縮および機能的特性はそのまま保持され、8,9を記録することができる。
心筋細胞力測定システムは、心筋細胞長の調整に用いられる電磁モータと、等角心筋細胞収縮を測定する力トランスデューサーから構成されています。透過性、または皮をむいた心筋細胞は、リラックスした溶液([Ca 2+]<10nM)を含む実験室に配置され、シリコン接着は2本の細い針に接着され、1つはモーターに取り付けられ、もう1つは力トランスデューサに取り付けられる。心筋細胞の形態とサルコメアの長さを決定するために光学系が使用されます。実験プロトコルは、多くの場合、異なるCa2+濃度を含むバッファ溶液上の一連の力記録、アクチンミオシン架橋運動学の決定、およびあらかじめ定義されたサルコメア長さでの取り付けられた心筋細胞の受動的緊張の測定からなる(図1)。液体窒素で凍結した心筋試料からの透過性心筋細胞の分離(そしてその後-80°Cで保存される)は、細胞力学とタンパク質生化学を利用して断面積当たりの最大Ca2+活性化(活性)力(T∙活性、kN m-2)を測定する技術です。 受動)緊張(Tパッシブ、kN∙m-2)、筋ヒフィラメントCa2+感度(pCa50)、筋ヒフィラメント協同率(nヒル)、力再発達率(ktr)、ならびにTアクティブのサルコメア長依存性、Tパッシブ、pCa50、nHillおよびktr。
このプロトコルの目的は、異なる種の凍結サンプルから分離された単一の皮膚心筋細胞の機能的機械的特性を評価する信頼できる手順として、心筋細胞力測定システムの可能性を説明し、要約することです。

<table><tbody><tr><td>アセトン</td><td>Sigma</td><td>34580</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 5'-三リン酸二ナトリウム塩水和物 (Na2ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>炭酸カルシウム (CaCO3)</td><td>メルク</td><td>1.02067.0500</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>VWR</td><td>24720.157</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物 (MgCl2.6H2O)</td><td>メルク</td><td>1.05833.0250</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム溶液 (MgCl2 1M)</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)タウリン (BES)</td><td>Sigma</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>ホスホクレアチン二ナトリウム塩水和物 (Na2PCr)</td><td>Σ</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>メルク</td><td>1.04936.1000</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム (KOH)</td><td>メルク</td><td>8.14353.1000</td><td></td></tr><tr><td>プロピオン酸(C3H6O2)</td><td>メルク</td><td>8.00605.0500</td><td></td></tr><tr><td>シリコーンスクイーズチューブマリン</td><td>ランド</td><td>31003</td><td></td></tr><tr><td>トリチプレックス(EGTA)</td><td>メルク</td><td>1.08435.0025</td><td></td></tr><tr><td>トリトン&reg;X-100 10%</td><td>Merck</td><td>648463</td><td></td></tr><tr><td>組織ホモジナイザー (GKH GT モーター制御)</td><td>テレホートグラスコール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レングスコントローラー (モデル 315C-I)</td><td>オーロラサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フォーストランスデューサー (モデル 403 A)</td><td>オーロラサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア ASI 600A</td><td>オーロラサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソトウェア VSL (モデル 900B)</td><td>Aurora Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡 (IX51)</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

皮膚心筋細胞を用いた心機能のインビトロ評価

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

本稿では、単一の透過性(「皮をむいた」)心筋細胞を分離し、力測定装置とモーターに取り付けて機能研究を行うために必要な手順について説明します。これらの研究は、心筋細胞の剛性(受動的な力)とその異なるカルシウム(Ca2+)含有溶液による活性化を測定することを可能にする:最大力の発達、筋状放射状Ca2+感受性(pCa50)、協同性(nHill)および力再発達率(ktr)を決定する。この方法はまた、筋膜に直接作用する薬物の効果と、心筋細胞の活性および受動的特性の両方に対する外因性組換えタンパク質の発現の決定を可能にする。臨床的に、皮膚の心筋細胞研究は、多くの心筋疾患の病態生理を強調し、筋膜を標的とする治療介入の影響のインビトロ評価を可能にする。全体として、この技術は、開胸手術または移植手術中に得られた動物モデルとヒト組織におけるin vitroおよびin vivoパラメータの間の相関関係を調査することによって、心臓病理生理学の解明を可能にする。

このプロトコルは、皮をむいた心筋細胞を用いた心機能の抽出および評価の技術を段階的に記述することを目的とする。この方法論は、マウスから男性まで、異なる心臓の場所から収集することができる小さな凍結生検を使用して、myofilament機能の測定および急性調節を可能にする。

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

この技術により、動物モデルとヒトにおけるin vitroおよびin vivoパラメータの相関を調べることで、心疾患の病態を明らかにすることができます。この技術の主な利点は、非常に小さな生検または凍結保存されたサンプルを使用して、深部筋フィラメントの機能の研究を可能にすることです。この技術により、ミオフィラメントに対する治療的介入の影響をin vitroで評価することができます。実験を試みる前に、心筋細胞の抽出を数回練習して、適切なサイズ、縞模様、形状の心筋細胞を選択し、接着し、活性化する方法を学ぶことをお勧めします。手順を開始する前に、チャンバー内の試験装置の温度を摂氏15度に調整し、力変換器とモーターをオンにします。2.5ミリリットルのリラックスISO溶液が入ったペトリ皿で3〜5マイクログラムの心筋サンプルを解凍し、メスを使用して、不必要な細胞損傷を引き起こすことなく組織を細かく切断します。すべての組織を切断したら、カットしたピペットチップを使用して、溶液と組織片の全量をPotter-Elvehjemガラスに移し、グラインダーを使用して組織を毎分30〜40回転で機械的に破壊します。良好な細胞懸濁液が得られたら、2.25ミリリットルのリラックスISOを含む15ミリリットルのチューブに250マイクロリットルのトリトンを加え、得られた溶液に細胞懸濁液を加えます。チューブを3回静かに反転させて混合し、チューブを室温で1分間放置した後、氷上で4分間インキュベートします。アイスインキュベーションの終了時に、チューブの最終容量を15ミリリットルまで追加でリラックスISOし、示されているように反転してチューブを3回混合し、次に細胞を遠心分離し、上清の最後の3ミリリットルを除くほぼすべての液体を慎重に除去します。最後の洗い流しの後、上清を5〜10ミリリットルの細胞懸濁液まで取り除きます。スキン心筋細胞を選択するには、倒立顕微鏡スライドホルダーのスライドガラスの上に置いたカバースリップに細胞懸濁液を一滴加え、20倍対物レンズを使用して、良好な縞模様とサイズを持つ単一の棒状心筋細胞を選択します。選択した心筋細胞が力変換器とモーターの針に揃って水平に配置されるまで、両手でカバーガラスを回転させ、ピペットチップを使用してカバーガラスの側面に沿って接着剤の細い線を配置します。細胞を所定の位置に接着するには、力変換器の針先とモーターを接着線に浸して、両方の先端の周りに接着剤のハローを作成し、力変換器の針先をすばやく下に動かして心筋細胞の一方の端に接着します。モーターの先端とセルのもう一方の端でこの手順を繰り返します。5〜8分後、両方のマイクロマニピュレーターを同時に動かして針を約15マイクロメートル持ち上げ、細胞がカバーガラスに接着しないようにします。能動的力と受動的力、およびカルシウム感受性を測定するには、最初の実験井戸に55〜100マイクロリットルのリラックス溶液を充填し、2番目の実験井戸に55〜100マイクロリットルの活性化溶液を充填します。カメラソフトウェアを使用して、関心領域を明確な縞模様の心筋細胞の領域に設定し、サルコメアの長さを2.2マイクロメートルに設定します。心筋細胞の両極端の間の距離を測定し、その値を筋細胞の長さとしてソフトウェアに記録します。次に、針を少し高く動かし、顕微鏡ステージを静かに動かして、細胞がカバーガラスからステージの裏側にあるリラックス溶液を含むウェルに移動するようにします。細胞がカルシウム溶液および弛緩溶液中で連続的に出現したときに発生する2つの細胞短縮を含むプロトコルを選択する。等尺性収縮を誘発するには、顕微鏡のステージを動かして、心筋細胞がリラックスした溶液から活性化溶液に移動するようにします。フォースプラトーに到達したら、フォースデータの記録を開始します。10秒後、セルをリラックスした溶液に切り替え、テストが停止するまでデータを記録します。カルシウム感受性を決定するには、活性化溶液を各カルシウム溶液の55〜100マイクロリットルに交換し、示したようにデータを記録します。測定の最後に、力変換器とモーターの先端を伸ばして細胞から針を取り外し、アセトンに浸した綿棒を使用して針の先端から接着剤のハローを慎重に取り除きます。長時間の実験では、ある程度の劣化と力の減少が予想されますが、機能的な透過性心筋細胞内の活性張力の値は比較的安定しているはずです。ここでは、ミオフィラメントのカルシウム感受性のプロトコルを実行するために必要な8つの力の記録のうち3つの代表的な力の痕跡が示されています。活性化溶液を含むウェルに細胞を移すことにより、心筋細胞は力を発揮し始め、プラトーに達します。クイックスラックテストの後、ゼロフォースのベースライン値を取得できます。この曲線の最後の部分の傾きは、クロスブリッジの取り付けと剥離の見かけの速度の尺度である力の再開発率の値を決定するために使用できます。細胞をリラックスした溶液を含むウェルに戻した後、細胞はリラックスし、その力は低下します。ミオフィラメントのカルシウム感受性や長さ依存性活性化測定に加え、受動張力のサルコメア長さ依存性、断面積当たりのカルシウム活性化力のサルコメア長さ依存性、カルシウム非依存性張力を算出することができます。最後に、心筋細胞の分離方法が結果に大きく影響することに注意することが重要です。スキン心筋細胞を用いてin vitroで心機能を評価することは、細胞レベルで起こる変化を明らかにするとともに、さまざまな生理学的および病理学的条件におけるミオフィラメントのメカニズムを研究するための重要な手法です。この方法には、必要な心筋サンプルの量が最小限で済み、さまざまな種、心臓の位置、病状の心筋細胞を使用できるという利点があります。

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