2020年6月3日
解離した海馬細胞培養は、神経科学における極めて重要な実験ツールです。サンゴの骨格をマトリックスとして使用すると、神経保護的および神経調節的役割により、培養における神経細胞の生存と機能が強化されます。したがって、サンゴマトリックス上で増殖した神経細胞はより高い耐久性を示し、それによって培養により適しています。
このプロトコールの重要性は、ニューロン、グリア、および幹細胞の耐久性と成長をin vitroで向上させる新しい方法を提供することです。また、他のセルにも適用できます。この技術の主な利点は、珊瑚の骨格で作られたマトリックスの使用です。
このマトリックスは、神経細胞を育てて保護し、再成長を促進します。in vitroで神経細胞を支持するサンゴの骨格は、脳損傷部位の再生インプラントとして同様に機能する可能性があります。まず、ハンマーを使ってサンゴの骨格を壊し、0.5〜2センチメートルの断片に分割します。
有機残留物と非有機残留物を溶解するために、サンゴの骨格の断片を10%次亜塩素酸ナトリウム溶液に10分間浸します。次に、二重蒸留水で一度洗います。残りの有機残留物を除去するには、フラグメントを1モルの水酸化ナトリウム溶液に5分間浸し、次に二重蒸留水で1回洗浄します。
フラグメントを30%過酸化水素溶液に10分間浸し、フラグメントを二重蒸留水で3回洗浄することにより、有機堆積物の除去を続けます。余分な二重蒸留水をできるだけ取り除き、サンゴの破片をフードに入れて乾かします。次に、ガラスカバースリップを10ミリメートルのガラスシャーレに95%エタノールの10ミリリットルに浸して、ガラスカバースリップをきれいにします。
15分後、エタノールを取り出し、二重蒸留水で3回洗浄し、各洗浄の間に10分間待ちます。二重蒸留水を取り除き、摂氏80度の予熱プレートに皿を置きます。次に、二重蒸留水が蒸発するまでカバースリップを静かに攪拌します。
カバースリップをオートクレーブします。臼と乳棒を使用して、完全に分解されるまでサンゴの骨格の断片を粉砕します。20〜200マイクロメートルの範囲のサイズの粒子の混合物が得られます。
あるいは、刃の長さ6センチメートル、幅0.5〜1センチメートルの電気粉砕機を使用して、1000RPMの速度で30秒間珊瑚の骨格の破片を粉砕します。粒子を精製するには、粒子を電気式の40ミクロンフィルターメッシュストレーナーに移します。電気ストレーナの設定を600で揺らすように調整しますamp毎分amp、毎秒6回で跳ね返ります。
次に、穀物をオートクレーブします。無菌条件下で、サンゴの骨格粒をハンク溶液に溶解した20マイクログラム/ミリリットルのPDLに加え、1ミリリットルのPDL溶液あたり5ミリグラムまたは10ミリグラムの穀物の濃度を達成します。溶液を25平方センチメートルあたり約2ミリリットルの濃度でフラスコと皿に注ぎ、摂氏4度で一晩インキュベートします。
粒が沈み、底に付着します。翌日、フラスコと皿を滅菌二重蒸留水で一度洗います。フラスコと皿をフードで乾かします。
ガラスカバースリップをコーティングするには、まず、1ミリリットルあたり5ミリグラムまたは10ミリグラムの濃度で、サンゴの骨格粒を二重蒸留水に加えます。カバースリップを摂氏80度に予熱した加熱プレートに置きます。次に、40マイクロリットルの穀物溶液をカバースリップの中央に滴下し、完全に蒸発するまで15分待ちます。
これにより、粒子がカバースリップに付着します。コーティングされたカバースリップをオートクレーブし、無菌状態で保管します。次に、滅菌済みの24ウェルプレートの蓋にカバースリップを置き、各カバースリップに100マイクロリットル/ミリリットルあたり20マイクログラムのPDL溶液を追加します。
チップを使用して、液体が粒子領域全体とカバースリップ面の残りの部分を覆うことを確認します。蓋をプレートの底で覆い、その場所の側面をパラフィンフィルムで包みます。摂氏4度で一晩インキュベートします。
翌日、カバースリップを二重蒸留水で一度洗い、フードで乾かします。ラットの子犬の頭を準備したら、大きなピンセットで口から持ちます。小さなハサミで頭蓋骨を覆っている皮膚を切ります。
きれいなハサミで、小脳の側面にある頭蓋骨の下に入り、頭蓋骨を右と左に切って除去できるようにします。小さなピンセットを使用して、頭蓋骨を脳から剥がします。脳を頭から分離し、2ミリリットルの冷たいMEMが入った60ミリメートルのシャーレに入れます。
実体顕微鏡で、2つの小さなピンセットを使用して海馬を解剖します。MEMが入った準備した35mm皿に海馬を移します。海馬をメスで約1ミリ切ります。
200マイクロリットルのトリプシン溶液を追加します。穏やかに混合し、摂氏37度と5〜10%の二酸化炭素で30分間インキュベートします。インキュベーション後、トリプシンを不活性化するために、2ミリリットルの冷たいMEMを皿に加えます。
次に、最大直径のガラスパスツールピペットを使用して、トリプシン処理された組織を、摂氏37度に予熱した1ミリリットルの初日培地を含む15ミリリットルのチューブに移します。組織を最大径のガラスピペットに10〜15回通して組織を縮小します。次に、中径のガラスピペットを使用してこのプロセスを繰り返します。
最小径のピペットで粉砕を続けます。細胞死を減らすために、バブリングを避けてください。解離したティッシュペーパー片を2〜5分間沈めます。
次に、上清を別の15ミリリットルのチューブに移します。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。ミリリットルあたり200,000〜400,000細胞の間の好ましい細胞密度を達成するため。
初日は中程度を使用して希釈します。次に、各ガラスカバースリップに100マイクロリットルの細胞を播種します。カバースリップ全体をセルで覆うようにしてください。
摂氏37度と5〜10%の二酸化炭素でインキュベートします。翌日、500マイクロリットルのニューロン成長培地をウェルに加えます。ピンセットを使用して、カバースリップを傾け、各カバースリップを適切なウェルにそっと移すことにより、初日用メディウムを取り出します。
蓋から残りのメディアを吸引します。プレートを摂氏37度と5〜10%の二酸化炭素でインキュベートします。インキュベーターの底にある水のトレイを使用して、インキュベーターを最大限加湿します。
メディアを交換しないでください。これらの条件下で培養物は、最大1ヶ月間維持することができます。この研究では、手動研削盤と電気研削盤の両方で同様の結果が得られ、粒径は20〜200マイクロメートル
の範囲でした。手動または電気ストレーナーは、2種類の穀物混合物を製造しました。1つは40〜200マイクロメートルの粒径で、もう1つは40マイクロメートル以下の大きさです。位相差顕微鏡写真は、サンゴの骨格粒でコーティングされたカバースリップ上での海馬細胞の培養が、マトリックスの不在下および存在下で複雑なニューロンネットワークを形成したことを示しています。
細胞核染色は、播種後14日で、細胞密度がコーティングされていないカバースリップよりもマトリックス上で高かったことを示しました。微小管関連タンパク質2による染色は、対照群と比較して、マトリックス上に複雑なニューロンおよび樹状突起ネットワークが形成されることを示した。また、グリア線維酸性タンパク質を用いて可視化されたサンゴ骨格マトリックス上で増殖したグリア細胞は、大きな形態変化を遂げました。
それらは、コントロール基質上で成長したグリア細胞よりも長いプロセスで、より鋭く見える外観を獲得しました。細胞を分離する間、 サンゴ粒の剥離を防ぐために、速く作業し、必要に応じてCO2を追加してpHを維持し、できるだけ穏やかに作業することを覚えておくことが重要です。
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サンゴの骨格をマトリックスとして使用することで、神経保護および神経調節の利点を提供し、海馬細胞培養の解離が促進されます。この方法は、in vitroの神経細胞の耐久性と成長を高め、研究応用により適したものにします。
Durable dissociated neural cell cultures are critical for early-stage neuroscience drug discovery, enabling extended mechanistic studies and functional assays. The use of a biologically active coralline matrix addresses the persistent challenge of rapid cell death in vitro, supporting more reliable target validation and phenotypic screening. This matrix-driven approach enhances predictive confidence at key inflection points in neurobiology-focused R&D portfolios.
This matrix-based culture method fits at the interface of early discovery and assay development, enabling robust neural models for downstream screening and translational research.