Name: スクレラクチニアン細胞集団の分離のための蛍光活性化細胞選別 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: 学ぶ 蛍光活性化細胞選別による造礁サンゴの生細胞集団分離法。ゲーティング戦略で特定細胞型を同定し、純度と生存性を確保したまま単離します。サンゴ生物学研究に有用です。

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NTKは、この研究に資金を提供するための自然科学と工学のマイアミ大学研究賞を認めたいと思います.BRは、比較進化免疫学研究所に資金を提供してくれたアレックスとアン・ラウターバッハに感謝したいと思います。BRの研究は、イスラエル科学財団(ISF)番号によって支援されました: 1416/19 と 2841/19, HFSP研究助成金, RGY0085/2019.ザンナ・コゼクバエワとマイク・コネリーの技術支援に感謝します。また、マイアミ大学、ミラー医学部のフローサイトメトリー共有リソースに、シルベスター総合がんセンターのFACSサイトメーターへのアクセスとシャノン・サイグの技術サポートに感謝したいと思います。

1. エアーブラシとコンプレッサーによるサンゴ骨格からの組織の解離
注:氷の上でステップを実行し、手袋で手を保護します。
<ol><li>空気圧縮機、ホース、エアブラシを接続してエアブラシキットを組み立てます(図2)。圧力計を276-483 kPaの間にセットします。 注:この研究に使用される推奨コンプレッサーとエアホースは、393 kPaの最高圧力にプリセットされました。この276-483 kPaの範囲外での使用は、骨格からの不十分な細胞除去または細胞膜の破裂をもたらす可能性がある。この範囲は、種ごとに異なる場合があり、生存率テストを必要とする可能性があります。生存率試験は、単純なヘモサイトメーターと4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)染料排除アッセイを用いて、化合物顕微鏡で可視化された細胞スラリーのサブセットで行うことができる。</li>
	<li>オートクレーブで100mLの細胞染色培地を用意し、 滅菌ガラス容器は、3.3倍のリン酸緩衝生理食塩水(PBS;カルシウムおよびマグネシウムなし)の33mLを最終濃度3.3倍、2mLの胎児子牛血清(FCS;30分間56°Cで不活性化)を総体積の2%に、2mLの1M HEPESバッファーを最終濃度20mMに加えた。その後、滅菌水で100 mLでトップオフ。 注:3.3倍のPBS濃度は、Rosental et al.18で示されるように、海水の含量を模倣するために選ばれました。この濃度は、その他の環境で見つかった種が彼らの動物性を模倣するために調整する必要があります。</li>
	<li>10 mLのセル染色媒体をエアブラシボトル(図2の「F」と表示)に移し、エアブラシコネクタ用のアダプター蓋を取り付けます。 注:より大きな断片や組織層が厚い種は、適切な組織除去のためにより多くの媒体を必要とするかもしれません。</li>
	<li>ここで示す分岐サンゴ種については、ボーンカッターを使用して、約3〜5cmの長さまたは4cm2の面積でサンゴの破片をクリップまたはカットします。 注: サンプルダウンストリームから除去されず、FACS 解析および並べ替えプロセス中にサンプルが汚染されるため、このフラグメントはマクロ藻類やその他の多細胞生物から離れていなければなりません。1 cmのP.ダミコーンの断片は、濾過、染色、洗浄後に約2〜10 x 106個の細胞を与えます。</li>
	<li>サンゴの破片をプラスチック製のコレクションバッグの中に入れ、エアブラシを使って細胞染色媒体をサンゴにスプレーします(図2)。ほとんどのスケルトンが公開されるまで、このプロセスを続行します。コレクション バッグから残りのスケルトンを取り出します。</li>
</ol>2. サンゴ組織からの細胞の解離
注:氷の上のすべてのステップを実行し、手袋で手を保護します。
<ol><li>40 μm ナイロンセルストレーナーを通してセルスラリーを 50 mL 遠心管にフィルターし、単一のセル懸濁液を得ます。 注:異なる細胞ストレーナーメッシュサイズは、異なる種に適している可能性があります。しかし、サイズが大きいと、破片や細胞塊の通過により、組織解離が不十分になる可能性があります。<ol>
<li>粘液層が厚い検体の場合は、1 mLプラスチックシリンジの殺菌されたプランジャーを使用し、フィルターに対してそっと粉砕して塊を分解し、細胞がストレーナーを通過するのを助けます。ストレーナーとプランジャーを細胞染色媒体で遠心分離管にリンスします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>450 x gで4°Cで5分間遠心分離して細胞をペレットにし、上清を取り除き、細胞染色媒体の1 mLで細胞を再懸濁します。</li>
</ol>3. 細胞染色
注:氷の上のすべてのステップを実行し、手袋で手を保護します。このプロトコルで紹介されている汚れは表現目的です。代替染色は、異なる濃度およびインキュベーション時間を必要とする。
<ol><li>500 μL の再懸濁セルを 5 mL ラウンドボトムチューブに移し、コントロールサンプルとして取っておきます。このアリコートに汚れを加えないで下ろしてください。</li>
	<li>残りの細胞懸濁液に、0.42 μLの12 mM DAPI生存率染料(材料表)、5μM活性酸素種(ROS)染色の1μL(材料表)、0.2μMリソソーム染色の0.1μL(材料表)を加える。ピペットはよく混合し、光の漂白を防ぐために暗闇の中で30分間氷の上でインキュベートします。 注: DAPI は、FACS マシン上の死んだ細胞の微分格分の DNA 染色と生存性染料として動作するためにこの例で使用されます。これは、DAPIが膜の完全性のために死にかけている細胞に浸透することを前提としています。ROS染色体は520nmの範囲(緑色)で発光し、リソソームマーカーは約668nm(赤色)で発光する。</li>
	<li>450 x gで4°Cで5分間遠心分離することにより染色した細胞のペレット500 μLを5分間除去し、500 μLの細胞染色媒体でペレットを再懸濁します。新しい5 mLラウンドボトムチューブに移し、氷の上に保管します。</li>
</ol>4. FACS の起動
注: レーザーとチャンネルの違いにより、サイトメーターの作成とモデルによって手順が異なる場合があります。このプロトコルでは、405、488、535、および640 nm波長レーザーを有するサイトメーターが使用された。このプロトコルで取り上げたフィルタは、表現用です。代替細胞染色は、異なるフィルタおよびレーザーのセットを必要としてもよい。
<ol><li>ソーターソフトウェアで新しいプロジェクトテンプレートの作成を開始し、レーザーパネルを選択します。表される染色と自然蛍光の組み合わせについては、4つのレーザー(405、488、535、および640 nm)をすべて選択します。</li>
	<li>実験で表される各予想色に適したフィルタを選択します。<ol>
<li>DAPI 放出を検出し、生細胞と死んだ細胞の分離を支援するには、DAPI、Hoeschst、パシフィック ブルー フィルターなど、バンドパス (BP) が 450/50 (425-475 nm 範囲) のフィルターを使用します。</li>
		<li>緑色のROS信号によって放出される光の検出には、フルオレセイン・イソチオシアネート(FITC)または緑色蛍光タンパク質(GFP)フィルターなどのBP530/30(波長範囲515-545 nm)のフィルタを使用します。このフィルターは、各セル内のROSの濃度を測定します。</li>
		<li>リソソーム染色発光を検出するために、670/30(655-685 nm範囲)のBPを追加して、アロフィコシアニン(APC)フィルタを追加します。 注:APCチャンネルは、貪食活動の測定を可能にします。このチャネルはまた、家族共生藻科からサンゴ共生藻類によって生成された自己蛍光を検出します。ただし、この信号は、APCフィルタよりも長い波長を持つ追加のチャンネルを使用して分離することができます。</li>
		<li>最も一般的に使用されるフィコエリセリン、シアニンフィルター(APC-Cy7)など、780/60(750-810 nm範囲)のBPを有するフィルターを含め、共生生物細胞からの極赤色自家蛍光の放出を検出し、アポシンバイオティクス細胞の単離を助ける。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. FACS の格言のセットアップ
注:ステップは、サイトメーターの作成とモデル、およびサイトメーターと組み合わせた取得プログラムによって異なる場合があります。
<ol><li>サイトメトリーソフトウェアのプロジェクト実験画面で、散布図を作成し、Y 軸の X 軸と側面散布 (SSC) のメトリックとして前方散布 (FCS) を選択します。 メモ: FCSはセルのサイズと相関し、SSCは粒度と相関します。ほとんどの場合、無傷の細胞よりもサイズが小さいため、ほとんどの破片の除去が可能になります。</li>
	<li>セルサイズと粒度は、特にサンゴでは数桁異なる場合があるため、軸を対数スケールまたは二重指数スケールに設定します(図 3A) 。</li>
</ol>6. FACS分析と細胞分離
注: ステップは、サイトメーターの作成とモデルと結合取得プログラムによって異なる場合があります。
<ol><li>細胞計のサンプルチャンバーにコントロール(すなわち、未染色細胞サブセット)を配置し、読み取りプロセスを開始する。コンピュータが各セルまたはイベントからデータを受信し始めると、散布図にドットが表示され始めます。以前の実験からサイトメーター室に残っている破片を取り除くために、分析を開始する前に約30 sを通過させる。</li>
	<li>散布図では、ポイントを中央に配置するために、フォトマルチプライヤ管(PMT)電圧を調整します。 注:PMT電圧は、測定される光子の信号強度を増幅するために使用されます。PMT電圧が弱すぎると、読み取られるセルが少なくなり、PMT電圧が強すぎると、セルは最大値に近い値で測定され、異なるセルタイプは互いに区別できなくなります。適切な PMT 電圧により、独立して識別可能なイベントが散布図に取り込まれます。FSC および SSC 散布図に対数スケールまたは二重指数スケールを投影することで、イベントの分離を視覚化しやすくなります。</li>
	<li>イベントの記録を開始します。サンプルを節約するために、約 15,000 のイベントが読み取られた後でデータ取得を一時停止します。ほとんどの場合、これは、全体的な細胞の母集団パターンを視覚化するのに十分です。小さな特殊な細胞集団を分析し、隔離する場合は、より多くのイベントを記録します。</li>
	<li>FSC および SSC の最初のグラフで、FSC X 軸上の 102マーク以上のセルの選択(ゲート)を作成します。この閾値を下回るものは、細胞の破片である可能性が高い。矩形のゲートを描画します, フローサイトメトリーソフトウェアプログラムの定期的なオプションであり、明確な、明確な細胞集団のために良いです.散布図で不規則な形状を取るセルの母集団の場合は、ポリゴン ゲーティング オプションを使用します。 注:前方散乱の102の最小カットオフは、最小のサンゴ細胞のために選択する必要がありますが、破片の汚染を可能にする可能性があります。これを修正するには、より保守的となるように格言の下限を増やします。</li>
	<li>X 軸に DAPI フィルターを表し、Y 軸に APC-Cy7 フィルターを表す新しい散布図を作成します。これを行うには、手順 6.4 で作成した無傷のセルのゲートを選択し、右クリックして、新しい散布図を作成するオプションを選択します。軸を対数スケールまたは二重指数スケールに調整します。 注: 新しいプロットを作成するために必要な手順は、ソフトウェア プログラムによって異なる場合があります。</li>
	<li>サイトメーターチャンバーからコントロールサンプルを取り出し、染色した細胞と交換します。分析を開始してデータを記録する前に、30 s を渡します。一時停止する前に約 15,000 個のセルを記録します。 注:APC-Cy7スケールの上端の明確な集団は、シンビオジニア科からの高い赤色の自己蛍光を有するものである。これらの集団の中断を視覚化するためにシミは必要なく、コントロールサンプル記録でも見ることができます(図3C)。さらに分化するために、Y軸の低いサンゴのみの集団を選択します。</li>
	<li>アポシンビオティック細胞の新しい散布図を作成してROS濃度(FITCフィルタ)とリソソームに陽性の細胞(APCフィルタ)を視覚化し、対数スケールまたは二重指数スケールを再び利用します。 注: アポシムビオティックである複数の異なる細胞集団がある場合、それぞれが独自の散布図でさらに区別することができます (図 3C,D)。</li>
	<li>コントロールの最初の記録を使用するか、コントロール グループを再挿入して再実行することにより、スタイズされていないサブセットのコントロールと、染色されたサンプル グループを比較します。染色されたサンプルグループに固有のイベントをゲートします。</li>
</ol>7. FACS の並べ替えと収集
注:ステップは、サイトメーターの作成とモデル、およびサイトメーターと組み合わせた取得プログラムによって異なる場合があります。
<ol><li>収集対象として選ばれた細胞の選択により、細胞の採取チャンバーにマイクロ遠心チューブ(250-500 μLの細胞培養培地またはリシスバッファーを含む)をサイトメーター採取チャンバーに配置します。 注:表現されたフローサイトメーターは、一度に4つの異なる集団を選別することができ、機械は様々な遠心管および96の井戸板を含むさまざまな収集装置を、収容するように構成することができる。</li>
	<li>細胞メーターがサンプルを読み始め、残骸を洗い流すために適切な時間が経過したら、所望の集団を選別し、20,000個の細胞から数百万個の細胞を収集します。<ol>
<li>50万個を超える細胞について、細胞培養培地またはリシスバッファーの体積、および収集装置の体積を調整する。</li>
		<li>インビトロ研究では、インキュベーターまたは滅菌環境に入れるまで氷の上に細胞を保管します。</li>
		<li>分子研究のために、すぐにDNA/RNA/タンパク質の分離プロセスを開始するか、またはフラッシュフリーズし、抽出するまで-80°Cで保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>新しい染色、種、またはソーターを使用するたびに、少なくとも20,000個の細胞を500μLの染色媒体に選別し、ソートされた細胞を再分析し、最初にソートするために使用されるゲート内で細胞が読み取られていることを確認することによって、関心のある集団の純度チェックを行う(図4)。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、ローゼンタールら18から適応され、P.ダミコーンの細胞の同定および単離のために開発された。この方法論は、相対細胞サイズ、相対細胞粒度、細胞自家蛍光、無傷の細胞膜の存在を含む細胞固有因子の検査を通じて、破片、生存不可能な細胞、および共生細胞を除去するためにサンプルをフィルタリングするプロセスに焦点を当てています。これらの技術は、他のサンゴ種に適用することができます。しかし、FACSの格言戦略は、細胞集団特性における種特異的な違いによって異なる可能性がある。
サンゴの健康を理解するためのFACSの有用性は、細胞を差別的に識別し、単離するために多様な細胞固有の要因を使用する能力にあります。また、このプロトコルは、生存率、活性酸素種濃度、およびリソソーム含有量に基づいてサンゴ細胞を分化するための外因性細胞染色の追加使用について説明する。ローゼンタールら18で以前に試験された30+の市販マーカーのうち、24個の標識P.ダミコルニス細胞のうち、1...

サンゴ礁は地球上で最も重要な生態系の一つです。彼らは、魚や無脊椎動物に重要な生息地を提供することによって生物多様性を促進し、観光を通じて食料と経済的生活を提供することによって人類起源のコミュニティを維持するために重要です1.サンゴ礁のキービルダーとして、サンゴの動物(Phylum:Cnidaria)はまた、波と嵐の被害を軽減する大きな炭酸カルシウムフレームワークを作成することにより、沿岸のコミュニティを支援します 2.
大人としてのサンゴは、ウイルス、アルカエア、細菌、プロティスト、真菌、そして最も顕著に、藻類ジノフラゲラートファミリーシンビオダニア科シンビオダニア科のメンバーを含む幅広いendosymbioticパートナーをホストするセシル動物である。環境の変化は、このコミュニティの不均衡を引き起こす可能性があり、多くの場合、共生シンビオジニア科がサンゴのコロニーから追放される病気の流行やサンゴの漂白につながり、サンゴの主要な栄養源を排除します。これらのシナリオの両方は、多くの場合、サンゴのホスト44、5、65の死を6引き起こします。急速な気候変動のような人為的ストレス源の影響は、大量のサンゴの死のイベントを加速し、サンゴ礁の世界的な減少につながっている7.
最近、サンゴ礁の損失を軽減するために、さまざまな方法が開発されています。これらの方法には、既存のサンゴ礁へのサンゴの植え付け、熱的に耐性な遺伝子型を用いた遺伝的交差、およびサンゴ内でホストされる微生物および共生群の細胞操作が,含まれる。これらの努力にもかかわらず、サンゴ細胞の多様性と細胞機能10、11、12、13,12,については、まだまだまだ不明です。10,13サンゴ細胞の多様性と細胞機能を十分に理解することは、サンゴの生物が規範的でストレスの多い条件下でどのように振る舞うかを理解する必要があります。復元と保存の効率を最大化する取り組みは、細胞の多様性と遺伝子機能がどのように結合されているかを理解する上で役立ちます。
細胞の多様性と機能に関する以前の研究は、主に組織学的研究と組織全体RNAサンプリング1414、15、16、1715,16に焦点を17当てていました。サンゴの特定の細胞型機能に関するより詳細な情報を得るためには、生きたサンゴ細胞の特定の集団を単離する方法が必要です。これは、蛍光活性化細胞選別(FACS)フローサイトメトリー技術18によって非古典モデル生物において正常に行われている。FACSは、さまざまな波長に合わせたレーザーの組み合わせを利用して、相対細胞サイズ、細胞粒度、自己蛍光などの単一細胞レベルで異なる内因性細胞特性を測定します。さらに、細胞は、特定の、所望の特性18、19,19を測定するために蛍光標識された化合物によってマークされてもよい。
これまで、サンゴ細胞へのフローサイトメトリーの適用は、主にそれらの強い、自然自家蛍光20、21、22,21,22を利用して共生共生共生共生および他の細菌集団の分析のためであった。FACSはまた、参照モデル生物細胞23,24に対して蛍光DNAマーカーシグナルを用いてサンゴゲノムサイズを24推定するためにも用いられている。FACSの効率的な適用は細胞生物学の研究のために有用である3つの異なったツールを提供する:1)単一細胞の形態学的および機能的記述;2) 下流の研究のための特定の細胞集団の同定、分離および分離;3)単一細胞レベルでの機能アッセイの分析。
サンゴ細胞の研究のための様々な外因性蛍光マーカーの開発と応用はほとんど未踏のままです。そのようなマーカーは、タグ付きタンパク質、酵素のタグ付き基質、または他の化合物に対する蛍光応答を含むことができる。これらのマーカーは、リソソームのような特定の細胞コンパートメント機能の様々な量を生成する細胞を強調するなど、ユニークな特性を持つ細胞タイプを識別するために使用できます。その他の例としては、蛍光標識ビーズを使用して、貪食に適した細胞を機能的に同定すること、または標的病原体25の巻き込みである。免疫応答で活性な細胞の集団は、これらの外因性に適用されたビーズの巻き込み後にFACSによって容易に同定することができる。従来の組織学的方法では、保存された組織とビーズ巻き込みのための細胞陽性の割合を近似するために何時間も必要ですが、病原体の巻き込みのためのFACSベースの機能アッセイは、単離された生きた細胞に比較的迅速に実行することができます。ストレスに対する細胞特異的な反応を研究することに加えて、この技術は、遺伝子特異的発現を解明し、カリコ芽細胞やクニドサイトのような細胞型に完全に特有の細胞型の進化的および発達的歴史を明らかにする可能性を秘めています。
最近では、30以上の細胞マーカーを集中的にスクリーニングし、サンゴ細胞に標識が可能な24個を同定し、そのうち16個はユニークな集団18を区別するのに有用であり、分化クラスター(CD)を作った。ここでは、ポシロポラダミコーンスにおけるサンゴ細胞単離法が炭酸カルシウム骨格から細胞を除去することから、FACSを用いた特定の細胞集団の同定および単離に及ぶ過程について説明する(図1)。

<table><tbody><tr><td>エアブラシキット&コンプレッサーTCP</td><td>グローバル</td><td>ABD KIT-H-SET</td><td>Paasche Hシリーズシングルアクションサイフォンフィードエアブラシキット、マスターTC-20コンプレッサー&エアホース</td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>ボーンカッター</td><td>バルクリーフサプライ</td><td>205357</td><td>Oceans Wonders コーラル ストーニー ボーンカッター</td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td>コーニング</td><td>352340</td><td>40 um;BDファルコン;個別に包装されています。不妊;ナイロン</td></tr><tr><td>CellRox Green</td><td>Life Technologies</td><td>C10444</td><td>2.5 mM in DMSO;励起/発光:485/520 nm</td></tr><tr><td>コレクションバッグ</td><td>グレインジャー</td><td>38UV35</td><td>Reloc ジップピット 6"L x 4"W ジッパーシールクロージャー付き標準再閉可能ポリバッグ、透明; 厚さ 2 mil</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>10mg in H2O;励起/発光:358/461 nm</td></tr><tr><td>子牛胎児血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-100ML</td><td>57°Cで熱不活性化。C 30分間</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Bright-Line 血球計算計</td></tr><tr><td>HEPES バッファー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Deep Red</td><td>Life Technologies</td><td>L12492</td><td>DMSO 中の 1mM;吸収/放出:647/668 nm</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td>1.7 mL</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>pH 7.4; 10X</td></tr><tr><td>丸底チューブ</td><td>VWR</td><td>352063</td><td>5 mL ポリプロピレン丸底チューブ</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1 mL BD Luer-Lokシリンジ滅菌、ポリカーボネート専用</td></tr></tbody></table>

スクレラクチニアン細胞集団の分離のための蛍光活性化細胞選別

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

サンゴ礁は、人類起源のストレッサーによって脅威にさらされています。これらのストレッサーに対するサンゴの生物学的応答は細胞レベルで起こり得るが、メカニズムはよく理解されていない。ストレッサーに対するサンゴの反応を調べるには、細胞応答を分析するためのツールが必要です。特に、細胞集団がストレスにどのように反応しているかを理解するために、機能アッセイの適用を容易にするツールが必要です。今回の研究では、蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して、石のサンゴの異なる細胞集団を分離します。このプロトコルには、(1)骨格からのサンゴ組織の分離、(2)単一細胞懸濁液の作成、フローサイトメトリー用の各種マーカーを用いたサンゴ細胞の標識、および(4)ゲーティングおよび細胞選別戦略が含まれる。この方法により、研究者は、さまざまな細胞集団の分析、機能アッセイ、遺伝子発現研究のために、細胞レベルでサンゴに取り組む。

全体的に見て、このプロトコルは機能分析に使用できる生きたサンゴ細胞集団の同定および収集を容易にするので有用である。このワークフローは、サンゴ組織を基になる炭酸カルシウム骨格から機械的に分離することから始まった(図1)。不適切な技術は細胞死亡率が高く、大量の破片を生み出す可能性があるため、これは最も重要な初期ステップの1つです。酵素分離は、組織せん断の増加と高い細胞死亡率をもたらす可能性があるため、推奨されません。エアブラシを用いた機械的分離は、これらの課題を軽減し(図2)、平均細胞死亡率を〜10%に減少させる(データは示さない)。スケルトンからの組織のエアブラシ媒介機械的分離に続いて、得られたスラリーを、細胞ストレーナーを濾過して細胞懸濁液に濾過した。次いで、細胞懸濁液をDNA(DAPI)、ROS、およびリソソームマーカーで染色し、FACSサイトメーターによって読み取った。その後、使用されている細胞マーカーに基づいて特定の細胞集団を単離するための格言戦略...

サンゴは、人間と海洋生物の両方にとって重要な生物多様性生態系を作り出します。しかし、多くのサンゴ細胞の可能性と機能をまだ理解していません。ここでは、石のサンゴ細胞集団の単離、標識、分離のために開発されたプロトコルを紹介する。

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

このプロトコルは、これまで不可能な記述レベルで生きたサンゴ細胞集団の同定と単離を容易にする。この技術の主な利点は、これまでほとんど達成不可能であった細胞特異性のレベルへのアクセスを可能にすることです。この手順を実証するのは、シルベスター総合がんセンターのフローサイトメトリー共有リソースの研究員であるシャノン・サイグ博士です。ライブサンゴ細胞のソート用のフローサイトメーターを設定するには、フローサイトメーターソフトウェアで新しいプロジェクトテンプレートを開き、レーザーパネルで分析に適したレーザーを選択します。次に、適切なプロットに側面散布図と前方散布図を作成し、格子および解析戦略を設定します。フローサイトメトリック分析と生きたサンゴ細胞の選別のために、細胞計のサンプルチャンバーにコントロール未染色細胞サンプルをロードし、読み取りプロセスを開始します。サンゴ細胞は特に壊れやすいので、細胞のリシスを防ぐために細胞メーターの圧力を低く保ちます。散布図では、写真の乗数電圧を調整してポイントを中央に配置し、イベントの記録を開始します。前方散布図では、前方散布図の 10 から 4 番目のマークの周りに、セルの周囲にゲートを作成します。コントロールサンプルを染色した細胞の最初のサンプルに置き換え、一時停止する前に約10,000個のセルを記録します。次に、染色されたサンプルグループに固有のイベントをゲートします。生きたサンゴ細胞を選別するには、フローサイトメーターソフトウェアで関心のある細胞集団を選択した後、適切な回収液の250〜500マイクロリットルを含む1つのマイクロ遠心チューブを、各集団が選別するサイトメーターコレクションチャンバーに入れる。残骸を洗い流すために適切な時間が経過したら、所望の集団を選別して10,000から数百万個の細胞を収集します。新しい染色、種、またはソーターを使用するたびに、関心のある少なくとも20,000個の細胞を500マイクロリットルの染色媒体に分類して、対象の集団に対して純度チェックを行い、ソートされた細胞を再分析して、最初のソートに使用されるゲート内でイベントが読み取られていることを確認します。インビトロ研究では、並べ替えられた細胞をインキュベーターまたは滅菌環境に移すまで氷の上に保管します。サンゴ細胞と同じ形状や粒度を共有しない他の非細胞粒子を持ち込むためには、前方および側面散布図でゲート選択を作成することにより、解析から除去することができます。死細胞は、ヒストグラムを用いて染色されていない細胞懸濁液のDAPIシグナルを比較し、高DAPI発現細胞を外に出すことによって除外することができる。並行して、自己蛍光共生症をホストする細胞は、遠赤色チャネル内の高いシグナルを有する細胞に対して行うことによって除去することができる。この反復ゲーティングプロセスの後、残りの細胞は共生性を欠く無傷の生きたサンゴ細胞集団を表す。これらの細胞は、活性酸素種活性および/またはリソソーム含有量などの特徴を染色することによって、異なる細胞亜集団に分類することができる。一部のセルは他のセルよりも脆弱であり、このプロセスを可能な限り慎重に実行することが重要です。特定の細胞が単離されると、細胞培養の確立やトランスクリプトームプロファイルの作成などのx-vivo機能アッセイに使用できます。

fluorescence-activated-cell-sorting-for-isolation-scleractinian-cell

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

植物材料から、特定の種​​類の細胞を単離する方法が示されている。この手法は、特定の細胞型、細胞の解離と蛍光活性化細胞選別に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマーカーラインを採用しています。さらに、成長のセットアップがの治療を容易にするここで確立されている...

植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

癌関連線維芽細胞（CAFS）は増殖、血管新生、炎症を促進し、そのシグナル伝達を介して腫瘍の開始、成長と進行を容易にします。ここでは、表面マーカーとしてPDGFRαを使用して、細胞選別により新鮮なマウスおよびヒト組織由来正常線維芽細胞とCAFSの純粋な集団を単離するための方法を説明します。...

蛍光活性化細胞選別（FACS）によって新鮮な組織からの正常および癌関連線維芽細胞の分離

このプロトコルの目的は、蛍光活性化セルソーティング（FACS）を用いて、ヒトのリンパ奇形嚢胞様血管および包皮を裏打ちするリンパ管内皮細胞を単離することです。その後の細胞培養およびこれらの細胞の拡大は、遺伝的プロテオミクス、機能および細胞分化の研究のための実験的な洗練の新しいレベルを可能にします。...

マルチパラメータ蛍光活性化細胞選別によるヒトリンパ内皮細胞の単離

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚から単一細胞を分離する方法、目的の細胞を濃縮する方法、マイクロ流体ベースの単一細胞マルチプレックスシステムでゼブラフィッシュ細胞を捕捉する方法、および単一細胞からの遺伝子発現を評価する方法を説明しています。...

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

成体幹細胞の生物学を研究するための理想的なモデルは、マウスの毛包です。ここでは、マウスの背側皮膚の酵素消化とそれに続くFACS分析を使用して、毛包幹細胞と表皮ケラチノサイトの異なる集団を分離するためのプロトコルを紹介します。...

背マウス皮膚から毛包幹細胞と表皮角化細胞の単離

このプロトコルは、特定の目的の細胞タイプを分離するための、デスチオビオチン、ストレプトアビジン、およびAPTESシステムのカスタマイズ可能な表面機能化について説明しています。さらに、この原稿では、このプロセスのアプリケーション、最適化、および検証について説明します。...

ガラスの表面機能を介して、標的細胞の単離方法

私たちは、PDCの機能研究のための狼瘡傾向マウスの骨髄から高純度の形質細胞様樹状細胞（pDC）を単離するために蛍光活性化セルソーティングを使用してプロトコルを報告しています。...

マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞の精製のために、蛍光活性化細胞選別

視覚的クラスタ リングと組み合わせてフローサイトメトリー水生バイオ フィルムを研究するための使いやすい高速メソッドを提供しています。バイオ フィルムの特性評価、バイオ フィルムのコミュニティ構造の変化の検出とバイオ...

フローサイトメトリーによる水生バイオ フィルムの特性

線維脂肪原性前駆細胞(FAP)および筋幹細胞(MuSC)の正確な同定は、生理学的および病理学的状態におけるそれらの生物学的機能を研究するために重要です。このプロトコルは、成体マウスの筋肉からのFAPおよびMuSCの分離、精製、および培養のためのガイドラインを提供します。...

FACSによる無動および損傷マウス骨格筋からの線維脂肪原性前駆細胞および筋幹細胞の単離および培養

このプロトコルは単一セルの分類方法を使用して人間のmesenchymal幹細胞の蛍光活動化させたセル分類の使用を記述する。具体的には、シングルセルソーティングの使用は、マルチパラメトリックフローサイトメトリーベースのアプローチと組み合わせることで、不均一な集団から免疫表現型細胞の99%の純度を達成することができます。...

ヒト剥離乳歯由来の免疫表現型間葉系幹細胞の単一細胞選別

このプロトコルは、組織解離、逐次ろ過、プレプレート処理、定義された培養条件を通じて、成体および新生マウスの骨格筋から一次筋芽細胞を単離・濃集する標準化された方法を提供し、衛星細胞由来の筋肉芽細胞培養の確立と維持を可能にし、下流の実験応用を可能にします。...

In vitro 筋形成研究のための骨格筋サテライト細胞の単離

学ぶ 蛍光活性化細胞選別による造礁サンゴの生細胞集団分離法。ゲーティング戦略で特定細胞型を同定し、純度と生存性を確保したまま単離します。サンゴ生物学研究に有用です。

スクレラクチニアン細胞集団の分離のための蛍光活性化細胞選別

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