ヒト胎児標本におけるカンピロバクター・イェジュニの輸送培地における検出と生存の限界を決定する培養方法
March 10th, 2020
カンピロバクターの便培養は不正確ですが、依然として識別のためのゴールドスタンダードと考えられています。ヒト便中のC.セジュニの輸送媒体における検出および生存の限界を決定する方法が、より良い精度で新しい免疫アッセイと比較される。
カンピロバクター培養の難しさは、病気を生み出すために必要な細菌の数が少ないなどの基礎研究を阻害している。ここで使用するこれらの分析サンプルと工夫されたサンプルを組み合わせることで、この問題に対処できます。この技術は、臨床関連患者の症状を陽性の便培養結果と初めて、実際の細菌数と相関することを可能にする。
病気と相関する細菌の数を学ぶことは、診断、検出のための重要な目標、およびカンピロバクターの株または種間の病原性を比較するための確かな方法を提供する。カンピロバクター文化は簡単ですが、定量的な実行可能性を維持するために迅速かつ組織的な準備が必要です。プレート上の競合する便叢の中でカンピロバクターコロニーを同定するためにもかなりの判断が必要である。
C.jejuniまたはC.coli培養を開始する前に、手袋、ラボコート、および安全メガネを着用し、消毒層流れ安全フード内に使い捨て保護シートを置きます。滅菌技術を使用して、すべての水分または解凍された細菌ストックをカンピロバクター固有の寒天プレートにストリークし、マイクロエアロビクス雰囲気ガスを生成する袋を含む嫌気性瓶に48時間摂氏37度でプレートを置きます。24時間後、BHIスープのフラスコをゆるやかに覆い、フラスコを新しい嫌気性瓶に入れ、37°Cで一晩インキュベーションするための微気性環境を作り出す小袋を入れます。
翌朝、カンピロバクター培養のスタータープレートを削るために、事前に還元されたスープの3ミリリットルと接種ループを使用します。スラリーを無菌チューブに移し、残りの97ミリリットルのプレ還元ブロスを3ミリリットルのスラリーで接種します。ガス袋で瓶にスープを入れ、培養物が400ナノメートルの光学密度に達するまで、48〜72時間、振度インキュベーターで摂氏37度と毎分115回転で培養をインキュベートします。
この純粋なストック培養中の細菌の数を確立するために、900マイクロリットルの希釈液中に100マイクロリットルの8つの10倍希釈系列の培養を行う。滅菌メッキビーズを使用して、10倍の10マイクロリットルをマイナス5分の1から10に広げ、希釈濃度を持つ重複した事前還元されたカンピロバクター固有のプレートとラベルプレートの負の7番目の希釈液に、37°Cで48〜72時間のガス発生袋を持つ第2の嫌気性瓶にプレートを置く。成長期間の終わりには、カウントのための30〜300コロニーの間のプレートを選択します。
カウント後、カウントを使用して、その式に従って株の培養液の1ミリリットル当たりのコロニー形成単位を決定する。これはスパイクされた便プールを使用してすべてのステップを支えるので、分析コロニーカウントが正確であることが重要です。実証されたように数えるためにメッキした直後に、同じ量のスープとカンピロバクターネガティブフェースプールを混合し、その後9回のマイナスの便プールで2倍の希釈液を作り、カンピロバクターを含たないスープを含むコントロールプレートを便プールに追加して、非カンピロバクターコロニーを識別するのに役立ちます。
各カンピロバクタースツール希釈のストリーク10マイクロリットルは、重複した還元前のカンピロバクター特異的寒天プレートに浸し、約48時間摂氏37度のガス発生小袋を有する嫌気性瓶にプレートをインキュベートする。インキュベーションの終わりには、純粋なカンピロバクター培養物に似たコロニーの縞模様のプレートを視覚的に調べる。コロニーが実際にカンピロバクターであることを確認するために、グラム染色のためのコロニーのような複数のカンピロバクターを選択し、グラム陰性湾曲、スパイラル、または葉巻状の小さな細菌を識別するために油浸水レンズを使用して軽い顕微鏡によって薄く縞模様の領域を視覚化する。
カンピロバクターを添加しない陰性対照板は、他の便叢を同定するのに役立つ重要な点です。培養検出の限界を視覚的にカンピロバクター様グラム陰性コロニーを含む最後の希釈を考えてみましょう。そして、この式を用いて、工夫された臨床便標本における陽性希釈のミリリットル当たりのコロニー形成単位を計算する。
輸送培地に保存されたカンピロバクターの生存率を決定するために、カンピロバクターブロス培養液の1ミリリットルを負の便プールの1ミリリットルと混合し、負の便プールに10の重複した2倍の連続希釈液を調製する。さらに、キャリーブレア培地でさらに1〜4の比率で希釈し、20の希釈チューブとマイナスコントロールをキャップチューブのキャップチューブに96時間保存します。時間ゼロで始まり、その後24時間ごとに、カンピロバクター選択的寒天プレートに各希釈の10マイクロリットルのアリコートをストリークし、48時間摂氏37度でプレートをインキュベートします。
患者サンプルから正確な細菌数を確立するための独立した方法は存在しないので、2つの同時測定は1つの純粋な細菌ストックで行うことができる。1つの試験は、メス菌の連続希釈からカンピロバクターコロニーを胎児マトリックスで視覚的に検出し、臨床検体をシミュレートするために使用される。他の試験は分析的に使用され、スパイクに使用される同じ細菌ストック培養物中に存在するミリリットル当たりのコロニー形成単位を定量する。
成功のための重要なパラメータは、スパイク便培養のこの代表的なプレートによって示されるように、競合する便叢の中でピンポイントサイズのコロニーを同定することです。ここで、7つの独立した実験からの代表的なデータが観察できる。単に、胎児の培養中にカンピロバクターに似たコロニーを同定するだけでは十分ではありません。
すべてのコロニーは、グラム染色またはより高度な方法で確認する必要があります。寒天を含む標準的な抗生物質の成長が不十分なC.upsaliensisやC.lariなどの珍しい種を検出するために、培養よりも正確な酵素免疫アッセイを使用しています。この技術は、カンピロバクターの非症候性キャリッジのようなものを研究し、高い細菌負荷がカンピロバクター感染の深刻な結果に対する患者のリスクを高めるかどうかの研究に必要な基盤を築く。
感染性が多く、危険な細菌を扱う場合、および健康なドナーから採取された場合でも未知の病原体を含む可能性のある陰性の便プールを使用する場合は、常にPPEを着用してください。
概要
この研究は、ヒトの便サンプルにおけるカンピロバクター、特にC. jejuniの培養の課題に取り組んでいます。これらの細菌を検出する精度を向上させる新しい免疫アッセイを従来の培養法と比較します。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 微生物学
- 臨床診断
- 感染症
背景
- カンピロバクターは世界中で細菌性胃腸炎の主要な原因です。
- 現在の培養法は不正確で、慎重な取り扱いが必要です。
- 疾患を引き起こすために必要な細菌数を理解することは診断にとって重要です。
- 免疫アッセイはより信頼性の高い検出方法を提供する可能性があります。
研究の目的
- 便サンプル中のC. jejuniの検出限界を決定すること。
- 輸送培地中でのC. jejuniの生存を評価すること。
- 従来の培養法と新しい免疫アッセイを比較すること。
使用された方法
- 特定の寒天プレートを用いたカンピロバクター培養の準備。
- 微好気性環境下での培養による成長促進。
- 1ミリリットルあたりのコロニー形成単位を確立するための連続希釈。
- コロニーの同定にグラム染色と顕微鏡を使用。
主な結果
- 正確なコロニー数は細菌の生存能力を判断するために不可欠です。
- 免疫アッセイは特定のカンピロバクター種の検出率を改善しました。
- 競合するフローラの中でコロニーを特定することは依然として課題です。
- この研究は便サンプル中のC. jejuniを定量化する信頼性の高い方法を確立しました。
結論
- 新しい免疫アッセイは従来の培養法に代わる有望な選択肢を提供します。
- 細菌数の理解は診断能力を向上させることができます。
- 将来の研究はカンピロバクターの検出技術の改良に焦点を当てるべきです。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of Campylobacter jejuni in clinical specimens is essential for establishing clinically relevant detection thresholds and understanding pathogenicity. This method enables correlation of bacterial load with symptom severity and supports diagnostic assay validation by defining the limit of detection in complex fecal matrices. It addresses a critical gap in infectious disease diagnostics where culture-based false negatives impede epidemiological studies and therapeutic decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of the minimum infectious dose hypothesis by quantifying the bacterial threshold required to produce gastroenteritis symptoms.
- Operational Value: Provides a standardized spiking protocol to simulate clinical specimens for target validation in antimicrobial or vaccine development.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative colony forming unit data to establish analytical sensitivity and limit of detection for new diagnostic assays.
- Operational Value: Supports assay standardization by defining reproducible dilution series and colony confirmation criteria in fecal background.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates assessment of whether asymptomatic colonization or co-infection prevalence correlates with bacterial load in human specimens.
- Operational Value: Enables longitudinal survival studies in transport media to inform sample handling guidelines for clinical trials.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical development by providing quantifiable biological inputs for hypothesis testing and assay performance evaluation.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by linking bacterial concentration to phenotypic outcomes in infection models.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable spiking material for high-throughput screening of antimicrobial compounds against C. jejuni.
- Analytics: Generates CFU/mL measurements that enable statistical comparison of virulence across strains or species.
- Translational Research: Connects to biomarker alignment by allowing correlation of bacterial load with clinical symptom scores or sequelae.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable reference standard for QC of diagnostic kits and lot-to-lot consistency testing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in host-pathogen interaction studies through precise bacterial quantification.
- Operational Value: Enhances reproducibility across laboratories via defined anaerobic incubation, dilution, and colony confirmation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in antimicrobial development by providing a clinically relevant efficacy benchmark.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on ability to reduce bacterial load below the established symptomatic threshold.
Implementation Considerations
- Expertise in anaerobic culture techniques and microaerobic environment maintenance.
- Access to Campylobacter-selective agar plates and gas-generating sachets for microaerobic conditions.
- Standardized training for gram-negative curved rod identification amidst competing fecal flora.
- Protocol adaptation considerations for different Campylobacter species or specimen types.
- Limitations include labor-intensive colony confirmation and dependency on skilled microscopy for accurate identification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:04
Campylobacter Enumeration in Contrived Human Fecal Specimens
3:42
Contrived Clinical Fecal Specimen Preparation and Enumeration
5:21
Determination of Campylobacter Viability in Transport Medium
6:17
Results: Representative Typical Numbers of Colonies on Plates of Spiked Fecal Samples
7:10
Conclusion
