Name: 膀胱生検における組織常駐細菌の検出 16S rRNA 蛍光におけるインシッツハイブリダイゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 学ぶ 16S rRNAインシッツハイブリダイゼーションを用いた膀胱生検における組織常駐細菌の検出法。コンフォーカル顕微鏡で可視化し、再発性尿路感染症における細菌関与の理解と抗生物質治療の選択に貢献します。

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キム・オルスとマルセラ・デ・ソウザ・サントスに対するプロトコルのアドバイスと、テクニカルサポートを提供してくれたアマンダ・アルテに感謝します。この研究は、K.P.が保有するシステム生物学のセシル・Hとアイダ・グリーン・チェアによって部分的に支援されました。

研究プロトコルは、UTダラスおよびUTサウスウエスタン医療センターの機関バイオセーフティおよび化学安全委員会のガイドラインによって承認され、それに従いました。このプロトコルにおけるヒト被験者からの生検の使用は、UTダラスおよびUTサウスウエスタン医療センターの機関審査委員会のガイドラインによって承認され、それに従った。生検の収集と処理に関与するすべての個人は、現在のヒト被験者保護(HSP)とHIPPAトレーニングを持っています。
1. 固定およびパラフィン埋め込みのための組織製剤
注:生検は、再発性尿路感染症(rUTI)の高度な管理のための三価状炎の電気フルグレーションを有する膀細胞鏡検査を受けている女性の同意から採取された。rUTI は、12 か月の期間で 3 つの UTI として定義されます。生検回収は、UTSW IRBプロトコルSTU 0TU 082010-016に基づいてインフォームされた患者の同意を得た後、患者が麻酔下にある間に手術室で行われた。すべてのサンプルは、実験前にコード化され、識別解除されました。
<ol><li>フレキシブル嚢胞鏡を介して泌尿器系鉗子を用いた膀胱トリネからコールドカップ(〜1mm3)の生検を得て、1x無菌リン酸緩衝生理食生で調製した4%v/vパラホルムアルデヒド(PFA)の1.5mLを含む無菌2 mL凍結に直ちに入れます。(PBS)を使用します。 注:1x PBSの4%のPFAは、事前に作られ、必要になるまで-20 °Cで保存することができます。</li>
	<li>室温で6時間、または4°Cで16-24hの生検を修正します。 注:固定期間は、組織サンプルのサイズに基づいて計算され、過剰固定は避けるべきです。それは自己蛍光を導入する固定剤としてグルタルアルデヒドを使用することはお勧めしません。</li>
	<li>殺菌されたフードまたはバイオセーフティキャビネットで、ピペッティングによって固定性を取り除き、無菌1x PBSの1.5 mLに置き換えます。サンプルを一晩4°Cに保つか、すぐに組織処理とパラフィン埋め込みを行う19.</li>
	<li>5 μmの厚さで組織ブロックをセクションし、パラフィン組織セクションを帯電ガラス顕微鏡スライドに付着させるために殺菌されたマイクロトームを使用します。16S rRNA FISH プロトコルには、生検ごとに少なくとも 2 つのスライドが必要です。 注:生検組織は、すべてのセクションで尿路上皮層の視覚化を確実にするために、切断面に対して断面的に配置する必要があります。また、セクションの厚さは細菌のコミュニティ検出のために最適化されるべきであることに留意すべきです。組織常在細菌が非常に少ない感染症の場合(例えば、1,000人の哺乳動物細胞当たり<1組織常在細菌)の場合には、より薄い切片または複数の連続切片のサンプリングが必要となる場合があります。</li>
</ol>2. ユニバーサル16S rRNAプローブを用した在分事ハイブリダイゼーションにおける蛍光
注:生検ごとに2枚のスライドが必要です。ユニバーサル16S rRNAプローブには1つのスライド、スクランブルシーケンスを持つ制御プローブには1つのスライドが必要です。膀胱上皮は複数のチャネルで自動蛍光であるため、顕微鏡検査中に真の信号とバックグラウンド信号を区別するために重要です。スクランブルプローブに加えて、取り付け前に0.1%スーダンブラックBでブロッキングは、組織20に内在するバックグラウンド自己蛍光を減少させる可能性がある。
<ol><li>試薬およびヒュームフードの調製
	<ol>
<li>70%のエタノールで空のヒュームフード(または適切にフィットしたバイオセーフティキャビネット)をきれいにします。</li>
		<li>0.9M塩化ナトリウム(NaCl)、20mMトリス-HCl(pH 7.2)、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)からなるハイブリダイゼーションバッファーを10mLの滅菌濾過水で調製する。 注:滅菌濾過水は、0.22 μMフィルターを介してオートクレーブ蒸留水を通過させることによって調製することができる。ハイブリダイゼーションバッファは室温で保存できますが、SDSは溶液から沈殿する場合があります。SDSが沈殿する場合は、使用前に50°Cの水浴で溶液を温めます。</li>
		<li>洗浄されたオートクレーブボトルで無菌濾過水に95%と90%エタノールのそれぞれ少なくとも100 mLを調製します。</li>
		<li>蛍光標識凍結乾燥プローブを10mMトリス-HCl(pH8.0)および1mMエチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)バッファー(TE)で溶解し、フィルター殺菌ヌクレアーゼフリーウォーターで調製し、最終的な濃度100μMにする。このプロトコルで使用するために、TE バッファに 1 μM の希釈を準備します。100 μM濃縮ストックと1 μMストック再構成プローブの両方を、光から保護された-20°Cで保管してください。 注:蛍光標識プローブを水中に溶解させないようにしてください。緩衝は、フッ素をヌクレオチドプローブに結合させるNHSエステル結合の加水分解を防止するために必要である。</li>
		<li>70%エタノールで5コプリン瓶をきれいにし、乾燥させ、次のようにラベルを貼ります:キシレンI、キシレンII、95%EtOH、90%EtOH、ddH2 O、および適切な溶液の100 mLで満たします。これは、後の手順で混乱を避けるのに役立ちます。</li>
	</ol></li>
	<li>組織脱パラフィン化と水分補給
	<ol>
<li>フードに、生検ごとに2枚のスライドを垂直スライドラックに入れます。</li>
		<li>垂直スライドラックをキシレンIコプリン瓶(キシレン100mLを含む)に10分間置きます。</li>
		<li>キシレンIからスライドラックを取り外し、ペーパータオルの底部をブロットして余分なキシレンを取り除きます。キシレンIIコプリン瓶に10分間入れます。 注:認証されたヒュームフードの外でキシレンと一緒に働かすことはありません。</li>
		<li>連続したエタノール洗い(95%および90%)で脱パラフィン化組織切片を再水和するそれぞれ10分間、コプリン瓶にラベルが付いています。 注:この段階の間、水浴中の50-56 °Cに暖かいハイブリダイゼーションバッファー</li>
		<li>90%エタノール洗浄からスライドラックを取り外し、余分なエタノールを取り除くためにペーパータオルの底部をブロットし、100 mLのフィルター殺菌ddH2Oを含むddH2Oコプリン瓶に10分間置きます。</li>
		<li>ddH2O洗浄を待っている間、ハイブリダイゼーションバッファー内のプローブを10nMに希釈して染色液を作成します。スライドごとに150μLの染色溶液を準備します。 注:チューブをアルミホイルで包み、引き出しに収納することで、光から汚れ溶液を保護します。ベンチトップで蛍光色のラベル付きプローブを使用する場合は、可能な場合はオーバーヘッドライトをオフにすることを検討してください。ハイブリダイゼーションバッファーで希釈されたプローブは再利用しないでください。</li>
	</ol></li>
	<li>ハイブリダイゼーションとカウンター染色
	<ol><li>P1000チップボックスの貯水池に浸した、くしゃくしゃになったキムワイプと滅菌水を配置することにより、各プローブのための加湿室を準備します。先端ホルダーカートリッジを上に置きます - これはスライドが座る場所です。 注:ハイブリダイゼーション中に生検セクションが乾燥するのを防ぐために加湿室を使用することが重要です。市販の加湿器室は、安定した湿度の高い雰囲気を維持するように設計されていることに留意すべきである。しかし、ここで詳述した技術は、実質的に低コストで湿度を十分に制御します。</li>
		<li>スライドラックからスライドを取り外し、新しいペーパータオル(ティッシュサイドアップ)に置きます。Kimwipe を使用してスライドを乾かします。生検部の近くに(上ではなく)穏やかに塗るだけで水を取り除くだけに注意してください。疎水性ペンを使用して、生検部の周りに境界線を描き、加湿室にスライドティッシュ側を上に置きます。 注:ハイブリダイゼーションの前に組織が乾燥しないように迅速に作業します。</li>
		<li>加湿室を50°Cに設定したインキュベーターに入れ。組織の上に直接染色溶液のピペット50〜150 μLは、組織の周りの疎水性境界によって作られた長方形が充填されるようにする。疎水性の境界線をオーバーフローするようにあまりにも多くの溶液を追加しないように注意してください。ボックスをゆっくりと閉じます。</li>
		<li>暗闇の中で50°Cで一晩(~16時間)インキュベートします。インキュベーターに窓がある場合は、アルミホイルで覆い、暗い環境を作り出します。 注:信頼性の高い信号には、FISHプローブの溶融温度以下のハイブリダイゼーション温度が必要です。50 °Cは、ユニバーサル16S rRNAプローブに最適な温度ですが、他のプローブには最適ではない場合があります。</li>
		<li>翌朝、dH2O で 0.9 M NaCl、20 mM Tris-HCl (pH 7.2) で構成される洗浄バッファーの少なくとも 500 mL を準備し、真空ボトルトップ フィルターを使用して滅菌ボトルに滅菌します。水風呂で50~56°Cに温めます。</li>
		<li>加湿室からスライドを取り外し、Kimwipeで残りのハイブリダイゼーションソリューションを慎重に取り除きます。スライドを垂直染色ラックに置きます。</li>
		<li>染色ラックを10分間、100mLの予め温めた洗浄バッファーを含む不透明なコプリン瓶に入れます。コプリンの瓶が不透明でない場合(例えば、ガラス)、インキュベーションステップ中に暗闇の中に置きます- おそらく箱の下または引き出しの下に。</li>
		<li>新しいコプリン瓶の新鮮な洗浄バッファーで洗浄ステップを2回繰り返します。</li>
		<li>洗浄工程の間に、洗浄バッファーでHoechst 33342 1:1,000の100 μg/mLストック溶液を希釈してカウンターステインを調製する。同じチューブに、Alexa-555小麦胚芽アグルチニン(WGA)を5μg/mLの最終濃度に加え、Alexa-555ファロイジンを33nMの最終濃度に加えます。使用する準備ができるまで暗闇の中で保管してください。 注:Hoechst、Alexa-555 WGA、およびAlexa-555ファロイジンラベルDNA、ムチン/ウロプラキン、アクチンは、それぞれ、メーカーの指示に従って暗闇の中で長期間保存することができます。プローブおよびカウンターステインに使用される蛍光ラベルは、顕微鏡で使用できるフィルターセット用にカスタマイズできます。</li>
		<li>最後の洗浄からスライドを取り外し、Kimwipeで余分な洗浄バッファーをそっと拭き取ります。スライドティッシュをペーパータオルの上に置き、50-150 μLのカウンターステインを組織の上に直接加えて、疎水性の境界線が満たされますが、あふれないようにします。クライオボックストップで最大4枚のスライドをカバーし、室温で10分間インキュベートします。</li>
		<li>側面を染色ラックに戻し、コプリンの瓶に新鮮な洗浄バッファーを入れ、それぞれ10分間洗います。</li>
		<li>最後の洗濯後にスライドを完全に乾燥させ、ティッシュサイドをペーパータオルの上に置き、クライオボックストップの下に置きます。取り付けメディアを1滴、ティッシュの上に直接絞ります。適切なサイズのカバースリップ(生検サイズに依存します)を上にゆっくりと置きます。彼らはイメージングを妨げ、カバー滑ったスライドが暗闇の中で一晩治癒することを可能にするので、穏やかに任意の気泡を押し出します。</li>
		<li>翌日、カバースリップの端を透明なマニキュアの軽いコートでスライドにシールします。暗闇の中で10分間乾燥させ、共焦点顕微鏡のために4°Cで暗闇の中に保存します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 共焦点顕微鏡による16S rRNA FISHの可視化
注:このプロトコルのために、最良の結果は63xおよび100xの目的のレーザー走査の共焦点顕微鏡によって達成される。Hoechst、Alexa-488、およびAlexa-555蛍光の可視化のための適切なフィルタセットが必要です。ただし、共焦点顕微鏡が使用できない場合は、標準的な蛍光顕微鏡を使用できます。このプロトコルはレーザー走査共焦点顕微鏡用である。
<ol><li>製造元の指示に従って、顕微鏡に関連付けられている共焦点顕微鏡とコンピュータソフトウェアのスイッチをオンにします。</li>
	<li>スライドをロードし、青色(DAPI/Hoechst)チャネルの10倍の目標で視覚化します。核が見えるまで注意深く焦点を合わせなさい。</li>
	<li>フォーカスができたら、目的を高倍率(63倍または100倍)に変更します。カバースリップの上にオイルを追加します。新しい目的に焦点を合わせ、焦点を合わせながら対物レンズが油と接触することを確認します。 注:高倍率(63倍または100倍)でのファインフォーカスのみを使用してください。石油は、石油目的にのみ使用する必要があります。</li>
	<li>緑色(eGFP/Alexa-488)チャンネルのアイピースを通して各スライドを素早く評価し、FISH陽性のスライドとFISH負のスライドを特定します。 注:この初期評価/スコアリングは、実験的バイアスを減らすために別の個人によって盲目に行われる場合に最適です。</li>
	<li>染色された生検をイメージするには、FISH陽性スライドから始めて、コンピュータの視覚化モードに切り替えます。405(ホエシュト)、488(Alexa-488)、555(Alexa-555)チャンネルを選択します。この場合は555の最長波長チャネルを使用してピンホールを設定する。488チャンネルで標識細菌の可視化のための正しい焦点面を見つけます。焦点面を変更せずに、信号が飽和せず、背景が過剰に補正されないような、各チャンネルのゲイン、レーザーパワー、オフセットを設定します。3 つのチャンネルすべてで画像を取得します。 注:488 チャンネルで同じ設定を使用して、実験のすべてのスライドをイメージします。細菌可視化に最適な焦点面がフィールド間で変化する場合、レーザーパワーは405チャンネルと555チャンネルで調整を必要とする場合があります。</li>
	<li>上皮表面全体の画像を取得するまで、追加のフィールドで繰り返します。 注:異なるフィールドで標識された細菌を視覚化するには、焦点面を少し変更する必要がありますが、フィールド間の 488 チャネルのゲイン、レーザーパワー、またはオフセットは変更しないでください。共焦点顕微鏡で作業する場合、組織内の細菌の三次元局在化を分析できるようにZスタックを捕捉することが有益である場合があります。</li>
	<li>画像を処理し、ImageJまたは同様のソフトウェアを使用して、組織内または組織に関連する標識細菌を定量化します。必要に応じて、画像の最小処理(チャンネルの分割/マージ、画像ファイルへの変換など)をお勧めします。すべての修正またはその他の変更は、画像間で一貫性を保つ必要があります。</li>
</ol>

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</ol>

著者は何も開示していない。

ここでは、16S rRNA FlSHによるヒト膀胱生検における組織関連細菌の検出のためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、消化管や皮膚などの他の組織から採取された生検に容易に適合することができ、様々な哺乳類モデル生物から採取された組織に拡張することができる。ここで説明するプロトコルは、複数の固定(例えば、ホルマリン、エタノール、メタカーン)および組織調製技術(例えば、パラフィンまたは樹脂埋め込み、および凍結保存組織)の使用に適合させることができる。二重標識されたユニバーサル16S rRNAプローブは、組織内に存在するすべての細菌種の公平な検出を可能にし、病原体と微生物叢が疾患および健康な粘膜表面と空間的にどのように相互作用するかについての貴重な洞察を提供することができます状態。種または属特異的な16Sまたは23S rRNAプローブの選択または設計のためのARBソフトウェアパッケージのprobeBase、PhylOPDbまたはPROBE_DESIGNツールなどのリソースを使用して、このプロトコルは、特定の細菌種または属の検出に適応することができます組織内 15,21,22.この方法の重要な将来の方向性は、膀胱粘膜内の微生物多様性の評価のために、異なる離散的な蛍動体で標識された種または系統特異的プローブを用いて多重化することです。
ヒト標本での使用のためのこの方法の主な制限は、生検組織の利用可能性である。組織レビュー委員会の承認と情報に基づいた患者の同意は、生検を得るために必要であり、最適なサンプル収集と患者メタデータへのアクセスのために必要な手順を実行する臨床医との直接的なコラボレーションが必要です。CEFT手順自体が膀胱上皮を破壊するので、我々は処置の前にこれらの領域の生検を正当化することができた。このプロトコルには、脱パラフィン化工程で有毒なキシレンを使用し、手順を通じて無菌環境を維持する必要があるため、ヒュームフードまたは適切に適合したバイオセーフティキャビネットが必要です。このプロトコルには、好ましくは63xまたは100xの客観的かつ適切なフィルタセットを用いて、Hoechst、Alexa-555、およびAlexa-488を可視化するための蛍光顕微鏡が必要です。図1に示す代表的な結果を、レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて画像化した。同様のレーザー走査顕微鏡は、同等の画像を生成する必要があります。このプロトコルは、組織関連細菌のみを検出する能力によって制限され、例えば真菌は検出しない。真菌18Sまたは28S rRNA特異的プローブは、組織18内の真菌病原体を同定するために使用されなければならない。
このプロトコルに対する重要なステップには、手順全体を通して無菌環境を維持し、組織がハイブリダイゼーションと染色工程の間で乾燥しないようにすることが含まれます。手術中に組織が乾燥した場合、信号が湿らせたり、洗浄工程中に組織がスライドから脱落したりすることがある。また、このプロトコルには常に 2 つのシリアル セクション (16S rRNA プローブ用とスクランブル プローブ用のシリアル セクション) を使用することも重要です。このコントロールがなければ、誤検知を区別することは非常に困難であり、得られたデータは有用でないか、有益でない可能性があります。このプロトコルがユニバーサル16S rRNAプローブ以外のプローブで使用するように適合している場合、プローブの予測溶融温度よりも約5°C低い適切なハイブリダイゼーション温度を選択するように注意する必要があります。信号強度を維持するために、プローブが追加された後、組織が長時間光にさらされてはならず、顕微鏡検査中に過度に露出してはなりません。最後に、顕微鏡検査中に、FISHプローブに結合された蛍光蛍に対応するチャネルの同じ設定は、実験(16S rRNAプローブ)と制御(スクランブルプローブ)スライドの間で一貫性を保たなければなりません。患者由来組織の粘膜表面内の細菌の空間的関係を可視化することは、感染症の根底にある宿主病原体相互作用に関する臨床的に関連する仮説を理解し、構築するために重要である。

尿道、膀胱、尿管、腎臓からなる尿路は、尿中微生物叢を含む細菌や、尿病原性大腸菌(UPEC)のような尿病原性大腸菌(UPEC)を消化管から常に曝露する。1,2.グリコサミノグリカンと表在細胞の表面に発現されるグリコシル化ウロプラキンタンパク質の不透過性プラークからなる水和粘液の層は、日常的に付着性による膀胱上皮の侵入から膀胱上皮を保護する障壁を形成する。細菌3、4.尿路感染症(UTI)の間、これらの障壁は乱されるか破壊され、尿路原性細菌5、6による膀胱上皮への付着および侵入を促進する。マウスモデルでの研究は、UPEC、クレブシエラ肺炎、および腸球菌を含む多くの泌尿器原性細菌が表在細胞の細胞質内で複製性細胞内コミュニティ(IBC)を形成できることを明らかにした。過渡性上皮細胞内の静止細胞内貯留部(QIR)7,8,9.UPECはヒトUTI患者からの上皮細胞内で同定されているが、ヒトにおけるウロパチオゲンと膀胱粘膜との相互作用は、以前に視覚化されていなかった10.
我々は、経閉後の患者から得られた膀胱生検の粘膜内の細菌を検出するために、一般的な技術である蛍光(FISH)を適応させ、高度な三角炎(CEFT)の電気フルグレーションを有する膀胱鏡検査を受けた患者から得られた細菌を検出した。抗生物質難治性再発UTI11の管理.16S rRNAのユニバーサルプローブを用いて、再発UTI患者の膀胱粘膜に関連する細菌種を客観的に検出し、膀胱壁12内での位置を決定することができた。ユニバーサル16S rRNAヌクレオチドプローブは、以前に細菌16S rRNA13の保存領域を標的として設計されており、これは大腸菌16s rRNAの位置388〜355に相当する。16S rRNAおよびスクランブルプローブ配列は、マウス消化管14,15で使用するために以前に検証され、公開されている。プローブのシーケンスとプロパティについては、表 1に示します。このプロトコルでは、16S rRNAプローブ用とスクランブルプローブ用の2つの順次セクションを使用することが不可欠であり、膀胱上皮、コラーゲンおよびエラスチンは自己蛍光を示す真のシグナルとバックグラウンドシグナルを区別することが不可欠です16.このプロトコルでは、16S rRNAおよびスクランブルプローブは、N-ヒドロキシクシニミド(NHS)エステルリンケージを介して3'および5'ターミニの両方で蛍光Alexa Fluor 488標識を使用して設計され、蛍光シグナルを増加させる。
このプロトコルは、ヒト膀胱生検セクションでの使用のために開発されたが、細菌が存在すると考えられている任意の組織からのパラフィン埋め込みセクションでの使用のために容易に適応することができる。細菌表面の特定の抗原(例えば、リポ多糖類)を標的とする免疫組織化学実験とは異なり、この方法は、組織関連細菌10、17によって発現される抗原の事前知識を必要としない.普遍的な16S rRNAの調査の使用はサンプル内のすべての細菌種の公平な検出を可能にするが、彼らの同一性の決定を可能にしない。検出された細菌、種または属特異的な16Sまたは23S rRNAプローブの同定を決定するために使用する必要があります。このプロトコルはまた、宿主組織に関連するカンディダ・アルビカンスなどの真菌病原体を検出しない。真菌病原体の検出のために、28Sまたは18S rRNAプローブは18を使用する必要があります。

<table><tbody><tr><td>Alexa-555 ファロイジン</td><td>Invitrogen</td><td>A34055</td><td>染色アクチン</td></tr><tr><td>Alexa-555 小麦胚芽凝集素 (WGA)</td><td>Invitrogen</td><td>W32464</td><td>染色 ムチン</td></tr><tr><td>ボトルトップフィルター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>09-741-07</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>コプリンジャー</td><td>スインポート</td><td>M900-12W</td><td>脱パラフィン/洗浄</td></tr><tr><td>カバースリップ</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>12-548-5M</td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>04-355-224</td><td>再水和</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩二水和物</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S311-500</td><td>TE</td></tr><tr><td>フロストスライド</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>ヘキスト 33342、三塩酸塩、三水和物</td><td>Invitrogen</td><td>H21492</td><td>染色核</td></tr><tr><td>疎水性マーカー</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>疎水性バリア</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-11</td><td></td></tr><tr><td>Oil Immersol 518 F</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66A</td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (16%)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>TJ274997</td><td>Fixation</td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止試薬</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td>封入剤</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP358-10</td><td>ハイブリダイゼーションバッファー/PBS</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP166-500</td><td>ハイブリダイゼーションバッファー</td></tr><tr><td>リン酸二塩基性肝水和物</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S373-500</td><td>PBS</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 一塩基性 一水和物</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S369-500</td><td>PBS</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>VWR</td><td>75486-756</td><td></td></tr>滅菌<tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td>TE /ハイブリダイゼーションバッファー</td></tr><tr><td>キシレン</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>X3P-1GAL</td><td>脱パラフィン</td></tr><tr><td>0.22 &mu;mシリンジフィルター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>09-754-29</td><td>滅菌</td></tr></tbody></table>

膀胱生検における組織常駐細菌の検出 16s rrna 蛍光におけるインシッツハイブリダイゼーション

Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

宿主粘膜表面および組織との細菌の相互作用の可視化は、病因のメカニズムに関する貴重な洞察を提供することができる。感染の動物モデルにおける細菌病原体の可視化は、GFPなどの蛍光タンパク質を発現するように設計された細菌株に依存することができますが、ヒト患者から得られた生検または組織の粘膜内の細菌の可視化が必要です。公平な方法。ここでは、ヒト生検部における組織関連細菌の検出のための効率的な方法について説明する。この方法は、16S rRNA用の蛍光標識されたユニバーサルオリゴヌクレオチドプローブを用いたそのサイトハイブリダイゼーション(FISH)における蛍光を利用して、再発に苦しむ患者から得られた膀胱生検セクション内の組織関連細菌を標識する。尿路感染症。ユニバーサル16S rRNAプローブを用いることで、免疫蛍光実験による検出に必要となるリポ多糖類(LPS)などの種、属、または生化学的特性を事前に知らずに細菌を検出することができます。生検固定から共焦点顕微鏡によるイメージングまで、16S rRNA FISHの完全なプロトコルについて述べます。このプロトコルは、ほぼすべてのタイプの組織での使用に適応することができ、患者組織における臨床的に関連する細菌宿主相互作用の公平な視覚化のための強力なツールを表します。さらに、種または属特異的プローブを使用して、このプロトコルは、患者組織内の特定の細菌病原体の検出に適合させることができる。

このプロトコルは、パラフィン埋め込み膀胱生検セクションにおける膀胱粘膜に関連する細菌の公平な検出のために最適化されています。図1は、再発性尿路感染症の女性から得られた膀胱生検のセクションにこのプロトコルを用いた実験からの代表的な共焦点顕微鏡写真を示す。2つのシリアルセクションをユニバーサル16S rRNA(上パネル)またはスクランブル(下パネル)プローブとハイブリダイズしました。組織の同じ領域からの画像を撮影し、細菌(緑色)は、スクランブルプローブではなく16S rRNAプローブとハイブリダイズされた組織に明確に見える。図 2は、偽陽性の結果を表しています。自己蛍光コラーゲンまたはエラスチンに対応するシグナルは、16S rRNAおよびスクランブルプローブハイブリダイズ生検セクションの405および488チャネルで検出され、常にスクランブルプローブ制御を使用することの重要性を強調しています。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>プローブ</td>
			<td>シーケンス</td>
			<td>Tm</td>
			<td>フルオロフォア</td>
			<td>リンケージ</td>
		</tr>
<tr>
<td>ユニバーサル 16S rRNA</td>
			<td>5'-GCTGCCTCc グタグガート-3'</td>
			<td>54.9</td>
			<td>アレクサ-488(5'と3')</td>
			<td>NHS エステル</td>
		</tr>
<tr>
<td>スクランブル</td>
			<td>5'-アクトコッグ ガグGC-3'</td>
			<td>Na</td>
			<td>アレクサ-488(5'と3')</td>
			<td>NHS エステル</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: FISH プローブシーケンスおよび特性。Tmは溶融温度を示し、NHSはN-ヒドロキシスチニミドの略語である。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60458/60458fig1.jpg"> 図1:ヒト膀胱生検におけるユニバーサル16S rRNAおよびスクランブルプローブのFISHの代表的な共焦点顕微鏡写真。アクチンとムチンは赤色で標識され、細胞核は青色で、細菌は緑色で標識されています。組織関連細菌は、スクランブルではなく、16SrRNAプローブでのみ検出されます。63倍の倍率で撮影した画像。スケールバー = 20 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60458/60458fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60458/60458fig2.jpg"> 図2:ヒト膀胱生検における偽陽性緑色自己蛍光の代表的な共焦点顕微鏡写真。アクチンおよびムチンは赤色で標識され、細胞核は青色で標識され、細胞外マトリックスの細菌および自己蛍光成分(例えば、コラーゲンおよびエラスチン)は緑色である。緑色蛍光は、偽陽性の結果を示す16S rRNAおよびスクランブルプローブの両方で観察される。画像は63倍の倍率で撮影されます。スケールバー = 20 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60458/60458fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、その中のハイブリダイゼーションおよび共焦点顕微鏡における16S rRNAによる患者生検における組織関連細菌の公平な検出のためのものです。

膀胱生検における組織常駐細菌の検出 16S rRNA 蛍光におけるインシッツハイブリダイゼーション

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While ...

ここでは、細菌が存在すると疑われる多くの組織タイプに広範なアプリケーションを有する生検膀胱組織内の細菌の検出のための堅牢なプロトコルを提示する。この手法の主な利点は、公平な点です。これは、研究者がどの細菌種が存在するかを先取り知らずに組織内の細菌を検出することを可能にする。この技術は、細菌が再発性尿路感染症を持つ女性の膀胱壁に侵入したかどうかを判断し、組織貫通性抗生物質の選択などの治療選択を知らせるのに役立つ可能性がある。膀胱組織のために設計されている間、この技術は、最小限の最適化で居住細菌集団を有する他の組織に広く適用することができる。この技術に新しい個人は、カバースリップの配置とイメージングに苦労する可能性があります。気泡を減らすためにカバースリップの配置を最適化することに焦点を当て、貴重でないサンプルのイメージングを練習します。この手順を実証するのを手伝うのは、私の研究室の大学院生であるジャシュカラン・ガドヴィです。この手順を開始するには、空のヒュームフードを清掃するか、70%エタノールで適切に適合したバイオセーフティキャビネット。テキストプロトコルに概説されているように、必要なバッファーおよび試薬をすべて準備します。次に、70%エタノールで5つのコプリン瓶をきれいにし、瓶を乾燥させます。瓶が乾燥したら、ここに示すようにラベルを付け、適切な溶液の100ミリリットルでそれらを埋めます。ヒュームフードでは、生検ごとに2枚のスライドを垂直スライドラックに入れ。垂直スライドラックをキシレン1コプリン瓶に10分間置きます。この後、スライドラックを瓶から取り出し、ペーパータオルの底をしみ、余分なキシレンを取り除きます。ラックをキシレン2ジャーに10分間入れます。次いで、各10分間連続したエタノールの水和を続けて、パラフィン解除した組織切片を再水和する。すすが完了したら、スライドラックの底をペーパータオルにかけ、余分なエタノールを取り除き、100ミリリットルのフィルターを含むコプリン瓶にラックを10分間2倍蒸留します。この洗浄中に、プローブをハイブリダイゼーションバッファー内の10ナノモルに希釈して染色液を作成し、スライド当たり150マイクロリットルの染色液を調製してください。P1000チップボックスの貯水池に浸した、くしゃくしゃになった繊細な作業ワイプと無菌水を加えることによって、各プローブの加湿チャンバーを準備します。先端ホルダーカートリッジをスライドが置く場所の上に置きます。最後の洗浄が完了したら、スライドラックからスライドを取り出し、新鮮なペーパータオル、ティッシュサイドの上に置きます。繊細な作業拭き取りを使用してスライドを乾燥させ、近くにやさしく手を出すだけで、生検セクションでは水を吸い取ないように注意してください。疎水性ペンを使用して、生検部の周りに境界線を描き、スライド組織側を加湿室に上に置きます。次に、加湿室を摂氏50度に設定したインキュベーターに入れます。組織の周りの疎水性境界によって作られた長方形が充填され、箱を穏やかに閉じるように、組織の上に直接染色溶液の50〜150マイクロリットルの間のピペット。暗闇の中で摂氏50度で一晩インキュベート。インキュベーターに窓がある場合は、アルミニウム箔を覆って暗い環境を作り出します。翌朝、加湿室からスライドを取り外し、繊細な作業ワイプで残りのハイブリダイゼーション溶液を素早く拭き取ります。その後、側面を垂直染色ラックに入れます。100ミリリットルのプリウォーミングウォッシュバッファを含むアルミニウムホイル包み付きコプリン瓶に10分間、染色ラックを入れます。新しいコプリン瓶に新鮮な洗浄バッファーを使用して、この洗浄手順をさらに2回繰り返します。これらの洗浄工程の間、1~1000の比率で、Hoechst 33342のストック溶液を洗浄バッファーに希釈して対汚れを調製する。同じチューブに、 Alexa-555小麦胚芽アグルチニンを 1 ミリリットル当たり 5 マイクログラムの最終濃度に加え、アレクサ-555 ファロイジンを最終的な濃度の 33 ナノモルに加えます。使用する準備ができるまで暗闇の中で保管してください。最後の洗浄が完了したら、コプリン瓶からスライドを取り出し、繊細なタスクワイプで余分な洗浄バッファーを静かに拭き取ります。スライドのティッシュサイドをペーパータオルの上に置き、50~150マイクロリットルの対染色を組織の上に直接加え、疎水性の境界が埋まり、あふれないようにします。クライオボックストップで最大4枚のスライドを覆い、室温で10分間インキュベートします。この後、スライドを染色ラックに戻し、新鮮な洗浄バッファーを含むCoplin瓶でさらに2回洗浄し、各洗浄を10分間持続させます。その後、スライドを徹底的に乾燥させ、クライオボックストップの下のペーパータオルの上にティッシュサイドを置きます。取り付け培地をティッシュの上に直接1滴絞り、適切なサイズのカバースリップを上にそっと置きます。泡をそっと押し出し、カバースリップスライドが暗闇の中で一晩治るようにします。翌日、カバースリップの端を透明なマニキュアの軽いコートでスライドに密封し、暗闇の中で10分間乾燥させてから摂氏4度の暗闇の中に保管します。染色された生検を画像化する準備ができたら、共焦点顕微鏡と顕微鏡に関連するソフトウェアをオンにします。FISH ポジティブ スライドから始め、コンピューターの視覚化モードに切り替えます。405、488、555のチャンネルを選択します。最も長い波長チャネル(この場合は555)を使用してピンホールを設定します。次に、488チャネルで標識細菌の可視化のための現在の焦点面を見つけます。焦点面を変更せずに、信号が飽和せず、バックグラウンドが過剰に補正されないようなチャンネルごとにゲイン、レーザーパワー、オフセットを設定します。3つのチャンネルすべてで画像を取得します。本研究では、16S rRNA FISHによってヒト膀胱生検で組織関連細菌が検出される。このプロトコルは、パラフィン埋め込まれた膀胱生検セクションにおける膀胱粘膜に関連する細菌の公平な検出のために最適化されています。ここに示されているのは、再発性尿路感染症の女性から得られた膀胱生検のセクションにこのプロトコルを使用した実験からの代表的な共焦点顕微鏡写真である。2つのシリアルセクションは、ユニバーサル16S rRNAまたはスクランブルプローブのいずれかでハイブリダイズされます。組織と細菌の同じ領域から撮影された画像は、16S rRNAプローブとハイブリダイズした組織できれいに見えますが、スクランブルプローブとは一緒に見えません。偽陽性の結果も可能です。この代表的な偽陽性では、16S rRNAとスクランブルプローブの両方のバイオプシーセクションで405および488チャネルで自己蛍光コラーゲンまたはエラスチンに対応するシグナルが検出され、常にスクランブルプローブ制御を使用することの重要性を強調する。光の漂白を防ぐために、プローブが適用された後に光への組織の暴露を最小限に抑えます。この技術は、ヒト組織における細菌の公平な検出を可能にするが、種固有の情報を与えるものではありません。分類学的プローブを有する多重魚は、存在する属または種を同定するために使用することができる。この技術が開発される前に、細菌がヒト再発UTI患者の膀胱壁に侵入する可能性は以前には実証されていなかった。現在、属および種固有のプローブを使用して、どの細菌種が存在するかを判断しています。キシレンは、その毒性のためにヒュームフードに使用する必要があります。イメージング中にレーザーを直接調べないように注意してください。目的の下にスライドを配置しながらレーザーをオフにする必要があります。

detection-tissue-resident-bacteria-bladder-biopsies-16s-rrna

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、オリゴヌクレオチド結合蛍光ビーズを用いて試料内の微生物の検出のための多重方法を説明します。サンプル内のすべての生物からのアンプリコンは、プローブ結合ビーズのパネルにハイブリダイズさせる。ルミネックスまたはバイオプレックス機器は、ビーズタイプとハイブリダイゼーションシグナルのための各ビーズを照会するために使用されます。...

オリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを使用して複雑な臨床及び環境試料中の細菌の多重検出

出典: Ng, K. M., Tropini, C. 蛍光の 現場 ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージングによる腸内細菌叢-宿主相互作用の可視化。 J. Vis. Exp.

マウス腸切片における腸内細菌の蛍光インポジションハイブリダイゼーション

出典: Conover, M. S. 他著、 『マウスモデルにおけるUTIおよびCAUTIの確立と特徴付け』。 J. Vis. Exp. (2015年)このビデオは、βガラクトシダーゼ発現性...

感染マウス膀胱内の細胞内細菌群集の可視化

このビデオは、尿路感染患者の脱パラフィン化された膀胱組織中の細菌の視覚化を示しています。細菌の16sリボソームRNAとハイブリダイズした蛍光標識プローブは、組織関連細菌とその分布を明らかにし、サンプル内のそれらの密度に関する貴重な空間的洞察を提供します。...

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我々は、動物モデルの組織切片内の永続的なDNAウイルスゲノムの検出のためのin situハイブリダイゼーションプロトコルにおいて蛍光を確立した。このプロトコルは、ウイルスゲノムのcodetection、そのRNA産物、および単一細胞内のウイルスまたは細胞タンパク質によって感染プロセスを研究できます。...

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このプロトコルでは、単純な尿路感染症のマウスモデルからの単一、感染して膀胱の上皮細胞を分離する方法について説明します。...

下流の単一細胞分析のため尿路感染症のマウスモデルから生成された単一細胞内細菌群集の分離

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膀胱生検における組織常駐細菌の検出 16S rRNA 蛍光におけるインシッツハイブリダイゼーション

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