結核分子細菌負荷アッセイ(TB-MBLA)

この結核分子細菌アッセイは、3つの重要な質問に答えます。一つ:患者病の負担の大きさは?2:患者病の負担は抗結核薬にどのように反応しますか?

3:病気の負担と治療の反応との関係は?このアッセイは、患者結核の負担の定量的な結果を生み出し、短時間で治療によってこの負担がどのように変化するかを測定する。改変により、この方法論は他の細菌病原体に適用することができる。

我々はすでに、非結核性抗酸菌、および慢性閉塞性肺疾患に関連する細菌の診断のための同様の技術を開発しました。このテクニックを初めて実行するときは、ビデオを見て、手順を練習してください。患者診断結果に必要のないサンプルを使用して練習することは非常に重要です。

視覚的なデモンストレーションは、特にテキストで説明するのが難しい方法の部分を、ステップの学習と習得を簡素化するため、非常に重要です。まず、細胞培養を準備します。クリーンラボベンチまたはクラス1キャビンでは、指数相バチルカルメットゲリンまたはBCG文化の1ミリリットルのアリコートを15ミリリットルのプラスチックチューブに収穫し、しっかりと閉じます。

患者の痰サンプルを準備するとき、換気の良いスペースで働き、GL One Stop TBハンドブックのガイドラインに従ってください。慎重に15ミリリットルプラスチック遠心管に標本カップとピペット1ミリリットルのアリコートを開きます。その後、チューブをしっかりと閉じます。

サンプルチューブを摂氏95度に予熱された水浴に浸したホールディングラックに移し、各チューブの3/4が浸漬されていることを確認します。サンプルを20分間沸騰させます。その後、チューブをベンチに移し、室温で5分間冷却します。

フェノールクロロホルムまたは腫瘍資本エタノールを用いたキットを使用する場合は、ヒュームフードでRNA抽出を行います。ここに示すRNA手順は、フェノールクロロホルム抽出手順である。しかし、RNA抽出のための代替方法も使用され得る。

熱不活性化サンプルの1ミリリットルのアリコートを1.5ミリリットルチューブに移し、抽出制御の100マイクロリットルを各サンプルにスパイクします。チューブを閉じ、3回反転して混ぜます。チューブを20,000回gで10分間遠心分離する。

次いで、上清を吸引し、50マイクロリットルの堆積物を残す。950マイクロリットルのリシスバッファーに沈水をピペット処理して懸濁液を懸濁し、RNA抽出キットに付属のライジングマトリックスチューブに全懸濁液を移します。チューブをしっかりと閉じ、蓋と側面の両方にラベルが付いされていることを確認します。

次いで、サンプルを6,000rpmで40秒間均質化する。室温で5分間12,000回gでリセートを遠心分離する。一方、新鮮な1ミリリットルのチューブを準備し、クロロホルムの300マイクロリットルを追加します。

1ミリリットルのピペットを使用して、lysingマトリックスに触れることなく上清を慎重に吸引し、クロロホルムでチューブに移します。5秒間チューブを渦し、5分間、または3つのフェーズがはっきりと見えるまで落ち着かせます。チューブを12,000倍gで5分間遠心分離する。

その後、慎重に上相をピペットし、1.5ミリリットルのチューブに移します。500マイクロリットルの氷冷100%エタノールをサンプルに加え、チューブを閉じ、3回反転して混ぜます。チューブをマイナス80度で15分間、マイナス20度で30分間インキュベートします。

その後、チューブを冷やされたマイクロ遠心分離機と遠心分離機に13,000回gと摂氏4度で20分間ロードします。上清を捨て、70%の氷冷エタノールと遠心分離機の500マイクロリットルを13,000倍gでさらに10分間加える。すべての上清を捨てます。

そして、核酸ペレットを乾燥させるために20分間摂氏50度でチューブをインキュベートし、エタノールの蒸発を可能にするためにチューブを部分的に開いたままにしてください。次に、ペレットに100マイクロリットルの核フリー水を加え、室温で5分間インキュベートします。3秒間サンプルを渦出し、DNA除去を進めるか、使用する準備ができるまでマイナス80度で保存します。

DNAの1つの混合を、DNAの原稿の方向に従い、ピペット11マイクロリットルをRNA抽出物を含む各チューブに作製した。渦は3秒間、チューブの壁から任意の液滴を除去するために短時間回転します。次に、熱いブロックまたはインキュベーターで30分間摂氏37度でチューブをインキュベートします。

インキュベーションの後、DNAの1つの酵素を1マイクロリットル追加してチューブに直接加え、ボルテックスでよく混ぜます。その後、37°Cでさらに30分間チューブをインキュベートします。DNAの不活性化試薬を解凍し、ボルテックスする。

次に、各RNA抽出物に10マイクロリットルを加えます。そして、室温で5分間チューブをインキュベートします。インキュベーション工程中にチューブを3回渦を起こします。

次いで、混合物を13,000回gで2分間遠心し、上清を1.5ミリリットルのRNAのフリーチューブに慎重に移し、不活性化マトリックスのいずれにも触れないようにします。未知のRNAサンプルをすべてRNAの遊離水中に1~10個希釈し、5秒間ボルテックスで混合し、短時間回転させます。MTBおよびEC-RNAサンプルを解凍し、標準曲線のためにそれぞれ7と6の10倍希釈液を作ります。

RTプラスとRTマイナスPCRマスターミックスを原稿の指示に従って準備します。RTプラスを混合し、各RTプラスPCRチューブに16マイクロリットルをボルテックス。次いで、RTマイナスミックスをボルテックスし、各RTマイナスPCRチューブに16マイクロリットルを加えます。

4マイクロリットルのRNA抽出物または水を加え、RTプラスチューブに複製します。水は非テンプレート制御またはNTCです。RTマイナスチューブに4マイクロリットルのRNA抽出物または水を加えます。

反応管をリアルタイムPCR機にロードし、原稿に記載されているように反応をプログラムし、反応を実行する。治療応答を解釈するには、標準的な曲線を使用してCQ値を細菌負荷に変換し、治療フォローアップ期間における細菌負荷の変化として応答を計算します。治療後の細菌負荷の低下は肯定的な反応を意味し、細菌負荷の変化や上昇は否定的な反応を意味しない。

すべてのM.結核菌が熱不活化したことを確認するために、細胞の光学密度を測定し、生細胞と比較した。成長を示さない熱不活化サンプルに対して時間の経過に応じてODに変化は認められなかった。熱不活性化サンプルを摂氏37度でインキュベートし、細胞の熱不活性化後にRNAが分解するかどうかを判断した。

熱不活性化直後に回収されたRNAと、BCG培養と結核陽性痰の両方で1、2、3、および4日後に分離されたRNAとの間に違いは見つからなかった。RNAのA酵素を外因的にサンプルに加えた場合、熱不活性化の前後に、4日間のインキュベーションのすべての熱不活性化サンプルでRNA損失が発生しました。リボソームRNAに対する熱不活性化の効果は、結核陽性患者からのBCG培養および痰で測定された。

対照培養の測定された細菌負荷は、BCGと痰サンプルの両方で摂氏80度、摂氏85度、摂氏95度の熱不活化培養の組み合わせ細菌負荷よりも高かった。サンプルの熱不活性化は、RNAの損失を最小限に抑え、下流の結核MBLAおよび他の下流の分子試験のために十分なRNAを残します。透過電子顕微鏡を用いて、細胞が熱不活性化によってライスされたかどうかを調べた。

より低いおよびより高い倍率で細胞を検査すると、無傷の細胞壁および目に見える細胞内脂質体が明らかになった。細胞は細長く見えたが、lysedは見なかった。この手順を試みる場合は、RNA 抽出が不十分なため、偽陰性の結果を制御する抽出制御を追加することを忘れないでください。

このアプローチは、慢性閉塞性肺疾患、非結核性抗酸菌感染、および他の呼吸器病原体に関連する細菌に適用することができる。TB-MBLAの定量的な結果は、患者が結核療法にどのように反応するかの数学的および薬物モデルを可能にした。結核患者が管理されている日常的なケアにこの技術を適用することを楽しみにしています。