Name: 喉頭気管狭窄を伴うマウスにおける生体適合性薬物溶出気管ステントの設計 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学ぶマウスモデルにおける経口的薬物溶出気管ステントの設置技術。生体適合性ポリマーを用いた局所薬物送達システムの前臨床評価方法を解説し、喉頭気管狭窄治療の新たな治療戦略開発に貢献する。

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国立衛生研究所の難聴およびその他のコミュニケーション障害に関する研究所は、受賞番号1K23DC014082および1R21DC017225(アレクサンダー・ヒレル)の下で。この研究はまた、三物学会と米国外科医大学(アレクサンダー・ヒレル)、米国医師会財団、シカゴ、IL(マダヴィ・ドゥヴリ)、T32 NIDCD研修助成金(ケビン・モッツ)によって財政的に支えられています。

<ol><li>Minnigerode, B., Richter, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+subglottic+tracheal+stenosis+in+childhood%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of subglottic tracheal stenosis in childhood.</a> Progress in Pediatric Surgery. 21, 1-7 (1987).</li>
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<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel+Drug-eluting+Tracheal+Stent+Could+Reduce+Granulation+Tissue+Formation+in+a+Canine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medical+Journal+%28Engl%29%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel Drug-eluting Tracheal Stent Could Reduce Granulation Tissue Formation in a Canine Model.</a> Chinese Medical Journal (Engl). 129 (22), 2708-2713 (2016).</li>
<li>Sigler, M., Klotzer, J., Quentin, T., Paul, T., Moller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stent+implantation+into+the+tracheo-bronchial+system+in+rabbits%3A+histopathologic+sequelae+in+bare+metal+vs.+drug-eluting+stents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecularand+Cellular+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Stent implantation into the tracheo-bronchial system in rabbits: histopathologic sequelae in bare metal vs. drug-eluting stents.</a> Molecularand Cellular Pediatrics. 2 (1), 10(2015).</li>
<li>Robey, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+internal+bioabsorbable+PLGA+%22finger-type%22+stents+in+a+rabbit+tracheal+reconstruction+model%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Otolaryngology+Head+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Use of internal bioabsorbable PLGA "finger-type" stents in a rabbit tracheal reconstruction model.</a> Archives of Otolaryngology Head Neck Surgery. 126 (8), 985-991 (2000).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

生体内で薬物溶出ステントを正常に構築して使用するための最も重要なステップは、1)望ましい薬物溶出速度に対する最適なPLLA-PCL比を決定し、2)溶出する薬物の適切な濃度を決定し、3)ステントを成形する生体内使用のためのアンギオカテルの周り、および4)致命的な気道閉塞を引き起こすことなく、LTS誘導後にマウスにステントを経口的に送り込む。
気道疾患の動物モデルにおけるステントを用いた薬物送達にはいくつかの方法があるが、疾患性マウスモデルにおける薬物送達が可能な生体適合性ステントの開発は初めてである。薬物送達のためのこの方法を開発する際に、いくつかの改変が行われた。機械的に硬いステントを気管に入れ、生理的分泌物にもかかわらず気管に留まるための適切なPLLA-PCL組成物を決定することが重要でした。PLLA-PCLの70:30組成は、それが正常に耐え難い性質でラパマイシンを溶出し、私たちのマウスモデルで安全で信頼性の高い方法で配置され、生理学的に劣化しないので、アンゴガテーテル成形でステント構造のために決定されました条件。この方法の困難で潜在的にメーカー依存の部分は、アンギオカテルの周...

喉頭気管狭窄(LTS)は、イアトロゲン後挿管損傷による気管の病理学的狭窄である。細菌のコロニー形成の組み合わせは、気管切開または気管内チューブに対する異物応答、および患者特異的因子が異常な炎症反応を引き起こす。この不適応免疫応答は、気管内のコラーゲンの沈着につながり、気管およびその後の狭窄1、2の発光狭窄をもたらす。この疾患の現在の治療法は主に外科的であるため、過剰なコラーゲン沈着につながる異常な炎症およびプロ線維性経路を標的とする代替医学的ベースの治療パラダイムの開発が検討されている。mTORシグナル伝達複合体を阻害するラパマイシンは、免疫抑制効果と堅牢な抗線維芽細胞効果を有することが示されている。しかしながら、ラパマイシンが全身的に投与されると、一般的な副作用(例えば、高脂血症、貧血、血小板減少症)は3と発音することができる。私たちの方法論の目的は、これらの全身的な影響を軽減する気道で使用するために実用的な地元の薬物送達のための車両を開発することです。我々の評価は、薬物送達構造に対する局所免疫応答と、線維芽細胞機能を阻害し、局所免疫微小環境を変化させる能力を調査することに焦点を当てている。疾患特異的な結果には、線維症のマーカーを評価する生体内検査が含まれる。
生分解性薬物溶出ステントは、気道4を含む多臓器系における疾患の動物モデルに用いられている。気道狭窄または崩壊の管理のために、以前の調査は、薬物被覆シリコーンおよびニッケルベースのステント5を使用している。PLLA-PCLコンストラクトは、その薬物溶出プロファイルおよび3週間にわたる生理学的状態における機械的強度のためにこの特定の方法に対して選択された、これは、以前に発表された研究6で実証されている。PLLA-PCLはまた、FDA4によって既に承認された生体適合性および生分解性材料である。シスプラチンやMMCを溶出する生体適合性ステントは、ウサギやイヌなどの大型動物モデルで研究されている。しかし、これらの動物モデルでは、ステントは疾患の動物モデルに入れられ、経皮的に移植された。本研究は、気道損傷および喉頭気管狭窄のマウスモデルに経経口的に配置された生体適合性薬物溶出ステントを評価するためのユニークな方法を提供する。免疫調節薬を局所的に溶出し、マウスモデルでの研究のために小型化することができる生体適合性ステントは、翻訳前臨床研究に役立ちます。他の材料構造とのステント利用の以前の試みは、LTS7を区別する基礎炎症を悪化させる堅牢な異物応答を生成しました。この方法論は、我々の知る限り、LTSのマウスモデルにおけるステントベースの薬物送達システムの免疫調節および抗線維化効果を研究する最初の種類である。マウスモデル自体は、気管に対する免疫調節薬の効果を研究するためのいくつかの利点を提供しています。遺伝子組み換えマウスや健康で病気のマウスの実験的コホートを研究することができ、実験的な再現性につながり、費用対効果を向上させることができます。さらに、マウス気管へのステントの送達は、ヒトにおけるこのようなステントの臨床送達を模倣し、この方法の翻訳上の利点をさらに強調する。最後に、薬物とPLLA-PCLステントを製造することができる相対的な容易さは、気管の瘢痕形成を減少させることを目的とした代替薬物療法を提供するための改変を可能にする。

<table><tbody><tr><td><ストロング>1.ステント用</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22ゲージ血管カテーテル</td><td>Jelco</td><td>4050</td><td></td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270997-100ML</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>56-81-5</td><td>他のベンダーからも入手可能です。</td></tr><tr><td>PDLGA</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>739955-5G</td><td></td></tr><tr><td>PLLA-PCL (70 : 30)</td><td>エボニック インダストリーズ AG</td><td>65053</td><td></td></tr><tr><td>ラパマイシン</td><td>LC ラボラトリーズ</td><td>R-5000</td><td></td></tr><tr><td>2.動物外科</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ワイヤーブラシ</td><td>ミルローズ社</td><td>320101</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>3.免疫組織化学染色用</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗原再rivalバッファー</td><td>Abcam</td><td>ab93678</td><td>他のベンダーからも入手可能です。酸性pHが必要</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11965-092</td><td>他のベンダーからも入手可能です。</td></tr><tr><td>FBS(ウシ胎児血清)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ-488抗体</td><td>リフ技術</td><td>a11008</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ラット-633抗体</td><td>リフ技術</td><td>a21094</td><td></td></tr><tr><td>親水性プラススライド</td><td>BSB7028</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>100-10023</td><td>他のベンダーからも入手可能です。</td></tr><tr><td>ウサギ抗CD3抗体</td><td>Abcam</td><td>ab5690</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗F4/80抗体</td><td>Biolengend</td><td>123101</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4.定量的PCR用</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5mmガラスビーズ</td><td>OMNI International</td><td>19-645</td><td></td></tr><tr><td>ビーズミル ホモジナイザー</td><td>OMNI International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遺伝子特異的フォワード/リバースプライマー</td><td>ゲノムリソース コアファシリティ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power SYBRグリーンマスターミックス</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ4367659</td><td></td></tr><tr><td>RNeasyミニキット</td><td>Qiagen</td><td>80404</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlusリアルタイムPCRシステム</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

喉頭気管狭窄を伴うマウスにおける生体適合性薬物溶出気管ステントの設計

Design of a Biocompatible Drug-Eluting Tracheal Stent in Mice with Laryngotracheal Stenosis

喉頭気管狭窄(LTS)は、胸外閉塞および著しい息切れにつながる下耳筋炎および気管の病理学的狭窄である。LTSは気管内の異物からの粘膜損傷の結果、組織損傷および局所炎症反応を引き起こし、病理学的瘢痕組織の沈着につながる。LTSの治療は、効果的な医療療法の欠如のために外科的です。この方法の目的は、LTSを有するマウスに配置するために小型化することができる生体適合性ステントを構築することです。PLLA-PCL(70%ポリL-ラクチドおよび30%ポリカプロラクトン)コンストラクトは、最適な生体力学的強度を有し、生体適合性があり、生体内配置ステントに対して実用的であり、薬物を溶出することができることを実証した。この方法は、局所的に炎症を抑制し、気道線維化を軽減するために、様々な免疫調節剤を試験するための薬物送達システムを提供する。ステントの製造は28-30時間かかり、容易に再生することができ、大きなコホートの実験を可能にする。ここでは、ステント内に薬物ラパマイシンを組み込み、線維化およびコラーゲン沈着を減少させる効果を試験した。結果は、PLLA-PCLテントが信頼性の高いラパマイシン放出を示し、生理学的条件下で機械的に安定であり、生体適合性であり、気管における炎症反応をほとんど誘発することを明らかにした。また、ラパマイシン溶出PLLA-PCLステントは、生体内の気管内の瘢痕形成を減少させた。

本研究で用いたラパマイシンを装填した生分解性PLLA-PCLステント構築物は、生理学的条件下で一貫した予測可能な方法でラパマイシンを溶出することができた(図1)。図2は、LTSのマウスモデルで使用するために22Gアンギオパテテルの周りに鋳造されたPLLA-PCLステントを示す。気管内のラパマイシン溶出の効果が線維化の減衰に有効であるかどうかを判断するために、線維化関連遺伝子発現および急性炎症のマーカーの測定された変化は、遺伝子発現解析、フローサイトメトリー、免疫蛍光、およびELISAを通じて評価することができる。上述した方法を用いてマウスの気管内への小型化ステントの配置に成功が実証されている。この方法の概略を図3に示します。図4は、半透明のマウス気管を介して可視化されるステント上の黒いマーカーによって示される気管内の座座中の小型生体適合性ステントを示す。初期実験では、気管内のステントの配置を確認するた...

喉頭気管狭窄は、気管気道を重大に狭くし、効果的な医療療法を欠く病理学的瘢痕沈着から生じる。PLLA-PCL(70%ポリL-ラクチドおよび30%ポリカプロラクトン)ステントを局所薬物送達システムとして用いて、気管内の瘢痕増殖を減少させることを目的とした潜在的な治療法を検討することができる。

Laryngotracheal stenosis (LTS) is a pathologic narrowing of the subglottis and trachea leading to extrathoracic obstruction and significant shortness of ...

このプロトコルは、私たちが費用対効果の高い方法で遺伝子組み換え動物を活用することを可能にする喉頭細胞狭窄症の小さな動物モデルで薬物溶出ステントを調査することができます。薬物溶出気道ステントの経方向配置は、喉頭内膜狭窄のより臨床的に関連するモデルを表す気管への開放から動物を惜しむ。この技術は、喉頭内症狭窄を治療するための局所的な薬物送達戦略の前臨床調査を容易にする。この技術は、より大きな動物モデルおよび臨床応用における将来の調査に適用することができる小さな動物モデルにおける薬物溶出気道ステントの翻訳的調査のための実行可能で効果的なプラットフォームを提供する。技術は特に経経口挿管、気管損傷の誘導、および気道ステント配置工程。この技術的に困難な手術の視覚的なデモンストレーションは、細かい詳細の多くが言葉で完全に記述することができないので重要です。ポリマー溶液を含む1%ラパマイシンを作るために、ガラスバイアルに70-30 PLLA-PCLの600ミリグラムにラパマイシンの6ミリグラムを追加します。フュームフードの下で、6ミリリットルのジクロロメタンをラパマイシンに加え、バイアルを制御し、各バイアルに120マイクロリットルのグリセロールを加えます。その後、バイアルをキャップし、PLLA-PCL溶液が室温で6〜12時間均質化できるようにします。無菌材料と技術を使用して、マウス気道ステントを作成するには、カテーテルの回転を遅くしながら、22ゲージフルオロリンエチレンプロピレンベースのアンジオカテーテルの静脈カニューレにPLLA-PCL溶液を補充したラパマイシンの1ミリリットルを塗布する。すべての溶液が適用されたら、アンジオカテーテルの先端を下向きにして成形された血管カテーテルを、真空フードのガラスペトリ皿の端にあるカテーテルのヒルトを支えます。室温で真空状態で24時間後、乾燥したステントコンストラクトからカテーテルを軽くねじってスライドさせ、ステントに対して、鋳造プロセス中に生じた欠陥がないか周回チェックします。視覚化を支援するために、ステントの長さに細い黒い線を引くのが役に立ちます。エッジが軸になるように細かいストレートハサミでキャストされたステントの両端をトリミングし、ハサミを使用して各ステントを3ミリメートル軸セグメントにカットします。次に、3ミリメートルのステントを新しい22ゲージ静脈カテーテルに積み込みます。喉頭筋狭窄誘発の場合、つま先ピンチに対する応答の欠如を確認した後、最初のマウスを上端の外科プラットフォームに置き、中央切歯の周りのプラットホームの上部に付けられた小さな糸をループする。テープでテーブルに手足を固定し、マウスの首に1.5センチメートルの正中線垂直切開を行います。上に回っている胸腺を分割し、気管を視覚化するために得られた2つの葉を横化します。上に

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