Name: 温度を用いた微小管ベースの3D活性流体の流速制御 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学ぶ温度を用いた微小管ベースの3D活性流体の流速制御法。水循環システムと温度操作によりin situで動的に流速を調節でき、顕微鏡光学系の変更や活性流体の改変が不要です。マイクロチューブ滑走アッセイや酵素系など幅広い活性物質系に適用可能です。

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プラスミドK401-BCCP-H6はズヴォニミール・ドギック博士からの贈り物でした。この研究は、ウースター工科大学のクンタ・ウー博士のスタートアップファンドによって支援されました。我々は、ツボニミール・ドギッチ博士がチューブリンを浄化し、ラベルを付け、活性流体を合成するプロトコルに感謝する。マルク・リディラ博士のタンパク質発現と精製に関する専門知識に感謝しています。ウィリアム・ベンジャミン・ロジャー博士は、温度管理されたステージの構築を支援してくださったようお礼を申し上げます。我々は、生物学的材料施設(BMF)の使用のためのブランダイスMRSEC(NSF-MRSEC-1420382)を認めます。我々は、ソフトマター33にBateらからの数字を適応するための化学の王立協会を認める.

著者たちは何も開示する必要はない。

その場所でアクティブな物質を制御することは、アクティブマター4、5、24、28、54の指向的な自己組織化への扉を開きます。本稿では、システム29、30、31のアレニウス特性に基づいて、温度を使用して現場でキネシン駆動のMTベースの活性流体を制御するためのプロトコルを提示する。このシステムはタンパク質ベースであるため、実験全体を通じてタンパク質の機能を維持することが、プロトコルを正常に適用する鍵となります。システムの主なタンパク質は、MTとキネシンクラスターです。前者は16°C以下で脱重合し、後者...

活物質は、化学エネルギーを機械的な作業に変換する能力により、従来の受動物質と区別されます。このような能力を有する材料は、細菌、昆虫、コロイド、穀物、および細胞骨格フィラメント1、2、3、4、5、6、7、8、9、10などの生きているまたは非生きている実体から成ることができる。これらのマテリアル エンティティは、隣接するエンティティと対話します。より大きなスケールでは、乱流のような渦(アクティブ乱流)または材料流れが11、12、13、14、15、16、17、18、19、20のいずれかに自己組織化する。活性物質の自己組織化を理解することは、分子シャトル、光学デバイス、および並列計算21、22、23における様々な応用につながっている。アプリケーションを次のレベルに引き上げるには、自己組織化を超えた制御が必要です。例えば、Palacciららは、手動で制御された青色光にさらされたときにのみ自走するヘマタイト封入コロイドを開発し、生きている結晶24の出現につながった。Morin et al. は、調整不可能な外部電界を用いて圧延キンケコロイドの制御を確立し、その結果、競馬場状のチャネル25にコロイド群れが生じる。これらの以前の作品は、アプリケーションにおけるローカル制御の役割を示し、アクティブな物質のナレッジベースを進めます。
この記事では、キネシン駆動、微小管(MT)ベースの3D活性流体の制御性に焦点を当てます。流体は、MT、キネシン分子モーター、および枯渇剤の3つの主要成分で構成されています。枯渇剤は、後でモータクラスタによってブリッジされるMTをバンドルするために枯渇力を誘発します。これらのモーターはプラス端に向かってMTsに沿って歩く。一対の橋渡しされたMTsisアンチパラレルの場合、対応するモータは反対方向に歩きます。ただし、モータはクラスタ内にバインドされ、離れて歩くことができないため、一対の M (インターフィラメントスライド、図 1A)を協調的にスライドさせます。これらの摺動ダイナミクスが蓄積し、座屈不安定点とブレーク(伸張バンドル、図1B)26に達するまで拡張するMTstoの束を引き起こす。壊れたバンドルは、その後再び伸びる枯渇力によってアニールされ、ダイナミクスが繰り返されます。繰り返しダイナミクスの過程で、バンドルの動きは近くの液体をかき混ぜ、ミクロンスケールトレーサーでドーピングすることによって可視化できる流れを誘導する(図1C)。Sanchez et al. および Henkin et al. はトレーサーの平均速度を特徴付けており、アデノシン三リン酸(ATP)、枯渇剤、運動クラスター、および MTs19,27の濃度を変化させることによって速度が調整可能であったことを発見した。しかしながら、このようなタンビリティは活性流体合成の前にのみ存在していた。合成後、タンビリティが失われ、流体は独自の方法で自己組織化されました。合成後の活性流体活性を制御するために、Ross.etal.は、運動タンパク質の光活性化二量体化を用いた方法を報告し、光28を用いて流体活性をオン/オフすることを可能にする。光制御は、流体を局所的に活性化するという点で便利ですが、この方法では、顕微鏡で光路を修正するとともに、運動タンパク質の構造を再設計する必要があります。ここでは、モータ構造をそのまま維持しながら、顕微鏡の改造を行わずに流体の流れを局所的に制御するための使いやすい方法を提供します。
キネシン-MT反応は温度29、30、31、32で増加することが報告されているので、局所的に活性流体の流れを調整する私たちの方法は、アレニウス法に基づいています。これまでの研究では、活性流体流れの平均速度の温度依存性がアレニウス方程式に従ったことを示した: v = exp(-Ea/RT)、Aは前指数因子、Rはガス定数、Eは活性化エネルギー、Tはシステム温度33である。 従って、流体活性は温度環境に敏感であり、かつシステム温度がモータ性能を安定させるために一貫している必要があり、その結果、流体流量速度34。この記事では、モータの温度依存性を使用して、システム温度を調整してアクティブ流体の流速を連続的に調整する方法を示します。また、活性流体サンプルの調製をデモンストレーションし、次にコンピュータソフトウェアを介して温度を制御する顕微鏡ステージにサンプルを取り付けます。温度を16°Cから36°Cに上げると、平均流量速度が4μm/sに速くなり、さらに、タンビリティは可逆的です:温度を繰り返し増減すると、流れを順次加速および減速します。実証された方法は、MT滑空アッセイ29、30、31、32などのアレニウス法に主な反応が従う広範なシステムに適用可能である。

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)-6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td>Trolox</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート、98%、ACROS Organics</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AC216550050</td><td></td></tr><tr><td>3.2mm I.D. タイゴンチューブ R-3603</td><td>HACH</td><td>2074038</td><td>水管</td></tr><tr><td>直径 31.75 mm コーティングなし、サファイアウィンドウ</td><td>Edmund Optics</td><td>43-637</td><td>サファイアディスク</td></tr><tr><td>3M 1181 銅テープ - 1/2 IN 幅 X 18 YD 長さ - 2.6 MIL 総厚さ - 27551</td><td>R.S. HUGHES</td><td>054007-27551</td><td>銅テープ</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミド溶液 (40%/電気泳動)、Fisher BioReagents</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1402-1</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 5'-三リン酸二カリウム塩水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td>ATP</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A20006</td><td>遠赤色蛍光色素。Alexa 647は、微小管(1.3.3.2)と混合する前に、ジメチルスルホキシド(DMSO)に事前に懸濁することができます。</td></tr><tr><td>アミコンウルトラ-4遠心フィルターユニット</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>UFC801024</td><td>遠心フィルターチューブ。カットオフ分子量:10 kDa</td></tr>過<tr><td>硫酸アンモニウム、100g、MP Biomedicals</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>ICN802829</td><td>APS</td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩(結晶性粉末)、フィッシャーバイオ試薬</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1760</td><td>アンピシリン</td></tr><tr><td>防振テーブル</td><td>ニコン</td><td>63-7590S</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-E遠心分離機</td><td>ベックマンコールター</td><td>369001</td><td></td></tr><tr><td>バクト寒天販売剤、BD診断</td><td>VWR</td><td>90000-760</td>寒<td>天</td></tr><tr><td>ビオチン</td><td>アルファAesar</td><td>A14207</td><td></td></tr>バ<tr><td>ケツプラスチック白-2ガロン</td><td>Bon</td><td>84-715</td><td>水バケツ</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>牛の肝臓シ</td><td>グマアルドリッチ</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>CFIプランアポラムダ4x ObjからのCaCl2カタラーゼ</td><td>Nikon</td><td>MRD00045</td><td>4x エア対物レンズ</td></tr><tr><td>C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift</td><td>Nikon</td><td>96372</td><td>GFP フィルターキューブ</td></tr><tr><td>CH-109-1.4-1.5</td><td>TE Technology</td><td>CH-109-1.4-1.5</td><td>熱電冷却器 (TEC)</td></tr><tr><td>クロラムフェニコール、98%、ACROS Organics</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>冷却ブロック</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>カスタムミルドアルミニウム</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400</td><td>Bio-Rad</td><td>1610400</td><td>トリフェニルメタン色素</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (認定 ACS)、Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>DL-1,4-Dithiothreitol、99%、生化学用、ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC165680050</td><td>DTT</td></tr><tr><td>DOWSIL 340 ヒートシンク コンパウンド</td><td>ダウ</td><td>1446622</td><td>サーマルペースト</td></tr><tr><td>エチルアルコール、200 プルーフ ACS/USP/NF グレード 5 ガロン ポリキューブ</td><td>Pharmco by Greenfield Global</td><td>111000200CB05</td><td>エタノール</td></tr><tr><td>エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>EGTA</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>798681</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>フィッシャーバイオ試薬微生物学培地 添加剤:トリプトン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1421</td>トリ<td>プトン</td></tr><tr><td>フィッシャーバイオ試薬 微生物学培地 添加物:酵母エキス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1422</td>酵母<td>エキス</td></tr><tr><td>フルオレスブライトYGマイクロスフィア、キャリブレーショングレード3.00 & マイクロ;m</td><td>Polysciences</td><td>18861</td><td>トレーサー粒子</td></tr><tr><td>アスペルギルス属のニジェール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>GpCpp</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-405L</td><td>グアノシン-5'[(&alpha;,&beta;)-メチルノ]三リン酸(GMPCPP)</td></tr><tr><td>GS Powerの18ゲージ(True American Wire Ga)、100フィート、99.9%撚り線無酸素銅OFC、赤/黒2導体接着ジップコード電源/スピーカー電気ケーブル車、オーディオ、ホームシアター用</td><td>アマゾン</td><td>B07428NBCW</td><td>銅線グア</td></tr><tr><td>ノシン5'-三リン酸ナトリウム塩水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>GTP</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z805939</td><td>洗剤</td></tr><tr><td>HEPES ナトリウム塩 (白色粉末), Fisher BioReagents</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP410</td><td>NaHEPES</td></tr><tr><td>高性能ブレンダーマシン</td><td>AIMORES</td><td>AS-UP1250</td><td>ブレンダー</td></tr><tr><td>His GraviTrap</td><td>GE ヘルスケア</td><td>11003399</td><td>グラビティカラム</td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td>イソプロピル &beta;-D-1-チオガラクトピラノシ</td></tr>ド <tr><td>アルコール 99%</td><td>Pharmco by Greenfield Global</td><td>231000099</td><td>Isopropanol</td></tr><tr><td>JA-10 ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>369687</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン酸カリウム塩 一水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td>K-グルタミン酸</td></tr><tr><td>リゾチーム 鶏卵白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>MgCl2&bull;6H2O</td></tr><tr><td>MESナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸ナトリウム塩</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td>3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸</td></tr><tr><td>MP-3022</td><td>TEテクノロジー</td><td>MP-3022</td><td>熱電対</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン 99%、ACROS Organics</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AC138450500</td><td>TEMED</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000c UV-VIS 分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>E112352</td><td>分光計</td></tr><tr><td>ニコン Ti2-E ニコン倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>MEA54000</td><td></td></tr><tr><td>ノーランド 光学接着剤 81</td><td>ノーランド製品</td><td>NOA81</td><td>UV接着剤</td></tr><tr><td>Novex シャープ 染色済みタンパク質標準</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>LC5800</td><td>タンパク質標準</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0335BOX</td><td>SDS gel</td></tr><tr><td>Optima L-90K 超遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm PM996 Wrap, 4" Wide; 125 ft/Roll</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06720-40</td><td>Wax film</td></tr><tr><td>Pe 300 ultra Illumination System Single Band, 3mm Light Guide Control Pod power supply</td><td>Nikon</td><td>PE-300-UT-L-SB-40</td><td>クールLEDイルミネーター</td></tr>フェ<tr><td>ニルメタンスルホニルフッ化物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td>PMSF</td></tr><tr><td>ホスホエノールピルビン酸モノカリウム塩、99%</td><td>BeanTown Chemical</td><td>129745</td><td>PEP</td></tr><tr><td>Pierce Coomassie(Bradford)タンパク質アッセイキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A32953</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td>1,4-ピペラジンジエタンスルホン酸</td></tr><tr><td>プルロン酸F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(エチレングリコール)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81300</td><td>PEG.平均分子量 20,000 Da</td></tr><tr><td>水酸化カリウム (ペレット/認定 ACS)、フィッシャー ケミカル</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>P250-500</td><td>KOH</td></tr><tr><td>PowerEase 300W 電源 (115 VAC)</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>PS0300</td><td>ゲル ボックスの DC 電源</td></tr><tr><td>PS-12-8.4A</td><td>TE テクノロジー</td><td>PS-12-8.4A</td><td>温度コントローラー</td></tr><tr><td>の DC 電源ウサギの筋肉からのピルビン酸キナーゼ/乳酸デヒドロゲナーゼ酵素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-0294</td><td>PK/LDH</td></tr><tr><td>Quiet One Lifegard Fountain Pump、296-Gallon Per Hour</td><td>Amazon</td><td>B005JWA612</td><td>Fish tank pump</td></tr><tr><td>Rosetta 2(DE3)pLysS コンピテントセル - Novagen</td><td>Millipore Sigma</td><td>71403</td><td>コンピテントセル</td></tr><tr><td>シャープマイクロ波 ZSMC0912BS シャープ 900W カウンタートップ電子レンジ、0.9 立方フィート、ステンレス鋼</td><td>アマゾン</td><td>B01MT6JZMR</td><td>水を沸騰させるための電子レンジ</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(結晶性/認定ACS)、フィッシャーケミカル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S271-500</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>L3771</td><td>SDS</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 一塩基性</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>S8282</td><td>NaH2PO4</td></tr><tr><td>ストレプトアビジンタンパク質</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>21122</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>TC-720</td><td>TE Technology</td><td>TC-720</td><td>温度調節器</td></tr><tr><td>トリスベース、分子生物学グレード - CAS 77-86-1 - Calbiochem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>648310</td><td>Tris-HCL</td></tr><tr><td>Type 45 Ti ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>タイプ 70 Ti ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td>337922</tr><tr><td>タイプ70.1 Ti</td>ローター <td>ベックマンコールター</td><td>342184</td><td></td></tr><tr><td>VWR 汎用研究所ラベリングテープ</td><td>VWR</td><td>89097-916</td><td>紙テープ</td></tr><tr><td>VWR マイクロカバー メガネ、正方形、No. 1 1/2</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>ガラス カバースリップ</td></tr><tr><td>VWR プレーンおよびつや消しマイクロ スライド、プレミアム</td><td>VWR</td><td>75799-268</td><td>ガラス スライド</td></tr><tr><td>XCell SureLockミニセル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>EI0001</td><td>ゲルボックス</td></tr><tr><td>ZYLA5.5 USB3.0カメラ</td><td>ニコン</td><td>ZYLA5.5-USB3</td><td>モノクロCCDカメラ</td></tr></tbody></table>

温度を用いた微小管ベースの3d活性流体の流速制御

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

温度を用いてキネシン駆動の微小管系3次元(3D)活性流体の流速を調整する方法を提示する。この方法は異なった望ましい速度に達するために新しいサンプルを製造する必要性なしで座って速度を調整することを可能にする。さらに、この方法は速度の動的制御を可能にする。温度をサイクリングすると、液体は速く、ゆっくりと、定期的に流れます。この制御性は、キネシン微小管反応のアレニウス特性に基づいており、4~8μm/sの制御された平均流量速度範囲を示します。提示された方法は、チャネルの流量がバルブを必要とせずに局所的に調整できないマイクロ流体デバイスの設計への扉を開きます。

キネシン駆動のMTベースの活性流体を準備するには、キネシンとMの両方が必要です。MTを、牛の脳から精製した標識チューブリン(ステップ1.3および1.4)から重合し、続いてリサイクルして純度を高めた(ステップ1.2、図2B)。キネシン運動タンパク質を大腸菌(ステップ2.1および2.2、図2B)41、52から発現および精製した。 調製したキネシンストックの濃度を、リサイクルされたチューブリンと既知の濃度との主バンド輝度と比較してSDSゲルで測定した(ステップ2.3、図2Bインセット)。チューブリンバンドの...

このプロトコルの目的は、温度を使用して3次元活性流体の流速を制御することです。この方法の利点は、その時点での流速を調整できるだけでなく、定期的に流量速度を上下にチューニングするなどの動的制御も可能にします。

温度を用いた微小管ベースの3D活性流体の流速制御

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

活性物質は、分子影のような様々な用途で使用されてきました。アプリケーションを次のレベルに引き上げるには、アクティブな問題をローカルに制御する機能を開発する必要があります。アクティブな流体の修正を必要としない使いやすい方法を提供します。また、アクティブな流体の局所制御を達成するために顕微鏡の光学経路を変更する必要もありません。本手法は、マイクロチューブ滑空アッセイや酵素系などの誤った法則に主な反応が従う幅広いシステムに適用できます。セットアップは、水循環システムを含みます。漏水が発生すると、水が顕微鏡を損傷する可能性があります。したがって、プロトコルを採用する前に、システムが漏れがないことを確認することが重要です。当社のプロトコルでは、温度ステージにガラスサンプルを取り付ける必要があります。原稿は取り付け手順を説明していますが、サンプルをステージに固定するなどの機械的な機微が欠けている。手順をデモンストレーションすると、ティーガン・ベイト、エドワード・ジャービス、メーガン・ヴァーニーが行われます。ティーガンとエドワードは大学院生で、メーガンは研究室の学部生です。エペンドルフチューブで活性流体を調製するには、16ポイント7マイクログラム8ミリグラムのマイクロチューブを1ポイント8マイクロモルキネシンモータークラスターの6ポイント7マイクロリットル、高塩M2Bで500ミリモルDTTの1マイクロリットルを混ぜます。11ポイント7%の重量の4マイクロリットルを加えて微小管を重みでポリエチレングリコールで束ねせます。その後、50ミリモルATPの2ポイント8マイクロリットルを加えることによってキネシンモーターをアクティブにします。ストックピルビンキナーゼ/乳酸脱水素酵素の2ポイント8マイクロリットル、および200ミリモルホスフェノールピルビン酸の13ポイント3マイクロリットルを加えることによって、ATP濃度を維持します。10マイクロリットルの20ミリモルトロロック、1ポイント1マイクロリットル、1マイクロリットルの3ポイント5ミリグラム/ミリリットルカタラーゼ、1ポイント1マイクロリットル、ミリリットルグルコース1ミリグラム当たり20ミリグラム、1ポイント1マイクロリットルを1マイクロリットル/ミリリットルグルコースを添加することで、写真の漂白効果を低減します。ボリュームトレーサー粒子によってゼロポイントゼロ2 5%体積の1ポイント6マイクロリットルを追加して流体の動きを追跡します。100マイクロリットルの総容積を達成するために高塩M2Bを加える。次に、ポリアクリルアミドコーティングガラススライドをリンスし、DI水でスリップをカバーします。加圧空気でメガネを乾かします。清潔で平らな面にメガネを置きます。ワックスフィルムの3ミリメートル幅のチャンネルをカットします。全幅は、ガラスカバースリップが20ミリメートルと同じ幅です。スライドとカバースリップの間にワックスを挿入して、流体のフローセルチャネルを形成します。ガラスワックス複合体を80°Cのホットプレートに置き、ワックスを溶融させることで、グラスをワックスフィルムに付着させます。融解中に、カバースリップをピペットチップで軽く押し込み、ワックスフィルムをガラス表面に均一に接着します。密着後、ガラス複合体を室温まで冷却する。準備したアクティブな流体を、ピペットチップを使用して、チャネルの開口部から離れた角度で、ガラススライド表面に接触して速やかにフローチャネルにロードします。UV接着剤でチャネルを密封します。温度制御の設定を構築した後、アクティブな流体サンプルをサファイア表面に配置し、スライド側を表面に接触させます。紙テープでガラススライドを固定します。銅テープを使用して、サーモセンサをカバースリップ面に取り付けます。カバースリップスライドを目的に向けて顕微鏡ステージに取り付けるには、マイクロスコープステージの針クランプでセットアップを固定します。温度コントローラと魚のタンクポンプをオンにします。メーカーのガイドに従って目標温度を設定します。温度制御を有効にします。そして、温度データを記録します。GFPフィルターキューブを搭載した蛍光顕微鏡で一定の時間間隔でサンプルを画像化し、アクティブミックス内のAlexa 488標識トレーサー粒子を監視します。フレーム間のトレーサーの変位を 9 ピクセル以内にする時間間隔を調整します。10マイクロメートル/秒で移動するトレーサーを4倍の目標にして撮影する場合、時間間隔は1〜5秒にすることをお勧めします。画像を TIF ファイルとして保存し、フレーム番号に基づいてファイルに名前を付け、別のフォルダに保存します。このキネシン駆動微小管ベースの活性流体については、温度を摂氏10、20、30、および40度で制御した。温度の変動は、この温度制御設定の安定性と信頼性を示す4時間のゼロポイント1〜ゼロポイント摂氏3度以内でした。トレーサーは2秒ごとに画像化され、シーケンシャルな画像はトレーサーの軌道を追跡することができました。摂氏20~36度で測定された平均速度は、ゼロから2時間でほぼ時間独立しているように見えた。摂氏10度と40度で、平均速度は16°C以下の微小管脱重合によって急速に減衰し、キネシンクラスターはそれぞれ摂氏36度を超えて誤動作する。システム温度が30分ごとに摂氏20度から30度の間で交互に行われたとき、活動流体の平均速度はそれに応じて加速し、減速するだけでなく、10秒以内に温度変化に対応しました。アクティブな流体は、16度以下に冷却されるか、36度以上加熱すると誤動作し始めます。したがって、温度コントローラを操作する場合は、温度が16~36度であることを確認してください。アクティブな流体を局所的に調整する機能により、A地点からB地点まで貨物を運ぶ、または物理的なバルブを必要としないマイクロ流体機器の開発などの流体力を導きます。ガラス製品をコーティングするために使用されるアクリルアミドは、皮膚を通して吸収することができる神経毒です。危険を最小限に抑えるために、手袋、ラボコート、安全ゴーグルなどの適切な保護具を着用してください。

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Engineering

工学

このビデオでは、適切なバッファーの存在下でカバースリップ表面に成長する微小管を視覚化する干渉反射顕微鏡(IRM)技術について説明します。入射光で照らすと、カバースリップ-バッファー界面とバッファー-微小管界面が光を反射し、これが組み合わさって干渉パターンを形成することで、明るい背景に対して微小管を高コントラストの画像として視覚化できます。...

微小管ダイナミクスのラベルフリー可視化のための干渉反射顕微鏡法

有糸分裂紡錘体の組み立てと位置は、微小管のダイナミクス、モータータンパク質、および架橋剤によって生成される複合的な力に依存します。ここでは、球状エマルジョン液滴の幾何学的閉じ込めを基本的な有糸分裂紡錘体のボトムアップ再構成に使用する最近開発された方法を紹介します。...

球状​​エマルジョン液滴での基本的な紡錘体の再構成

マイクロ アプリケーションで使用される圧力制御シリンジ ポンプを構築するためのプロトコルをご紹介します。このシリンジ ポンプは、相加的製造ボディ、市販ハードウェアとオープン...

印刷作成する熱可塑性材料の三次元マイクロ流体用フィードバック制御を用いたシリンジ ポンプを自動

このプロトコルは、インビトロ表面アッセイを用いて微小管の無標識、高コントラスト、高速イメージングのための標準的な蛍光顕微鏡上の干渉反射顕微鏡を実装するためのガイドです。...

微小管のラベルフリー高速イメージングのための干渉反射顕微鏡の実装

我々は、動的微小管および蛍光標識微小管関連タンパク質の同時イメージングのための干渉反射顕微鏡および全内部反射蛍光顕微鏡を実施するためのプロトコルを提示する。...

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

本研究では、キネシン-3ファミリーのメンバーであるKIF1A(1-393LZ)をSf9-バキュロウイルス発現系を用いて精製する。これらの精製モーターの in vitro...

Sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析

我々は、蛍光顕微鏡法と組み合わせて、個々のアクチンフィラメントをリアルタイムで正確に監視しながら、異なるタンパク質溶液に順次曝露することを可能にする、単純なアクチンフィラメントマイクロ流体アッセイのプロトコルを提示する。...

マイクロフルイディクスと蛍光顕微鏡を使用して、単一アクチンフィラメントおよびバンドルのアセンブリダイナミクスを研究する

この記事では、植物ベースの微小管架橋剤であるMAP65およびPEGをクラウディング剤として使用して、タクトイドの形状の微小管アセンブリを形成するためのプロトコルを提示する。...

微小管タクトイドの自己組織化

本プロトコルは、マイクロ流体デバイスにおける微視的な氷結晶および包接水和物の結晶化を記述し、形成された結晶の周りの液体交換を可能にする。これにより、阻害剤の結晶化プロセスと結合メカニズムを調べるための比類のない可能性がもたらされます。...

氷およびクラスレート水和物結晶化の研究のためのマイクロ流体アプローチ

ここで紹介するのは、微小管およびキネシンモーターから活性ネマティクスを調製する方法であり、タンパク質の調製および構築、ならびに活性ネマチック閉じ込めのためのウェルの使用を含む。...

微小管ベースのアクティブネマティクスの形成、閉じ込め、観察

このプロトコルでは、微小管ポリマーの力学を調査するのに適したマイクロ流体デバイスの設計と製造について詳しく説明します。マイクロファブリケーション、自動フロー制御、および計算モデリング技術の合成により、 in...

微小管ポリマーメカニクス研究のためのマイクロ流体工学に基づくアプローチの開発

学ぶ温度を用いた微小管ベースの3D活性流体の流速制御法。水循環システムと温度操作によりin situで動的に流速を調節でき、顕微鏡光学系の変更や活性流体の改変が不要です。マイクロチューブ滑走アッセイや酵素系など幅広い活性物質系に適用可能です。

温度を用いた微小管ベースの3D活性流体の流速制御

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