温度を用いた微小管ベースの3D活性流体の流速制御
November 26th, 2019
このプロトコルの目的は、温度を使用して3次元活性流体の流速を制御することです。この方法の利点は、その時点での流速を調整できるだけでなく、定期的に流量速度を上下にチューニングするなどの動的制御も可能にします。
活性物質は、分子影のような様々な用途で使用されてきました。アプリケーションを次のレベルに引き上げるには、アクティブな問題をローカルに制御する機能を開発する必要があります。アクティブな流体の修正を必要としない使いやすい方法を提供します。
また、アクティブな流体の局所制御を達成するために顕微鏡の光学経路を変更する必要もありません。本手法は、マイクロチューブ滑空アッセイや酵素系などの誤った法則に主な反応が従う幅広いシステムに適用できます。セットアップは、水循環システムを含みます。
漏水が発生すると、水が顕微鏡を損傷する可能性があります。したがって、プロトコルを採用する前に、システムが漏れがないことを確認することが重要です。当社のプロトコルでは、温度ステージにガラスサンプルを取り付ける必要があります。
原稿は取り付け手順を説明していますが、サンプルをステージに固定するなどの機械的な機微が欠けている。手順をデモンストレーションすると、ティーガン・ベイト、エドワード・ジャービス、メーガン・ヴァーニーが行われます。ティーガンとエドワードは大学院生で、メーガンは研究室の学部生です。
エペンドルフチューブで活性流体を調製するには、16ポイント7マイクログラム8ミリグラムのマイクロチューブを1ポイント8マイクロモルキネシンモータークラスターの6ポイント7マイクロリットル、高塩M2Bで500ミリモルDTTの1マイクロリットルを混ぜます。11ポイント7%の重量の4マイクロリットルを加えて微小管を重みでポリエチレングリコールで束ねせます。その後、50ミリモルATPの2ポイント8マイクロリットルを加えることによってキネシンモーターをアクティブにします。
ストックピルビンキナーゼ/乳酸脱水素酵素の2ポイント8マイクロリットル、および200ミリモルホスフェノールピルビン酸の13ポイント3マイクロリットルを加えることによって、ATP濃度を維持します。10マイクロリットルの20ミリモルトロロック、1ポイント1マイクロリットル、1マイクロリットルの3ポイント5ミリグラム/ミリリットルカタラーゼ、1ポイント1マイクロリットル、ミリリットルグルコース1ミリグラム当たり20ミリグラム、1ポイント1マイクロリットルを1マイクロリットル/ミリリットルグルコースを添加することで、写真の漂白効果を低減します。ボリュームトレーサー粒子によってゼロポイントゼロ2 5%体積の1ポイント6マイクロリットルを追加して流体の動きを追跡します。
100マイクロリットルの総容積を達成するために高塩M2Bを加える。次に、ポリアクリルアミドコーティングガラススライドをリンスし、DI水でスリップをカバーします。加圧空気でメガネを乾かします。
清潔で平らな面にメガネを置きます。ワックスフィルムの3ミリメートル幅のチャンネルをカットします。全幅は、ガラスカバースリップが20ミリメートルと同じ幅です。
スライドとカバースリップの間にワックスを挿入して、流体のフローセルチャネルを形成します。ガラスワックス複合体を80°Cのホットプレートに置き、ワックスを溶融させることで、グラスをワックスフィルムに付着させます。融解中に、カバースリップをピペットチップで軽く押し込み、ワックスフィルムをガラス表面に均一に接着します。
密着後、ガラス複合体を室温まで冷却する。準備したアクティブな流体を、ピペットチップを使用して、チャネルの開口部から離れた角度で、ガラススライド表面に接触して速やかにフローチャネルにロードします。UV接着剤でチャネルを密封します。
温度制御の設定を構築した後、アクティブな流体サンプルをサファイア表面に配置し、スライド側を表面に接触させます。紙テープでガラススライドを固定します。銅テープを使用して、サーモセンサをカバースリップ面に取り付けます。
カバースリップスライドを目的に向けて顕微鏡ステージに取り付けるには、マイクロスコープステージの針クランプでセットアップを固定します。温度コントローラと魚のタンクポンプをオンにします。メーカーのガイドに従って目標温度を設定します。
温度制御を有効にします。そして、温度データを記録します。GFPフィルターキューブを搭載した蛍光顕微鏡で一定の時間間隔でサンプルを画像化し、アクティブミックス内のAlexa 488標識トレーサー粒子を監視します。
フレーム間のトレーサーの変位を 9 ピクセル以内にする時間間隔を調整します。10マイクロメートル/秒で移動するトレーサーを4倍の目標にして撮影する場合、時間間隔は1〜5秒にすることをお勧めします。画像を TIF ファイルとして保存し、フレーム番号に基づいてファイルに名前を付け、別のフォルダに保存します。
このキネシン駆動微小管ベースの活性流体については、温度を摂氏10、20、30、および40度で制御した。温度の変動は、この温度制御設定の安定性と信頼性を示す4時間のゼロポイント1〜ゼロポイント摂氏3度以内でした。トレーサーは2秒ごとに画像化され、シーケンシャルな画像はトレーサーの軌道を追跡することができました。
摂氏20~36度で測定された平均速度は、ゼロから2時間でほぼ時間独立しているように見えた。摂氏10度と40度で、平均速度は16°C以下の微小管脱重合によって急速に減衰し、キネシンクラスターはそれぞれ摂氏36度を超えて誤動作する。システム温度が30分ごとに摂氏20度から30度の間で交互に行われたとき、活動流体の平均速度はそれに応じて加速し、減速するだけでなく、10秒以内に温度変化に対応しました。
アクティブな流体は、16度以下に冷却されるか、36度以上加熱すると誤動作し始めます。したがって、温度コントローラを操作する場合は、温度が16~36度であることを確認してください。アクティブな流体を局所的に調整する機能により、A地点からB地点まで貨物を運ぶ、または物理的なバルブを必要としないマイクロ流体機器の開発などの流体力を導きます。
ガラス製品をコーティングするために使用されるアクリルアミドは、皮膚を通して吸収することができる神経毒です。危険を最小限に抑えるために、手袋、ラボコート、安全ゴーグルなどの適切な保護具を着用してください。
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概要
このプロトコルは、温度を使用して三次元アクティブ流体の流速を制御する方法を示しています。このアプローチにより、流速の現場調整と動的な調整が可能になります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- アクティブマター
- 流体力学
- 顕微鏡技術
背景
- アクティブマターは、分子影を含む様々な分野で応用されています。
- アクティブ流体の局所制御は、これらの応用の進歩に不可欠です。
- この方法はアクティブ流体の修正を必要としません。
- また、顕微鏡の光路の変更も避けます。
研究目的
- アクティブ流体の局所制御のための簡単な方法を開発すること。
- 科学的応用におけるアクティブマターの使いやすさを向上させること。
- 様々なシステムに適用可能な多目的なアプローチを提供すること。
使用された方法
- 水循環システムの実装。
- 流速を制御するための温度操作。
- 誤った法則に従うシステムへの方法の適用。
- 微小管の滑走アッセイと酵素ベースのシステムでの利用。
主な結果
- 現場調整による流速の成功的な制御。
- 温度調整を通じて達成された流速の動的制御。
- アクティブマターシステムの幅広い範囲に適用可能な方法。
- アクティブ流体や顕微鏡のセットアップに変更は必要ありません。
結論
- このプロトコルはアクティブ流体を制御するための簡単なアプローチを提供します。
- 研究におけるアクティブマターの応用可能性を高めます。
- この方法は様々な科学分野での進歩につながる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Temperature-dependent control of microtubule-based active fluids enables tunable flow rates without physical valves, supporting dynamic microfluidic device design. This approach enhances predictive confidence in active matter systems by leveraging Arrhenius kinetics for reproducible speed modulation. The method reduces experimental variability and supports scalable assay development for target validation and phenotypic screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of motor protein function under controlled thermal conditions to validate kinesin-microtubule interactions as therapeutic targets.
- Operational Value: Provides a tunable, reagent-free system for assessing target engagement and pathway modulation in real time.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by correlating temperature-dependent flow changes with motor protein activity, informing lead identification decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, temperature-dependent flow speed readouts (4–8 µm/s) suitable for high-content screening of compound libraries.
- Operational Value: Enables assay standardization through precise thermal control, improving reproducibility across replicates and laboratories.
- Scalability: Supports microfluidic integration for parallel compound testing without valve-based flow regulation, reducing device complexity.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains physiological relevance by operating within 16–36°C range, aligning with mammalian thermal stability for target proteins.
- Preclinical Modeling: Facilitates disease-relevant system evaluation by simulating thermal stress conditions on cytoskeletal dynamics.
- Risk-Adjusted Advancement: Allows dynamic perturbation studies to assess compound effects on motor protein function under varying thermal profiles.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a tunable biophysical readout that complements biochemical and imaging-based assays for target validation and lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of motor protein inhibitors or activators through real-time flow speed modulation.
- Screening: Delivers quantitative, temperature-dependent outputs that enable dose-response analysis and hit confirmation in active matter-based assays.
- Analytics: Provides continuous, trackable tracer displacement data enabling statistical comparison of conditions and compound effects.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling thermal sensitivity of cytoskeletal systems relevant to neurodegenerative and cancer targets.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for active matter characterization across multiple projects, reducing redevelopment costs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct, real-time measurement of motor protein-driven dynamics.
- Operational Value: Enhances reproducibility via precise thermal control, minimizing batch-to-batch variability in active fluid preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling rapid, reversible perturbation of target systems without sample remake.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying target engagement under physiologically relevant thermal fluctuations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in active matter preparation, microscopy, and thermal control systems.
- Needs a stable temperature stage with water circulation and leak-proof sealing to prevent microscope damage.
- Demands standardization of sample loading and sealing protocols across users for consistent results.
- Requires adaptation considerations for different tracer particles or surface coatings when scaling to other active matter systems.
- Limited by the 16–36°C operational window due to microtubule depolymerization and motor protein denaturation outside this range.
