Name: マトリックス細胞代謝クロストークを研究するためのヒト3D細胞外マトリックス-脂肪細胞培養モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学ぶ3D細胞外マトリックス-脂肪細胞培養モデルを用いたヒト脂肪組織代謝におけるマトリックスと脂肪細胞の相互作用。この手法は2型糖尿病における細胞代謝の病態特異的制御を解明する。

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ダニエル・ベルガー、マリリン・ウッドラフ、シモーネ・コレア、レサ・ガイスの研究コーディネートに感謝します。SEMはミシガン大学顕微鏡・画像解析研究所バイオメディカル研究コア施設によって行われました。このプロジェクトは、NIH助成金R01DK097449(RWO)、R01DK115190(RWO、CNL)、R01DK090262(CNL)、退役軍人功労助成金I01CX001811(RWO)、パイロットおよび実現可能性付与ミシガン糖尿病研究センター(NIH P30-D)から支援されました。退役軍人管理VISN 10スパークパイロットグラント(RWO)。ミシガン大学顕微鏡画像解析研究所バイオメディカル研究コア施設による走査型電子顕微鏡この原稿の図4は、もともとベーカーら、Jクリン円doMetab 2017で出版されました。3月1;102 (3), 1032-1043.doi:10.1210/jc.2016-2915、オックスフォード大学出版局の許可により再現https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329。この資料の再利用の許可については、http://global.oup.com/academic/rightsをご覧ください。

脂肪組織は、制度的審査委員会の承認の下で選択的なバリヤード手術を受けているヒト被験者から調達される。
1. プレディポサイト単離と培養試薬調製
<ol><li>1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2%ウシ血清アルブミン(BSA)を調製する。フィルターは殺菌し、4 °Cで保管してください。</li>
	<li>II型コラゲラーゼを調製する: 2% BSA で 2 mg/mL 1x PBS.使用直前に準備してください。</li>
	<li>赤血球(RBC)溶解液を調製する: 1.5 M NH4Cl, 100 mM NaHCO3, 10 mM 二ナトリウム EDTA 脱イオン水中 (DI/H2O).4°Cで保管してください。使用直前にDI/H2 Oで10xストック溶液から1xRBCライジングソリューションを準備します。</li>
	<li>成長培地を調製する: 15% 胎児ウシ血清 (FBS), 1% 抗生物質抗粘液 (ABAM) ダルベッココの修飾イーグル培地:栄養混合 F-12 (DMEM/F12).フィルターは殺菌し、4 °Cで保管してください。</li>
	<li><li></ol><ol><li></li><li><li></li><li></li><li> </li><li> </li><li></ol><ol><li><ol><li><li><li></li></ol></li><li><ol><li></ol></li><li><ol><li></li><li></li></ol></li></ol><ol><li><li></ol><ol><li><li><li><ol><li></li></ol></li><li></li><li><ol><li><li></li><li></ol></li><li> </li><li><li></li><li><li></li><li><li></li><li></li><li></li></ol><ol><li><ol><li><li></ol></li><li><ol><li><li></ol></li><li><ol><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li><li><li></ol></li></ol><ol><li><li><li><li><ol><li> </li></ol></li><li></li><li><ol><li> </li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li><li></ol></li><li><ol><li><ol><li><li></li><li><li></ol></li><li><ol><li><li></li><li></li><li></ol></li><li> <ol><li><li><li><li><li></li><li></li></ol></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li><li></li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li><li></li><li><li><li></ol></li></ol><img src="/files/ftp_upload/60486/60486eq1.jpg">

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<li>Porzionato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+omentum+as+novel+biologic+scaffold+for+reconstructive+surgery+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4(2013).</li>
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<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+decellularized+human+adipose+tissue+extracellular+matrix+and+adipose-derived+stem+cells+for+adipose+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering.</a> Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).</li>
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<li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrotic+extracellular+matrix+activates+a+profibrotic+positive+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).</li>
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<li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+depot-specific+characteristics+are+retained+in+strains+derived+from+single+human+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes.</a> Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).</li>
<li>Tchoukalova, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-+and+depot-dependent+differences+in+adipogenesis+in+normal-weight+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans.</a> Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).</li>
</ol>

著者たちは相反する利害関係を宣言しない。

ECM-脂肪細胞培養モデルは、ECMおよび細胞の個々の役割を究極の組織表現型のディクテーションで解剖するための貴重なツールを提供します。ECM分離プロトコルは非常に再現可能であるが、脱細胞化プロセスにおける変動性が観察され得る。3日目の脂質異常ステップは、プロトコルの重要なポイントです。一晩の抽出の完了時に、マトリックスの脱脂は、極性溶媒溶液が黄色に変わるように、マトリックスは無傷の脂肪組織の黄色オレンジ色の特徴から半透明に移行する必要があります/白 (図 1) 。これらの色の変化が発生しない場合は、脱脂が完了していない可能性があります。脱脂効率における患者間変動は一般的であるが、現在まで、被験者DMステータス、年齢、BMI、または他の臨床変数との脂質脱脂の効率の相関関係は観察されていない。大きなサンプル(20gを超える)は効率的な脂質を受けりません。サンプル <20 g を処理すると、この問題が発生する可能性があります。3日目以降にサンプルが完全に脱脂して表示されない場合は、サンプルを滅菌ハサミで半分に分割し、サンプルを新鮮な15~20mLの極性溶媒抽出液に移し、3~5時間軌...

細胞外マトリックス(ECM)は、組織の機械的足場を提供するだけでなく、その中に存在する細胞との複雑なクロストークにも従事し、細胞増殖を含む組織恒常性に必要な多様なプロセスを調節し、分化、シグナル伝達、代謝1.健康なECMは正常組織機能の維持に不可欠な役割を果たしているが、機能不全ECMは多重疾患2に関与している。
脂肪組織は、代謝性疾患の病因において重要な役割を果たす。肥満は、過剰な脂肪細胞肥大および細胞低酸素症、脂肪細胞細胞代謝の欠陥、および脂肪組織小胞体および酸化ストレスおよび炎症に関連している。十分に理解されていないが、これらの複雑なプロセスは、脂肪組織の栄養緩衝能を損なう陰謀を引き起こし、脂肪組織からの栄養オーバーフロー、複数の組織における毒性、および全身代謝疾患3、4を引き起こす、5.脂肪組織の不全の根底にある一連の事象および特定のメカニズムは十分に理解されていないが、脂肪組織ECMの改変は関与している。ECM組成物は、ヒトおよびマウス肥満における脂肪組織内で改変され、ECMタンパク質の堆積と、ヒト代謝疾患に関連する脂肪組織ECMの定性的生化学的および構造的差異が増加した。2型糖尿病および高脂血症6、7、8、9、10、11.
これらの観察にもかかわらず、脂肪組織機能障害を媒媒を媒取する脂肪組織ECMの役割は十分に定義されていない。これは、ECMおよび脂肪細胞の特異的役割の解剖を可能にする、究極の脂肪組織機能の調節を可能にするトラクタブル実験モデルの欠如によるものである。ECM-脂肪細胞培養は、少なくとも2つの点において在来脂肪組織の生体内環境をより良くシミュレートする。まず、ECM培養は、天然のコラーゲン、エラスチン、および標準的な2D培養に存在しない他のマトリックスタンパク質を含む天然脂肪組織と同様の分子環境を提供する。第二に、2Dプラスチック上の培養は、ECM培養が排除するプラスチック基板12の弾性低下による機械的効果を介して脂肪細胞代謝を変化させることが示されている。
脱細胞化脂肪体および他の組織からのECMの単離によって生物学的足場を設計する方法は、再生・再建医学及び組織工学13、14の文脈で検討されている。 15、16、17、18.我々は、ヒト内臓脂肪組織11に由来するECMおよび脂肪細胞幹細胞(プレディポサイト)を用いて、ヒトECM-脂肪細胞培養のインビトロ3Dモデルを開発するためにこれらの方法を適応させた方法論をこれまでに公表した。本稿では、これらの方法について詳しく説明する。ヒト脂肪組織の脱細胞化手順は、細胞および脂質を除去するための機械的および酵素的処置を伴う4日間のプロセスであり、由来する組織の特性を維持する生物学的足場を残す。脱細胞化ECMは、ヒトのプレジポサイトの脂肪族分化をサポートし、脂肪細胞で再構成されると、マイクロアーキテクチャと生化学的および無傷の脂肪組織の疾患特異的特性を維持し、代謝に従事するネイティブ脂肪組織の特徴的な機能。このマトリックスは、単独で研究したり、細胞で再播種することができ、脂肪組織の細胞および細胞外の成分との間の相互作用およびクロストークの研究を可能にする。

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#25200056</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL クライオバイアルチューブ</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#02-682-557</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin VWR</td><td>International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#89370-094</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro;m ナイロンメッシュフィルター</td><td>Corning Inc., Corning, NY, USA</td><td>Cat#352360</td><td></td></tr><tr><td>2-デオキシ-D-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#D8375</td><td></td></tr><tr><td>2 nM 3,3',5-Triiodo-L-thyronine ナトリウム塩 (T3)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#T6397</td><td></td></tr><tr><td>24-well tissue culture plates</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10861-700</td><td></td></tr><tr><td>3-イソブチル-1-メチルキサンチン (IBMX)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス</td><td>Cat#I5879</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル組織培養プレート</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10861-666</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌剤溶液 (ABAM)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#15240062</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス</td><td>Cat#B4639</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#A8806</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RLT</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>Cat#79216</td><td></td></tr><tr><td>Ciglitizone</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#C3974</td><td></td></tr><tr><td>Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-</td><td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#NET328A250UC</td><td></td></tr><tr><td>ウシ膵臓由来のデオキシリボヌクレアーゼI、II型</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス</td><td>Cat#D4513</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス</td><td>Cat#D4902</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td>ド <td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#BP231</td><td>可燃性、苛性</td></tr><tr><td>EDTA 二ナトリウム</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MAUSA</td><td>Cat#BP118</td><td></td></tr><tr><td>D-pantothenic acid hemicalcium salt</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. アメリカ ミズーリ州セントルイス</td><td>Cat#21210</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#11320033</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA</td><td>Cat#DSP-MD.43</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10027-446</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc.,米国マサチューセッツ州ウォルサム</td><td>Cat#10437028</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#G5882</td><td>苛性</td></tr><tr><td>ヘキサメチルジサリザン</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス</td><td>Cat#440191</td><td>可燃性、苛性ヒト</td></tr><tr><td>インスリン溶液</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス</td><td>Cat#I9278</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#A415</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#I5627</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#S25484</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 米国 ミズーリ州セントルイス</td><td>Cat#P5655</td><td></td></tr><tr><td>ブタ膵臓由来リパーゼ、VI-S Sigma-Aldrich</td><td>, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス</td><td>Cat#L0382</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4*7H2O</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 米国 ミズーリ州セントルイス</td><td>Cat#230391</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス</td><td>Cat#S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス</td><td>Cat#S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#S233</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#A661</td><td></td></tr><tr><td>最適な切断温度(OCT)化合物</td><td>Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK</td><td>Cat# AGR1180</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red-O Solution (ORO)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#O1391</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red-O Stain Kit</td><td>American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA</td><td>Cat#KTORO-G</td><td></td></tr><tr><td>四酸化オスミウム</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 米国 St Louis, MO, USA</td><td>Cat#201030</td><td>苛性アルカリ</td></tr><tr><td>フッ化フェニルメチルスルホニル (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス</td><td>Cat#93482</td><td>苛性</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat</td><td>#SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>牛膵臓由来のリボヌクレアーゼA, III-A型</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス</td><td>Cat#R5125</td><td></td></tr><tr><td>RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit</td><td>Qiagen,ヒルデン、ドイツ</td><td>Cat#74704</td><td></td></tr><tr><td>シンチレーション液</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#SX18</td><td></td></tr><tr><td>シンチレーションカウンター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハサミ、鉗子、滅菌</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソレンセンのリン酸塩緩衝液</td><td>Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ</td><td>CAS #: 10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>T-150 培養フラスコ</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10062-864</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#4369016</td><td></td></tr><tr><td>Temperature-controlled orbital shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer</td><td>Benchmark Scientific</td><td>Cat#D1030</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス</td><td>Cat#T3309</td><td></td></tr><tr><td>トリグリセリド測定キット</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#TR0100</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue stain, 0.4%</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Type II コラゲナーゼ</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#17101015</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Reeve Angel濾紙、グレード201、150mm</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.、米国ミズーリ州セントルイス</td><td>Cat#WHA5201150</td><td></td></tr></tbody></table>

マトリックス細胞代謝クロストークを研究するためのヒト3d細胞外マトリックス-脂肪細胞培養モデル

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

細胞外マトリックス(ECM)は、組織恒常性を調節し、細胞とのクロストークに従事し、細胞機能の複数の側面を調節する上で中心的な役割を果たします。ECMは、肥満における脂肪組織機能において特に重要な役割を果たし、脂肪組織ECM堆積および組成物の変化は、マウスおよびヒトにおける代謝疾患と関連している。グローバル組織表現型に寄与するECMおよび細胞の役割の解剖を可能にするトラクティン可能なインビトロモデルはまばらである。我々は、脂肪組織代謝表現型を調節するECMおよび脂肪細胞の特定の役割の研究を可能にするヒトECM-脂肪細胞培養の新しい3D体外モデルを記述する。ヒト脂肪組織は、ECMを単離するために脱細胞化され、その後、ECM内で成熟脂肪細胞に分化するプレディポサイトで再設定される。この方法は、代謝活性であり、それらが由来する組織および患者の特性を保持するECM-脂肪細胞構築物を作成する。このシステムを用いて、ヒト脂肪組織における疾患特異的なECM-脂肪細胞クロストークを実証した。この培養モデルは、世界的な脂肪組織代謝表現型に寄与するECMおよび脂肪細胞の役割を解剖するためのツールを提供し、脂肪組織恒常性を調節するECMの役割の研究を可能にする。

脂肪組織ECMの調製、プレディポサイトによる播種、および成熟脂肪細胞への体外分化により、プロトコル全体の進行を視覚的に評価できる組織の明らかな逐次形態変化をもたらす(図1).ECMの播種に用いられるプレディポサイトは、別々のVATサンプルからのコラゲネアゼ消化を用いて単離される(図2)。処理の各段階におけるECM-脂肪細胞構築物の走査型電子顕微鏡は、ECMの脱細胞化および再播種および分化時の脂質含有脂肪細胞のその後の再分類を明らかにする(図3)。脱細胞ECMのコラーゲン1特異的免疫組織化学は、コラーゲンマイクロアーキテクチャの維持を明らかにし、オイルレッドオー染色は、生と固定/断面化された3D ECM-脂肪細胞構築物は、脂質含有脂肪細胞を明らかにする(図4)A).ECMで分化した脂肪細胞からのqrtPC...

我々は、脂肪組織代謝表現型に寄与するマトリックスおよび脂肪細胞の役割の解剖を可能にする3Dヒト細胞外マトリックス脂肪細胞in vitro培養システムを記述する。

マトリックス細胞代謝クロストークを研究するためのヒト3D細胞外マトリックス-脂肪細胞培養モデル

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

我々のプロトコルは、ECMが古典的なアディポジェニックメディエーターの不在時に有数分化を促進する可能性があることを示し、ECMによる細胞代謝の疾患特異的調節を実証する最初の。我々の技術は、脂肪組織代謝におけるECMおよび脂肪細胞の役割を解剖するためのツールを提供し、脂肪組織の恒常性を調節するECMの役割の研究を可能にする。標準的な2D細胞培養と比較して、当社の3Dモデルは、2型糖尿病の文脈における脂肪細胞と脂肪組織ECMの間のクロストークのより堅牢な検査と解剖を可能にします。小さいサンプルから始め、細胞化の度合いを測定することをお勧めします。細胞の成長の度合いと組織の脱細胞化には、患者間のばらつきがあることを覚えておいてください。各ステップの前後に組織を観察して、組織が脱細胞化されていることを確認し、サンプル間の潜在的な違いを理解することが重要です。手術から内臓脂肪組織またはVATを得た後、50ミリリットル円錐形チューブ内の凍結緩衝液の15〜25ミリリットルに組織の5〜10グラムを追加することによって貯蔵のためにそれを準備します。完全にサンプルを浸し、脱細胞化するまでマイナス80°Cで保存します。プリディポサイトの分離のために、コラゲターゼII型溶液の20ミリリットルに無傷のVATの新鮮なサンプルの2グラムを入れてから、チューブに滅菌ハサミを挿入し、組織を徹底的にミンチします。細かいスラリーにひき刻んだら、軌道シェーカーで37°Cのコラゲナーゼ溶液に60分間インキュベートします。インキュベーション後、100マイクロメートルのナイロンメッシュを通して消化した結果を、新鮮な50ミリリットルの円錐形チューブにフィルター処理します。消化されたのは、適度な粘度と未消化組織の残留鎖の少量を持つ黄色オレンジ色の液体である必要があります。サンプルを270回gで10分間遠心し、上清を取り除き、ピペットで1X RBC溶解溶液の2ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。25°Cで1分間溶液をインキュベートし、15%FBS DMEM F12の10ミリリットルを加え、270回gで10分間遠心分離機を加えます。ECMを準備するには、定期的に穏やかな手動攪拌で20分間予熱水浴中でそれをインキュベートすることによって、以前に凍結したVATサンプルを摂氏37度に凍結/解凍します。解凍したら、組織をマイナス80度に20分間戻し、解凍で終わる凍結/解凍プロセスを3回繰り返します。滅菌鉗子を使用して、15〜25ミリリットルの酵素溶液1を含む新鮮な50ミリリットルの円錐チューブにVATサンプルを移し、サンプルが完全に浸漬されていることを確認します。その後、130 RPMで振りながら摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、15~25ミリリットルのリンスバッファー溶液でサンプルを3回洗浄し、洗浄後に溶液を注ぎます。サンプルを15~25ミリリットルの酵素溶液2で新鮮な50ミリリットルチューブに移し、一晩インキュベートします。リンスバッファー溶液でのこの溶液の化しを繰り返し、極性溶媒抽出液の15〜25ミリリットルを含む新鮮なチューブにサンプルを移します。振りながら一晩サンプルをインキュベートします。極性溶媒溶液でインキュベーションした後、脂質除去のためにサンプルを調べることが重要である。脂質の大部分が除去されない場合、この工程を繰り返す必要がある場合がある。より短いインキュベーション時間が使用されてもよい。インキュベーション後、15〜25ミリリットルのリンスバッファー溶液を含む新鮮なチューブにサンプルを移し、シェーカーでサンプルを3回洗浄します。その後、試料を70%エタノール溶液で3回洗浄し、各洗浄後にエタノールを注ぎ出す。サンプルを保存液で1回洗浄し、滅菌鉗子を使用して15〜25ミリリットルの貯蔵溶液を含む新鮮なチューブに移し、完全に浸漬してください。その後、サンプルは摂氏4度で最大1ヶ月間保存できます。イソプロパノールおよびエタノールは可燃性であり、室温で、可燃性廃棄物に廃棄されなければならない。人間の廃棄物は、通常のバイオハザード廃棄物とは別に処分する必要があります。保存されたECMフラグメントを、計画された下流アッセイに必要な数の断片を追加する無菌鉗子を備えた24ウェルプレートの個々の井戸に移します。軌道シェーカーで500マイクロリットルの70%エタノールで3回洗浄し、PBSで3回洗浄して水分補給します。100ミリグラムの断片にECMをカットするために滅菌はさみを使用してください。各断片を24ウェルプレートの1つの井戸に入れ、プレートを摂氏25度で15分間インキュベートし、余分なPBSが断片から押し出されるようにします。その後、慎重にピペットで井戸から残ったPBSを削除します。各断片に20マイクロリットルのプリディポサイト細胞懸濁液を播種し、細胞をECMに直接ピペット化します。ピペットチップをECMに入れ、マトリックスの中央にそっと出して、細胞懸濁液があふれないようにして、ウェルの底部に落とします。セル懸濁液が ECM からオーバーフローする場合は、その位置からピペットチップを取り外し、ECM 内の他の場所に挿入します。細胞播種後、摂氏37度で40分間ECMをインキュベートする。500マイクロリットルの成長培地を各ウェルに充填し、シードされたECMフラグメントをカバーします。細胞を摂氏37度、炭酸ガス5%で72時間培養します。72時間後、ECM断片を乱さずに成長培地を慎重に吸引する。500マイクロリットルの分化培地を加え、2~3日ごとに培地を交換して14日間細胞を培養します。光顕微鏡を使用して分化を確認します。細胞は脂質を蓄積し、色が茶色に変わり、分化するにつれてより球状になります。脂肪組織ECMの調製、前準備細胞による播種、および成熟脂肪細胞へのインビトロ分化を、ECMの脱細胞化及び再播種および分化時に脂肪細胞を含む脂質の再キャパライズを明らかにした走査型電子顕微鏡でモニタリングした。脱細胞化ECMのコラーゲン1特異的免疫細胞化学はコラーゲンマイクロアーキテクチャの維持を示し、一方で、生および固定された3D ECM-脂肪細胞構築物のオイルレッドO染色は脂肪細胞を含む脂質を示した。ECMで分化したアディポサイトを定量リアルタイムPCRを用いてアディポジェニック遺伝子についてスクリーニングし、これらの遺伝子がECMで培養された未分化前置細胞に対して分化細胞でアップレギュレートされていることを実証した。トランスクリプトレベルの全差が示される。糖尿病および非糖尿病の被験者からのECMおよびアディポサイトの4つの組み合わせが代謝型のフェノタイピングを行った。脂肪分解機能におけるグルコース取り込み障害は、糖尿病組織からの構築物で発見された。重要なことに、糖尿病性ECMは、糖尿病脂肪細胞におけるインスリン刺激グルコース取り込みおよび脂肪量を救うことが判明した。分離された前読細胞、脱細胞化組織、および再播種されたECMの汚染は珍しくない。無菌性は、プロトコル全体を通して熱心に維持されなければならない。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

標準的な培養法では、細胞は、それらの生理的環境から採取し、皿のプラスチック表面上に成長した。初代ヒト骨髄細胞の挙動を研究するために、我々は、細胞が組織の天然の微小環境をrecapitulating条件下で増殖される3-D培養系を作成した。...

初代ヒト骨髄およびその悪性腫瘍を研究する三次元組織培養モデル

成熟した脂肪細胞は、脱分化を通じて幹細胞の豊富な供給源を表している可能性があり、これにより線維芽細胞様細胞の均一な集団が形成されます。コラゲナーゼ消化は、ヒトの脂肪から成熟脂肪細胞を分離するために使用されます。私たちのプロトコルの目標は、ヒトの成熟脂肪細胞から多能性で脱分化した脂肪細胞を取得することです。...

天井の培養における成熟脂肪細胞の脱分化を経てヒト脂肪幹細胞の生成

白色脂肪組織 (WAT) には、薬理学的開発と代謝の研究を妨げる現在初代培養のモデルの重大な欠陥があります。ここで間質細胞のシートの間に挟むワット脂肪 microphysiological システムを生成するためのプロトコルを提案する.このコンス...

人間の脂肪のための Microphysiologic プラットフォーム: 白色脂肪組織に挟まれた

この方法の目的は、その後の細胞アッセイのための天然足場として線維芽細胞由来の3D行列を得る。線維芽細胞は、前処理された培養プレートに播種され、マトリックス生成のためにアスコルビン酸で刺激される。マトリックスは、脱細胞化され、関連する細胞(例えば、内皮細胞)を培養するために遮断される。...

内皮管形成アッセイに適用可能な線維芽細胞由来3Dマトリックスシステム

膜成熟性アディポサイト凝集培養(MAAC)は、成熟したヒトアディポサイトを培養する新しい方法である。ここでは、脂肪細胞をヒト脂肪から分離する方法とMAACを設定する方法について詳しく説明します。...

膜成熟性アディポサイト凝集培養(MAAC)を用いたヒト成熟性の単離と培養

ここでは、小干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA模倣体(miRs)、抗マイクロRNA(抗miR)などのオリゴヌクレオチドを成熟したアディポサイトに送達し、タンパク質およびマイクロRNA発現を調節するプロトコルを紹介します。...

タンパク質とマイクロRNA変調がアディポサイト機能に及ぼす影響を研究するアディポサイト細胞培養モデル

ここでは、ヒト皮下脂肪組織(hSATMVEC)から微小血管内皮細胞を単離、培養、および表現型決定するためのプロトコールについて説明します。さらに、hSATMVEC-脂肪細胞クロストークの実験モデルについても説明します。...

ヒト皮下脂肪組織における脂肪内皮細胞/脂肪細胞クロストークの研究

このプロトコルは、メタクリル化ゼラチン(GelMA)ハイドロゲルに埋め込まれたヒト骨細胞を用いて、脱細胞化細胞外マトリックスを補完した3D骨構造の製造を説明しています。この方法は低コストで拡張性が高く、基本的な実験機器と互換性があり、筋骨格系疾患の研究のための翻訳プラットフォームを提供します。...

ヒト骨細胞と脱細胞化細胞外マトリックスを用いて筋骨格系疾患をモデル化する3D骨培養プラットフォーム

生体外移植モデルを用いて、赤身マウスの内臓白色脂肪組織の前縁部の小片を7〜10日間培養し、高脂肪食摂食中の脂肪組織炎症の誘導と研究を可能にします。...

高脂肪食様脂肪組織炎症の 体外 マウスモデル

3D楕円体の生成のための簡単​​なハンギングドロップ細胞培養プロトコル

学ぶ3D細胞外マトリックス-脂肪細胞培養モデルを用いたヒト脂肪組織代謝におけるマトリックスと脂肪細胞の相互作用。この手法は2型糖尿病における細胞代謝の病態特異的制御を解明する。

マトリックス細胞代謝クロストークを研究するためのヒト3D細胞外マトリックス-脂肪細胞培養モデル

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