Name: クラスターによる脱着/イオン化質量分析による、表面上の複雑分子とその反応の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 学ぶDINeC法による質量分析で、SO₂クラスターを用いてペプチドやタンパク質などの生体分子を軟脱着イオン化し、表面の微細な化学変化をリアルタイムで検出する手法です。

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著者らは、ヘルムホルツ国際見本市センター(HICforFAIR)とヘルムホルツハドロン・アンド・イオン研究大学院(P.S.)からの資金援助を認めている。著者らは、ES-IBD/DINeC実験の組み合わせに関する実りあるコラボレーションに対するラウシェンバッハ教授(オックスフォード大学)と彼のチームに感謝する。

注: プロトコルはいつでも一時停止できます。
1. 基板の製造
<ol><li>標準サンプルの場合、シリコンウェーハ(厚さ約0.5~1mm)から1×1cm2の部分で基板を切断します。</li>
	<li>エタノールとアセトンの超音波浴でSi基質をそれぞれ15分間きれいにします。</li>
	<li>乾燥窒素ガスの流れで基材を乾燥させます。</li>
</ol>2. サンプルの調製
<ol><li>
標準サンプル調製
	<ol>
<li>標準サンプルの場合、分析対象の科学的な質問に従って分析物分子を含む溶液を準備します。検体の濃度は少なくとも1 x10-10モル/Lであるべきである。</li>
		<li>サンプル溶液を基板上にドロップキャストし、5~30μLとした。溶媒の蒸気圧に応じて、すべての溶媒が蒸発し、乾燥したフィルムが形成されるまで、サンプルを周囲条件下またはデシケータで乾燥させます。塗布される物質の量に応じて、フィルムの厚さは数10μm(目視検査可能)と単層をサブ単層レジーム(したがって目で検出できない)の間にすることができる。</li>
		<li>サンプルホルダーにサンプルを取り付けます(例えば、必要なサンプルと真空状態に応じて、ネジで締めた粘着テープまたはクランプを使用します)。</li>
		<li>可能であれば、アンジオテンシンIIのマイクロメータ厚フィルムなどの参照試料を、サンプルホルダーに加えて取付ける。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
代替サンプル調製
	<ol>
<li>真空またはディップコーティングにエレクトロスプレーイオンビーム堆積物(ES-IBD)などの代替サンプル調製スキームを使用します(該当する場合)。</li>
		<li>準備ステップの前にDINeCサンプルホルダーの真空中で準備および移送されるマウントサンプル。</li>
		<li>ディップコーティングされたサンプルは最終準備ステップの後に乾燥していることを確認してください。</li>
		<li>最も簡単な準備スキームを考えてみましょう。例として、蛍光ペンインクの調査のために、基板表面にドットを描くだけです。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. DINeC質量分析計へのサンプルの転写
<ol><li>
周囲条件からDINeCチャンバへのサンプルの移動
	<ol>
<li>負荷ロックシステムを通気します。</li>
		<li>ロードロックを開き、サンプルホルダーを取り付けます。</li>
		<li>負荷ロックを閉じて、負荷ロックチャンバーを2 x10-5 mbar未満の圧力にポンプダウンします。</li>
		<li>DINeCチャンバーにバルブを開き、転写ロッドを持つサンプルホルダーをメインマニピュレータに移します。サンプルホルダーをマニピュレータに取り付けます。</li>
		<li>転写ロッドを引き込み、負荷ロックとDINeCチャンバーの間のバルブを閉じます。 
		 </li>
		
	</ol>
</li>
	<li>
真空から排気されたDINeCチャンバーへのサンプルの移動
	<ol>
<li>DINeCチャンバのCF40フランジに取り付けることができる輸送可能な真空容器を使用してください。真空中で調製したサンプルを、真空を壊さずにこの容器で移します。サンプルが、DINeCシステムで使用されるマニピュレータと互換性のあるサンプルホルダーに取り付けられていることを確認します。</li>
		<li>CF40フランジに輸送可能な真空容器を取り付け、コンテナとDINeCチャンバーの間のボリュームを下ろします。</li>
		<li>圧力が2 x10-5 mbar以下に下がったら、DINeCチャンバーと輸送可能な真空容器にゲートバルブを開き、50cm以上の直線運動を持つウォブルスティックまたは別の転送システムを使用して、DINeCチャンバにサンプルをマニピュレータに移します。</li>
		<li>転送システムを引き込み、2つのゲートバルブを閉じます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ガス混合物の製造
<ol><li>ガス混合システムのガスボンベを10分間取り出して、ヘリウム中に約3%のSO2の混合物を調製する。</li>
	<li>1バーの圧力に達するまで、シリンダーをSO2で満たします。</li>
	<li>さらに30バールの総圧力に達するまで、シリンダーをヘリウムで満たします。 注意: SO2を使用する場合、指定されたガスキャビネットに SO2シリンダーを保管するなどのそれぞれの安全上の注意が必ず満たされている必要があります。</li>
</ol>5. DINeC質量分析計の調製
<ol><li>ガスボンベとノズルの間のバルブを開きます。ガス混合システムのアウトラインでSO2/Heガス混合物の圧力を15棒に調整します。</li>
	<li>マニピュレータの位置を参照サンプルの位置に設定します。</li>
	<li>カチオン質量スペクトルを測定する場合は、それぞれサンプルとグリッドバイアスを+40および+7 Vに設定します。</li>
	<li>パルスノズルとイオントラップ質量分析計を駆動するには、外部関数発生器を2Hzに設定します。遅延発生器を使用して、イオントラップからのクリアトラップ信号とパルスノズルのトリガ信号との間の時間遅延Δtnを5 msに設定します。</li>
	<li>コントロールソフトウェアでは、それぞれのボタンを押すか、メインダイアログウィンドウのモードページでそれぞれの値を入力して、次のパラメータを調整します:スキャンモード:解像度の強化、範囲:m/ z 50-3000、Accu-time:0.1ミリ秒、平均:10サイクル、極性:陽線質量スペクトルの測定のための正 注:陰イオンスペクトルを測定するには、サンプルとグリッドの偏りは地面に対して負である必要があり、極性は制御ソフトウェアで負に切り替える必要があります。</li>
</ol>6. 質量スペクトルの測定
<ol><li>DINeCチャンバーで3 x10-6 mbar未満の圧力に達したら、測定を開始することができます。最初にスタンバイを押してから、コントロールソフトウェアで操作を押して測定を開始します。再生ボタンを押して測定値の記録を開始します。</li>
	<li>アンジオテンシンIIなどの参照試料から約300sの測定を行い、それぞれm/z値に設定されたクロマトグラムを用いて信号の時間依存性に従います。クリアトラップ信号とパルスノズルをトリガする信号との間の時間遅延Δtnの調整により信号強度を最適化します。</li>
	<li>マニピュレータを測定するサンプルの位置に移動します。サンプルホールダー面内のサンプル位置を調整することで、信号強度を最適化します。</li>
	<li>関心のある期間にわたって質量スペクトルを取得します。実験の詳細に従って、チャンバー内のサンプル温度や背景圧力などの実験パラメータを変更します。実験パラメータを変化させると質量スペクトルを取り続けます。</li>
</ol>7. データ評価
<ol><li>測定が完了したら、データ分析プログラムでそれぞれのデータセットをロードします。マウスの右ボタンでクロマトグラムの対象期間を選択します。平均スペクトルは別のウィンドウに表示されます。</li>
	<li>選択したプログラムで処理を進めるため、スペクトルをデータ ファイルとしてエクスポートします。</li>
</ol>

<ol><li>Vickerman, J. C., Gilmore, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVickerman%2C+JC+%22Surface+Analysis%3A+The+Principal+Techniques%22">Surface Analysis: The Principal Techniques</a>. , 2nd ed, John Wiley & Sons. New York. (2009).</li>
<li>Reutzel, M., Münster, N., Lipponer, M. A., Länger, C., Höfer, U., Koert, U., Dürr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoselective+Reactivity+of+Bifunctional+Cyclooctynes+on+Si%28001%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+C%22%5BJournal%5D)">Chemoselective Reactivity of Bifunctional Cyclooctynes on Si(001).</a> Journal of Physical Chemistry C. 120, 26284-26289 (2016).</li>
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<li>Stutzmann, M., Garrido, J. A., Eickhoff, M., Brandt, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+biofunctionalization+of+semiconductors%3A+A+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Physica+Status+Solidi+A%22%5BJournal%5D)">Direct biofunctionalization of semiconductors: A survey.</a> Physica Status Solidi A. 203, 3424-3437 (2006).</li>
<li>Adler-Abramovich, L., Gazit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physical+properties+of+supramolecular+peptide+assemblies%3A+from+building+block+association+to+technological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">The physical properties of supramolecular peptide assemblies: from building block association to technological applications.</a> Chemical Society Reviews. 43, 6881-6893 (2014).</li>
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<li>Ichiki, K., Ninomiya, S., Nakata, Y., Honda, Y., Seki, T., Aoki, T., Matsuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Sputtering+Yields+of+Organic+Compounds+by+Large+Gas+Cluster+Ions%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Surface+Science%22%5BJournal%5D)">High Sputtering Yields of Organic Compounds by Large Gas Cluster Ions.</a> Applied Surface Science. 255, 1148-1150 (2008).</li>
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<li>Portz, A., Aoyagi, S., Durr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+depth-profiling+of+mixed+peptide%2Flipid+samples+by+means+of+cluster+induced+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+-+high+depth+resolution+and+low+matrix+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Soft depth-profiling of mixed peptide/lipid samples by means of cluster induced desorption/ionization mass spectrometry - high depth resolution and low matrix effect.</a> Biointerphases. 13, 03B405(2018).</li>
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<li>Schneider, P., Durr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cluster-induced+desorption+investigated+by+means+of+molecular+dynamics+simulations+-+Microsolvation+in+clusters+of+polar+and+non-polar+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Cluster-induced desorption investigated by means of molecular dynamics simulations - Microsolvation in clusters of polar and non-polar constituents.</a> Journal of Chemical Physics. 150, 214301(2019).</li>
<li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Desorption+Ionization+of+Proteins+with+Molecular+Masses+Exceeding+10+000+Daltons%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10 000 Daltons.</a> Analytical Chemistry. 60, 2299-2301 (1988).</li>
<li>Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+Imaging%3A+A+Review+of+Emerging+Advancements+and+Future+Insights%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights.</a> Analytical Chemistry. 90, 240-265 (2018).</li>
<li>Portz, A., Gebhardt, C. R., Durr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Investigation+of+the+H%2FD+Exchange+Kinetics+of+Porphyrins+and+Oligopeptides+by+Means+of+Neutral+Cluster-Induced+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Real-Time Investigation of the H/D Exchange Kinetics of Porphyrins and Oligopeptides by Means of Neutral Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry.</a> Journal of Physical Chemistry B. 121, 11031-11036 (2017).</li>
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</ol>

著者らは、開示するものは何もないと宣言している。

これまでに行われた多くの研究において、様々な物質に対するDINeC-MSの高感度が実証されている。実際、これはフェムトモールレジーム11内の物質の量まで検体の測定を可能にする。この高感度のため、サンプル調製、特に基板洗浄は、DINeC質量スペクトルの汚染を回避するために、高純度の化学物質で行われないものとなっ必要があります。多くの解析技術の場合は、空の基板からの適切なバックグラウンド測定は、基板/サンプル調製においてその起源を有する分析物およびピークからピークを分離するのに役立ちます。
我々は、所定の分析体分子のイオン化確率が混合試料17、24における共吸気または共構成成分の存在によって強く影響されないことを示したが、イオン化確率は物質から物質13に異なる場合がある。したがって、汚染物質としてクリーンな条件下で働き、イオン化の確率に応じて、検体よりもはるかに強い信号に寄与する可能性があります。予磁性イオン(例えば、多くの色素分子の場合に見られる)、または、プロトンの取り込みまたは脱プロトン化(すなわち、塩基または酸)に対する明確な傾向を示す官能基を有する分子は、典型的にはDINeC−MSにおける高いイオン化確率を示す。そのような官能基が検分に存在しない場合、イオン化確率は低くなる可能性がある。次いで、トリフルオロ酸などのイオン化剤(例えば、イオン化剤の蒸気圧への試料の曝露によって)により試料を処理することができる。
図4と図5で説明した代表的な結果は、質量分析法による化学反応のリアルタイム調査のためのDINeC-MSの適用性を示す。図6は、その方法のサブモノ層感受性を示す。2つの特性が組み合わされば、表面上の化学反応とその製品はリアルタイム23で追跡することができる。これは、表面3、33、34、35、36上の高分子構造の集合につながるいわゆる「表面合成」のために特に興味深いことができます。現在のセットアップでは、このような表面反応の観察は、金23や他の貴金属のような低い反応性を有する表面上で可能である。この実験は、シリコン表面37のような高反応性の表面で行われるのがより困難であり、脱着チャンバ内の塩基圧は10-7-mbar-範囲にある。現在の活動はこの制限に対処し、UHV互換DINeC装置が構築されています。反応性表面の場合、表面吸引および表面反応の測定の前に、SO2と基質表面との相互作用を試験しなければならない。
クラスタビームは中立であるため、集光できません。サンプル上のビームサイズは、このように使用中のスキマーのセットアップとオリフィスの形状によって与えられます。サンプルのビーム直径の典型的な値は、1〜数ミリメートルです。その結果、サンプルをスキャンすることで撮像が可能なのは、極めて低解像度の場合に限られる。一方、高いイオン化確率13によって与えられて、DINeCは脱着分子を効率的に利用する。従って、DINeC-MSとイオンイメージング検出器38の組み合わせは非常に魅力的であると思われる。

表面に敏感な解析技術は、多くの場合、固体試料と強く相互作用する低エネルギー電子、原子、またはイオンなどの粒子プローブに基づいています。結果として、それらは高い表面感受性を示し、表面構造の詳細な情報は1得ることができる。しかし、化学情報は多くの場合、限られています。例として、X線光電子分光法は、原子組成および特定の種の平均化学環境(例えば、表面2に吸着された有機分子中の炭素原子)に関する定量的情報を与えることができる。しかし、その詳細な構造や結合部位など、複雑で表面吸着した分子に関するより詳細な情報は、標準的な表面分析技術では得られにくい。一方、このような情報の必要性は、有機分子による表面機能化への関心の高まりとともに増大している。生体分子4,5の付着による表面合成3または表面官能化の分野の拡大は、2つの顕著な例である。これらの分野において、システムをよりよく理解するために、基質吸引および吸引吸引相互作用に関する基本的な質問が調査される。これらの調査のためには、吸着分子に関する情報の最大値が望ましい。
一部では、二次イオン質量分析(SIMS)は、このような情報を与えることができます。まず、SIMS は表面に非常に敏感です。第二に、スパッタをした側がMSによってその断片を吸引し、その断片が検出されると、原子組成をはるかに超えた情報が得られる。表面に吸着される化学種の性質に応じて、質量スペクトル6で観察されたその分子質量およびフラグメントパターンによって同定することができる。一次イオンによって誘導される断片は、分析された材料の同定に役立ちます。一方、試料の一次イオン誘導修飾(断片化、イオン誘導反応、混合)が強すぎると、サンプルの元の状態に関する情報が殆して失われる。したがって、SIMSの断片化を減らすために主要な努力がなされている(例えば、一次イオンとして荷電した分子クラスターを使用して7、8、9)。しかし、断片化は依然として大きな巨大分子と生物学的サンプル10のSIMSスペクトルを支配し、様々な分野でのSIMSの適用を制限している。
代替として、中性クラスター(DINeC)によって誘導される脱離/イオン化は、複雑分子11、12、13、14、15、16、17の質量分析にうまく用いられた柔らかくマトリックスフリーのイオン化法であることを示した。DINeCは、10 3〜104個のSO2分子からなる分子クラスターのビームに基づいています(図1)。クラスターがサンプルに影響を与えると、クラスターの運動エネルギーの一部が再分配され、脱着が活性化され、表面の分子とさまざまな方法で相互作用します。同様に重要な点は、脱着分子がクラスター表面衝撃11、18、19の間にクラスターに溶解される(図1および図2)。つまり、SO2の高双極モーメントに基づいて、クラスターは極性アナライトの非定常行列として非常に効率的に機能する。その結果、アナライト分子の脱離は、1 eV/分子以下のクラスターエネルギーで行われます。脱着プロセスの柔らかい性質は、表面衝撃11、19の間および後にSO2クラスタが粉々になったときにシステムの急速冷却によってさらに支えられている。これらの様々な側面の結果として、ペプチド、タンパク質、脂質、および色素などの複雑な分子のクラスター誘発脱着は、脱離分子11、15の断片化なしで進行する。典型的な質量スペクトルは、インタクト分子のm/z値([M+H]または[M-H]-、図3)のm/z値で支配的なピークを示します。分子中の官能基の数および性質に応じて、複数の荷電カチオンの形態[M+n·」H]n+は11、15、18が観察される。生体分子の場合、イオン化は、通常、塩基性または酸性官能基でのプロトンの取り込みまたは抽象化を介して行われ、それぞれ11である。試料中に水分子が存在する場合、クラスタ由来のSO2分子は、亜硫酸18を形成するこれらの水分子と反応し得る。後者は、プロトン取り込み(正イオンモード)13、18を介したイオン化の場合のイオン化プロセスをさらに促進する効率的なプロトン源として作用することができる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60487/60487fig1a.jpg"> 図1:クラスター誘発脱着/イオン化と実験的なセットアップの概略図クラスター誘導脱離/イオン化は、高真空容器で行われます。SO2クラスター(黄色のドット)のビームは、パルスノズルからのSO2/Heガス混合物の超音速膨張によって生成される。クラスター表面衝撃の間、表面分子は脱着され、イオン化されます。分子イオン(赤/オレンジドット)は、バイアスされたグリッド、デュアルイオン漏斗の入口、およびオクトポーライオンガイドを介して質量分析用のイオントラップに送られます。典型的な質量スペクトルは、インタクト分子のm/z値で優勢なピークを示し、ここではM1(オレンジ)およびM2(赤色)を正イオンモードで示します。爆破: クラスター表面衝撃時に、脱着分子が衝撃クラスターまたはそのフラグメントの 1 つに溶解します。さらにSO2分子の粉砕および蒸発は、質量分析計で検出されたように、裸の無傷の分子イオンに至る。図2も参照してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60487/60487fig1alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60487/60487fig2a.jpg"> 図2:分解によるクラスター誘導脱着を示す分子動力学シミュレーションのスナップショット(A)SO2クラスター(300分子)は、ジペプチド(アスパラギン酸アルギニン、ASP-ARG)が吸着された表面に対して1250m/s直交で表面に接近する。(B)クラスター表面の衝撃の際に、クラスターが粉々になる。吸着ジペプチドは、周囲のSO2分子と相互作用し、クラスター断片の1つでその解決につながる。(C)クラスター断片が表面からはみ出す。標識された断片(青い円)は、この断片に脱着されたジペプチドを運ぶ。この図は参照19から修正されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60487/60487fig2alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60487/60487fig03.jpg"> 図3:アンジオテンシンIIの代表的な質量スペクトル及び分子モデル(A)質量スペクトル(上パネル:正イオンモード、底部パネル:負イオンモード)は、アンジオテンシンIIサンプルからクラスター誘導脱離/イオン化後に得られたもの。サンプルを、それぞれの溶液をSiウエハ(その天然酸化物で覆われた)上にドロップキャストして調製した。主なピークは、無傷の生体分子[M+H]+および[M-H]に割り当てられます。フラグメンテーション パターンは観察されません。ダイマー([2M+H]+、矢印)は、脱着プロセスの柔らかい性質をさらに示す。正イオン信号は、SO2クラスタ18の影響によりより強い。(B)アンジオテンシンIIの空間充填モデル及びアミノ酸配列。白いボールは水素原子を示す。ブラック: カーボン;青:窒素;赤:酸素。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60487/60487fig3alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
DINeCは高真空条件と互換性がある固体サンプルの任意の並べ替えに適用することができる。特別なサンプル調製は必要なく、特に、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)質量分析および関連技術20、21とは対照的に、DINeC-MS測定の前にマトリックスを適用する必要はない。これにより、真空チャンバー22または試料温度における反応性種のバックグラウンド圧力など、様々な実験条件で試料の化学的変化をリアルタイムで測定することが可能になる。DINeC-MSの検出限界はフェムトモール範囲11であることが示されている。サブモノ層レジーム内の固体表面に吸着した生体分子の解析に適用すると、単層の0.1%程度の表面被覆が検出された23。このカバレッジレジームでは、信号強度は表面カバレッジに直線的に依存し、DINeC-MSは、表面組成23の定量分析に使用することができる。混合サンプルの場合、試料組成物の定量的評価は17、24が可能であり、イオン化確率に対する化学的環境の大きな影響は認められない(例えば、混合脂質/ペプチドサンプル17の場合)。これは、特定の種のイオン化確率が、典型的には異なる化学成分の存在によって強く影響されるSIMSとは明らかな対照である(いわゆる「マトリックス効果」25、26)。
表面分析に加えて、地下領域の化学組成は、深度プロファイリング17によって探査することができる。現在のセットアップでは、生体分子のクラスター誘導脱着の典型的な脱離率は、10-3 nm/sの順序です。混合脂質/ペプチドサンプル17に対して1〜2nmの範囲で高い深度分解能が観察されている。
さらに応用分野としては、DINeC-MSと薄層クロマトグラフィー(TLC)の組み合わせがあります。従来のTLCプレートは、DINeC-MSを用いて直接分析することができ、位置依存性質量スペクトルはTLCプレートから取得することができ、したがってTLCプレート27から質量特異的クロマトグラムを得ることができる。分離された検体の再溶出は必要なく、ESI28、29と組み合わせて TLC と異なる。MALDI28、29とのTLCの結合とは対照的に、DINeC-MS + TLCの組み合わせにもマトリクスは必要ありません。
脱離エレクトロスプレーイオン化(DESI)はまた、MSアプリケーション30、31のためのソフト脱離/イオン化方法である。DINeCとDESIの最も顕著な違いは、DINeC23の定量的性質、超高真空(UHV)条件との互換性、特に真空23を破ることなくUHV条件で調製および移送されたサンプルを調査する可能性、および非極性分子19を効率的に脱脱する可能性である。
原則として、脱離/イオン化源としてのDINeCは、あらゆるタイプの質量分析計に結合することができる。しかし、イオントラップ質量分析との組み合わせは、2つの主な利点を特徴とする:第1に、典型的なパルス化されたクラスタービームのパルス幅および繰り返し速度は、イオントラップ15のスペクトルレートと同様に不連続蓄積時間に非常によく対応する、32。第二に、DINeCプロセスの柔らかい性質は、無傷の分子の脱着につながります。イオントラップ質量分析法のMSn能力と組み合わせて、調査されたサンプル15の最も包括的な分析が可能となる。

<table><tbody><tr><td>アセトンrotisolv HPLC</td><td>ロス</td><td>7328.2</td><td>HPLC勾配グレード</td></tr><tr><td>銅テープ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノールrotisolv HPLC</td><td>ロス</td><td>p076.1</td><td>HPLC勾配グレード</td></tr><tr><td>ヘリウム</td><td>Praxair</td><td>4800086706</td><td>純度99.9999%</td></tr><tr><td>窒素</td><td>Praxair</td><td>40728408</td><td>純度99.5 - 100%</td></tr><tr><td>シリコンウェーハ</td><td>Active Business Company GmbH</td><td>G60007</td><td></td></tr><tr><td>二酸化硫黄</td><td>エア リキード</td><td>P1734S10R0A001</td><td>純度 99.98%</td></tr> <tr><td>水 rotisolv LC-MS</td><td>Roth</td><td>HN43.1</td><td>ウルトラ LC-MS</td></tr></tbody></table>

クラスターによる脱着/イオン化質量分析による、表面上の複雑分子とその反応の解析

Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

中性SO2クラスター(DINeC)によって誘導される脱離/イオン化は、複雑な分子の質量分析(MS)および表面上の反応のための非常に柔らかく効率的な脱離/イオン化技術として採用されています。DINeCは、低クラスターエネルギーでサンプル表面に影響を与えるSO2クラスターのビームに基づいています。クラスター表面衝撃の間、表面分子の一部は、衝撃性クラスター内の分解によって脱着され、イオン化されます。この解決媒介脱着機構の結果として、低クラスターエネルギーが十分であり、脱着プロセスは極めてソフトである。表面が吸着し、表面が構成されている分子の両方を解析することができます。ペプチドやタンパク質などの複雑な分子から、透明で断片化のないスペクトルが得られます。DINeCは特別なサンプル調製を必要とせず、特にマトリックスを適用する必要はありません。この方法は、サンプルの組成に関する定量的な情報を生成します。単層の0.1%という低い表面の範囲の分子を検出することができる。H/D交換や熱分解などの表面反応はリアルタイムで観察でき、反応の動態を推定することができます。クラスタビーム生成用のパルスノズルを使用して、DINeCをイオントラップ質量分析と効率的に組み合わせることができます。DINeCプロセスのマトリックスフリーでソフトな性質は、イオントラップのMSn機能と組み合わせて、複雑な有機サンプルの化学組成と表面上の有機吸引の非常に詳細かつ明確な分析を可能にします。

以下では、DINeC-MSのリアルタイムアプリケーションの2つの例を紹介します。図4は、試料を約140°Cまで加熱した場合にアンジオテンシンIIから得られた質量スペクトルの変化を示す。最終温度に達すると(図4B、図4E)、スペクトルは、H2Oエンティティの損失(m/z = 1029)の損失を示す追加のピークによって特徴付けられます。試料をその温度に保つ場合、アンジオテンシンII分子の更なる分解が観察される(図4C)、一方の末端アミノ酸単位の損失を含む、アスパラギン酸(m/z=932、図4Dのピーク)データの定量分析は、基礎となる反応速度を評価することを可能にする(図4E)。特に、図4Eは、m/z = 1029のエンティティが、強度が最初に増加し、次に減少するにつれて、さらに小さな断片に分解する中間体であることを示しています。したがって、付随するレート定数は同じ大きさの順序になります。
第2の例として、アンジオテンシンII22における水素/重水素交換の検討を図5に例示する。DINeCチャンバー内のD2Oに対するアンジオテンシン試料の曝露(p D2O=10-4mbar)では、アンジオテンシンIIの同位体パターンが広がり、D原子によるHの交換を示すm/z値の方が大きくなる。最初の60sの間にプロセスは速いが、実験のさらなる過程でかなり遅くなる:図5Bの同位体パターンは広いm/z範囲(およそ15 m/z単位)をカバーする。分子中で交換されたH原子の数としてdの重さを定義すると、d=0~d=13の間のdの値をスペクトルから抽出することができる。図5Cでは、同位体パターンが再び幅が縮小されている。この観察は、最も低い重水素度に関連するピークの強度を強く減少させたものと考えることができます。図5Dでは、スペクトルはさらに長い反応時間を示しています。カバーされたm/z範囲はほぼ同じですが、スペクトルの重心はm/z値の増加に向かってゆっくりとシフトします。長時間露光時間の場合、分子の一部は、最大dmax=17の最高度の重合度に達する。これは、カルボン酸またはアミン基などの官能基に結合したH原子の数によって与えられる交換可能なH原子の最大数に対応する。
すでにスペクトルの時間的進化から、H/D交換が異なるレート定数で行われることを推測することができます。この観察の定量的記述のために、dの平均重水素度は、時間の関数として図5Eにプロットされる。実験結果(記号)の検査は、t &lt; 50 s のd-操作の急速な増加、50 s &lt; t &lt; 200 s の中間体制、t &gt; 200 s の低速だがほぼ連続的な増加の 3 つの異なる体制を明らかにします。実験結果はモンテカルロシミュレーションによってシミュレートされた。反応定数を有する擬似一次反応速度論kiは、22を調べた分子の官能基におけるH/D交換について想定した。3つの全てのモデルにおけるシミュレーションと実験結果の間の良好な一致は、アンジオテンシンII分子のH/D交換に対して少なくとも3つの異なる速度定数kiが適用された場合にのみ得られた。図5F,Gでは、異なる重合度の同位体パターンの和によって実験同位体パターンをフィッティングすることから推定される速度論(図5A〜図5D)が示されている。実験データとシミュレーションの間の良好な一致と、低度と高い重水素化のための非常に異なる為替レートが明確に観察されています。六糖リシンのような異なるオリゴペプチドとの比較により、高速交換レートは明示的官能基に起因し、一方、遅い交換レートはペプチドの骨格22のアミド基に関連していた。
これらの最初の2つの例をマイクロメートル厚のアンジオテンシンIIサンプルで測定したのに対し、図6は、エレクトロスプレーイオンビーム堆積(ES-IBD)23によって調製された金試料上のアンジオテンシンIIのサブモノ層被覆から得られた結果を示す。物質量に対するシグナル強度の直線的依存性が3桁以上に観察され、検出された物質の最も低い量は、金表面上のアンジオテンシンII分子の単層の0.1%に相当する。図5に示すH/D交換実験も、サブモノ層レジーム23中の金に対するアンジオテンシンIIを用いて行った。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60487/60487fig4a.jpg"> 図4:アンジオテンシンIIの熱分解のリアルタイム観察(A-C)アンジオテンシンII試料からクラスター誘導脱離/イオン化後に得られた質量スペクトル。(A) RT.(B)サンプルでの新鮮な試料は、約140°Cまで加熱した。m/z = 1047のピークに加えて、m/z =932、1012、および1029のピークが現れる(矢印で示される)。 (C)後者のピークは上昇し、試料を高温に保つときには、主ピークは時間とともに減少する。(D)アンジオテンシンIIの構造式は、1つのアミノ酸単位(アスパラギン酸)の喪失によってm/z=932でピークの出現につながるフラグメント(茶色の括弧)を示す。(E)プロット(A)から(C)に示される主ピークの温度と強度の時間依存性。実線は目のガイドです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60487/60487fig4alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60487/60487fig05.jpg"> 図5:アンジオテンシンIIにおけるH/D交換のリアルタイム観察(A-D)DINeC-MSの手段により得られたアンジオテンシンIIのカチオン質量スペクトルは、H/D交換により、(A)に示す未定種の同位体パターンと比較して、同位体パターンが広がり、(B)のm/z値の方が(D)に大きくシフトする。赤い線はデータであり、破線は異なる程度の重水素を考慮してデータに適合する。(E)実験から推定した時間の関数としてdの平均重水素化度(オープンドット)また、モンテカルロシミュレーションにより推定される時間の関数としてd黒い破線曲線: 1 つのレート定数(k1)を考慮したシミュレーション赤い曲線:3つのレート定数(k1 、k2、k 3)を考慮します。(F,G)アンジオテンシンIIの選択された度合いの相対信号強度(記号+実線)は、モンテカルロシミュレーション(破線)の対応する結果と共に時間の関数として。この図は参照22から修正されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60487/60487fig5alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60487/60487fig06.jpg"> 図6:サブモノ層体制における金に対するアンジオテンシンIIへのDINeC-MSの適用(A)サブモノ層体制における単離型アンジオテンシンII分子の質量分析のための堆積用ES-IBDとDINeC-MSの組み合わせの概略図。(B) 2つの独立したデータセット(充填および開いたシンボル)から得られたサンプル上に堆積した物質の量に対するシグナル強度の依存性。インセット:示されるように物質の量が堆積したサンプルから得られたDINeC質量スペクトル。この図は参照23から修正されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60487/60487fig6alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

低運動エネルギーの中性SO2クラスター(<0.8 eV/構成要素)は、イオントラップ質量分析計を用いた質量分析によるさらなる分析のために、ペプチドや脂質などの複雑な表面分子を脱ソーブするために使用されます。特別なサンプル調製は不要で、反応のリアルタイム観察が可能です。

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass ...

我々は短いDINeCで呼び出す中性SO2クラスターによって誘導される脱離イオン化は、ソフトで効率的な脱離イオン化法である。ペプチドやタンパク質などの生体分子の質量分析などに使用しています。DINeCとして、サンプル表面からそのまま脱離分子が、これらの分子の微妙な化学変化は、質量スペクトルで容易に検出される。このプロセスは、次のシミュレーションで示されています。入ってくるクラスタは、クラスタ内サーフェスの衝撃によって粉砕されます。表面同位体ジペプチドは、このプロセスによって1つのクラスター断片に溶解され、脱ゾアプトされる。実験では、パルスノズルから超音速膨張を介してSO2クラスターのビームが生成されます。クラスター表面衝撃時に溶解・イオン化された分子は、質量分析のためにイオントラップに移されます。典型的な質量スペクトルは、無傷の分子のMO設定値でのピークのみを示す。この手順のデモンストレーションは、カロリン・ボムハルトとパスカル・シュナイダー(私の研究室の2人の博士課程の学生)です。標準サンプルの場合、厚さが約0.5~1ミリメートルのシリコンウェーハから基板を1平方センチメートルずつ切ります。エタノールとアセトンの超音波浴でシリコン基板をそれぞれ15分間洗浄します。乾燥窒素ガスの流れで基板を乾燥させます。次いで、サンプル溶液の5~30マイクロリットルを基板上に投下する。溶媒の蒸気圧に応じて、全ての溶媒が蒸発し、乾燥膜が形成されるまで、試料を周囲条件下またはデシケーターで乾燥させます。最も簡単な準備スキームを考えてみましょう。例として、蛍光ペンの調べた場合、基板表面にドットを描くだけです。サンプルを粘着テープまたはクランプでネジで締めてサンプルホルダーに取り付けます。さらに、アンジオテンシンIIのマイクロメータ厚膜などの基準試料をサンプルホルダーに取り付けます。次に、ベントロードロックを押して、ロードロックシステムをベントします。5分間、または気圧に達するまで待ちます。ロードロックを開き、サンプルホルダーを取り付けます。負荷ロックを閉じ、負荷ロック室をマイナス5ミリバールまで2倍の10以下の圧力にポンプダウンします。バルブをDINeCチャンバーに開き、転送ロッドを持つサンプルホルダーをメインマニピュレータに移します。サンプルホルダーをマニピュレータに取り付けます。転写ロッドを引き込み、ロードロックとDINeCチャンバの間のバルブを閉じます。ガスボンベとノズルの間のバルブを開きます。ガス混合システムの輪郭で二酸化硫黄とヘリウムガス混合物の圧力を15棒に調整します。マニピュレータの位置を参照サンプルの位置に設定します。カチオン質量スペクトルを測定するには、サンプルとグリッドバイアスをプラス40ボルト、プラス7ボルトにそれぞれ設定します。パルスノズルとイオントラップ質量分析計を駆動するには、外部機能発生器を2ヘルツに設定します。遅延発生器では、イオントラップからのクリアトラップ信号とパルスノズルのトリガ信号の間の時間遅延を5ミリ秒に設定します。Bruker コントロール ソフトウェアのメイン ダイアログ ウィンドウの [モード] ページで、[スキャン モードの解像度を拡張] を選択します。範囲の場合はMオーバーZ 50〜3000に入力し、蓄積時間は0.1ミリ秒で、平均で10サイクルで入力し、極性については陽イオンスペクトルの測定に正を選択し、陰性スペクトルの測定に正を選択します。DINeCチャンバーでマイナス6ミリバールに対して10倍以下の圧力が到達したら、測定を開始する。時間依存クロマトグラム信号に従うために、M over Z値をそれぞれの質量に設定します。コントロールソフトウェアで[操作]を押します。録音ボタンを押して、測定値の記録を開始します。アンジオテンシンIIなどの基準試料から約300秒間テストスペクトルを測定します。クリアトラップ信号とパルスノズルをトリガする信号との間の時間遅延の調整により、信号強度を最適化します。時間遅延を最適化した後、マニピュレータを測定するサンプルの位置に移動します。[記録]ボタンをクリックして、対象期間の質量スペクトルを取得します。測定が終了したら、参照測定用に次に示すように、データ分析プログラムにそれぞれのデータセットをロードします。マウスの右ボタンでクロマトグラムの関心期間を選択します。平均スペクトルは別のウィンドウに表示されます。選択したプログラムでの処理のためにスペクトルをデータファイルとしてエクスポートするには、[ASCIIファイルとしてエクスポート]をクリックします。アンジオテンシンIIサンプルからのDINeC質量スペクトルは、サンプルを摂氏約140度に加熱するにつれて時間とともに変化した。温度が最終値に達すると、Z等しい1047のMで攻撃されたプロチン化された分子のピークが低下し、新しいピークが観測された。このプロセスは、この3つのグラフにまとめられています。932、1012、および1029に等しいZ上のMでの追加のピークはよく観察された。反応キネティクスの分析は、Z上のMを持つ実体が1029に等しい中間体であり、最初に強度が増加し、次に減少するにつれてさらに小さな断片に分解されたことを示している。DINeCの最も重要な特徴は、脱離プロセスの柔らかい性質、効率、および高い表面感度です。これらはすべて、サンプル調製に関して低い要件と一緒に来ます。DINeCは、有機樹皮材料から、単層領域内の複雑な表面吸着物に至るまで、さまざまなサンプルに適用することができます。すべての場合において、完全な化学情報をリアルタイムで得ることができます。

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合成高分子の質量分析法 (MALDI-TOF MS)...

マトリクスによる合成高分子のキャラクタリゼーション支援レーザー脱離イオン化時間 (MALDI Tof) 質量分析装置

質量分析 (MS) は、高分子アセンブリのダイナミクスと構造調査のための重要なツールとして浮上しています。ここでは、我々 はタンパク質複合体形成とリガンドを尋問する MS ・ ベース ・...

タンパク質のアーキテクチャと統合構造質量分析法によるタンパク質-リガンド複合体の分析

このワークフローは、定量的なグローバルプロテオーム分析のために、複数のタンパク質翻訳後修飾(PTM)を同時に時間効率とコスト効率の高い濃縮のパフォーマンスを説明します。このプロトコルは、ペプチドレベルPTM濃縮を複数の結合抗体で利用し、続いてデータ非依存の獲得質量分析を行い、PTMクロストークに関する生物学的洞察を得る。...

定量化とサイトローカリゼーションのための2つの翻訳後修飾の同時アフィニティエンリッチメント

イオン移動度分析(IMS)は、生体分子の特性評価のための質量分析を補完する興味深いものであり、特に異性化に敏感であるためです。このプロトコルは、分子の単離とその断片の移動度プロファイルの生成を可能にするタンデムIMS(IMS/IMS)実験を記述します。...

タンデムイオン移動度実験のための周期的イオン移動度分光計の使用

精密質量測定は、タンパク質の研究における重要なステップである。マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）質量分析法（MS）は、そのような決定のために使用することができ、その主要な利点は、塩、界面活性剤および汚染に対する耐性である。ここでは、MALDI-MSによって100kDaのより大きなタンパク質の分析のためにアクセス可能なアプローチを示している。...

フライトのマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間（MALDI-TOF）100kDaのより大きなインタクトタンパク質の質量分析

学ぶDINeC法による質量分析で、SO₂クラスターを用いてペプチドやタンパク質などの生体分子を軟脱着イオン化し、表面の微細な化学変化をリアルタイムで検出する手法です。

クラスターによる脱着/イオン化質量分析による、表面上の複雑分子とその反応の解析

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